Ölçme Mekansal ve zamansal Ca Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51945

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Xiaohong Zhu¹, Aaron Taylor², Shenyu Zhang¹, Dayong Zhang^1,3, Ying Feng^1,4, Gaimei Liang^1,5, Jian-Kang Zhu^1,6

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

Ca ^{2 +} sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda ²⁺ sinyaller.

Abstract

Gelişimsel ve çevresel ipuçları ca bitki hücrelerinde ²⁺ dalgalanmaları. Stimulus özgü mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} desenler ^Ca +2 sinyal kaskadlarını başlatmak hücresel ^Ca +2 bağlayıcı proteinler tarafından algılanır. Ancak, biz yine de belirli Ca ^{2 +} sinyalleri üretilir uyaran nasıl hakkında biraz biliyorum. Ca ^{2 +} sinyalinin özgünlüğü belirli bir uyarana cevap Ca ^{2 +} kanalları ve / veya taşıyıcıların faaliyetlerinin sofistike regülasyonuna bağlı olabilir. Bu hücresel bileşenlerini belirlemek ve onların işlevlerini anlamak için, doku ve hücresel düzeydeki Ca ^{2 +} sinyalleri hassas ve sağlam kayıt izin sistemleri kullanmak çok önemlidir. Farklı hücre bölmeleri hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri hücresel Ca ^{2 +} sinyalleri canlı hücre konfokal görüntüleme için bir platform sağladı. Burada talimat tarifİki Ca ^{2 +} algılama sistemlerinin kullanımı için s: FAS (film yapıştırıcı fidanları) ışıldama Ca ^{2 +} görüntüleme ve case12 tabanlı canlı hücre konfokal floresan Ca ^{2 +} görüntüleme bazlı Aequorin. Case12 kullanarak canlı hücre konfokal görüntüleme yüksek çözünürlükte sitozolik ve nükleer Ca ^{2 +} sinyalleri aynı anda taranmasını sağlayan ise FAS sistemini kullanarak Lüminesans görüntüleme, doku seviyesinde mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} sinyalleri basit, sağlam ve duyarlı bir algılama sağlar.

Introduction

Bitki hücresi, hücre hareketlerini koordine sinyalizasyonu ile çevreye göre. Çevresel uyarılara tepki olarak sinyal olayını erken hücre, bir geçici Ca ^{2 +} artıştır. Serbest Ca2 ⁺ konsantrasyonu içindeki desen ya da geçici bir artış imzası, genliği, sıklığı ve süresi ile karakterize edilir. Farklı uzay-zamansal Ca ^{2 +} imzalar farklı hücresel aktiviteler ¹ düzenler. Sıcak, soğuk, tuz, kuraklık, ışık, veya bitki hormonları gibi belirli uyaranlara, ince ayar olabilir membran lokalize Ca ^{2 +} kanalları ve / veya taşıyıcıların uzay-zamansal etkinliği, belirli Ca ^{2 +} imzalar sonuçlanır. Ca ^{2 +} taşıyıcıları, iyi karakterize edilmiş olmasına rağmen, küçük bitkilerde ¹ Ca ^{2 +} kanalları moleküler kimlikleri ve işlevleri hakkında bilinmektedir. Uyaranlara stres değiştirilmiş Ca ^{2 +} tepki ile mutantlar için genetik ekranlar etkili olabilir yaklCa ^{2 +} imzaları oluşturan bileşenleri belirlemek için oach. Son zamanlarda birçok Aequorin göre ^Ca +2 algılama sistemleri patojen saldırısı ve abiyotik stres ^2-4 yanıt bileşenleri sinyalizasyon ^{2 +} Ca genetik ekranlar kolaylaştırmak geliştirilmiştir.

Aequorin ilk 1990'ların başında ⁵ CA bitkilerde ²⁺ sinyalleri algılamak için kullanıldı. O zamandan beri, Aequorin ^Ca-2 belirli bir hücre izlemek için kök ⁸ tonoplast sitoplazma ^{5, 6} çekirdeği, kloroplastlar ^{7, 9} mitokondri ve stroma ^10, yanı sıra farklı hücre tipleri gibi farklı hücresel bölümlerin, hedeflendi ⁺ sinyalleri ^11. Aequorin tabanlı Ca ^{2 +} ölçümleri uyaranlara stres hücrelerin bir nüfusun mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} tepkilerini ortaya çıkarmak. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek hücreler Ca ^{2 +} tepkileri vardır unsynchroniyanıt doku ⁴ zed. Bu nedenle, Aequorin Ca ^{2 +} kayıt mutlaka bireysel hücrelerin Ca ^{2 +} sinyalini bildirmiyor. Son yıllarda, genetik olarak kodlanmış floresan proteini (FP), yüksek çözünürlüğe sahip hücre içi ^{Ca2 +} sinyali incelemek için kullanılmıştır, CA böyle sarı cameleon (YÇS) ¹² ve ¹³ olarak CASEs12 ^{2 +} göstergelerini tabanlı. YÇS flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) CFP ihtiva eden Ca2 ⁺ göstergeleri tabanlı ve YFP proteini kalmodulin ve kalmodulin-bağlanma peptidi M13 etmeye dayanır ^{2 +} Ca ile bağlantılı varyantları bulunmaktadır. ^Ca2 bağlanan kalmodülin olarak bu şekilde daha yüksek enerji transferi (FRET geliştirilmiş) ile sonuçlanan, birbirine CFP ve YFP getiren, yapısal bir değişiklik olur. CFP sinyal yoğunluklarının için YFP oranı olarak yaklaşık olarak hesaplanan zaman, FRET düzeyi, hücre içi Ca2 ⁺ dinamiklerini göstermektedir. Çeşitli SK versiyonları tesislerinde kullanılmaktadır. YC3.6 t oldusitozolde ^14,15, çekirdeğin ^16, mitokondri ¹⁷ ve plazma zarı ¹⁸ ve YC4.6 ve D4ER için argeted ER ^15,19 hedefleyen edildi ve D3cpv proksisomlara ²⁰ hedeflenmiştir. YÇS sentezleyen transgenik bitkiler, farklı hücre tiplerinin farklı hücresel bölmeleri içinde Ca ^{2 +} dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme sağlar. DAVALAR (muhtemelen Ca lcium se Nsor) bir kalmodulin ve kalmoduline bağlayıcı peptid M13 barındıran tek dairesel sırası büyük floresan proteinleri (cpFPs) vardır. Ca ^{2 +} bağlanma üzerine, olgu floresan yoğunluğundaki bir artışa yol açan, konformasyonel değişiklikler yapılabilir. Kasanın floresan tepkisi ve ^Ca +2 konsantrasyonu arasında korelasyon hücre içi Ca ^{+ 2} dinamikleri kantitatif olarak ölçüldü sağlar. Case12 varyant 12 kat Ca ^{2 +} -saturated formları floresan artmıştır. N benthiminana bitkilerin geçici olarak İfadeessing Case12 veya stabil bir şekilde eksprese eden Örneği 12 Arabidopsis bitkileri koruma ve abiyotik stres ^4,21 Ca ² sinyalini incelemek için kullanılmıştır. , Veya dehidrasyon strese patojen saldırısına yanıt hücrelerinde asenkron mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} salınımlar Case12 göre Ca ^{2 +} görüntüleme ile ortaya konmuştur.

Burada, Arabidopsis fide ²⁺ dinamikleri Ca özel ve sitozolik konfokal görüntüleme ve nükleer Ca mendil ve uyaranlara Aequorin göre lüminesans görüntülemesi için ayrıntılı talimatlar sunmak FAS Vaka 12. Lüminesans görüntüleme ifade Arabidopsis kök hücrelerinde ²⁺ dinamikleri bozulmamış bitki ya da burada açıklanmayan dokularda stres ile indüklenen Ca2 ⁺ dinamiklerini analiz etmek için ya da ^{2 +} sinyaller Ca etkisiyle değişmiş stres mutantlar için mutajenize bitki popülasyonlarını Arabidopsis taranması için adapte edilebilir. Canlı hücre Ca ^{2 +} görüntüleme kurulum Ca analiz adapte olabilirCa ^{2 +} Diğer göstergeler kullanılarak farklı bölmeler içinde subcelluar veya farklı hücre tiplerinde 2 + dinamiği.

Protocol

FAS Sistemini Kullanma 1. Aequorin Tabanlı Ca ² Görüntüleme

1. Lüminesans görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton-100 içeren% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile Aequorini Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS (Murashige ve Skoog temel tuz karışımı),% 1 sükroz ve% 1.2 agar içeren bir kare plaka (ızgara ile 10 x 10 cm kare Petri kabı,) hakkında steril tohum ekmek. Dikey olarak 2 gün boyunca 4 ° C'de (Şekil 1A) tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde yer plakalar.
2. Bir film üzerine fidan aktarın. Plaka üzerinde büyüyen 7-10 günlük fidelerin üzerine bir yapışkan film (Şekil 1B) yerleştirin. Yavaşça fidan filmin (Şekil 1C) uygun olmasını sağlamak için elle filmi itin. Fideler filme bağlanmış kalacak, böylece yavaşça filmin sıyrılması (Şekil 1D ve 1E)
3. Cofactor, fide inkübe edin. A yerleştiriniçeren kare plaka (10 x 10 cm) üzerine dhered fide 2 ug, 15 ml / ml sa-CTZ su (coelenterazine). Gece boyunca (Şekil 1F), 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe fide.
4. Lüminesans görüntüleme için hazırlayın. Iki parça oluşturan, h-CTZ çözeltiden filmi çıkarın ve orta aşağı kesti. Fideler iki farklı plakalarda yüz ile filmin her parça yerleştirin. 5 dakika boyunca karanlıkta plakaları bırakın.
5. Lüminesans görüntü kazanır. Karanlıkta, aşağıdaki lüminesans görüntüleme sistemi (Şekil 1G) evresine üzerinde birbirine iki tabak yerleştirin. Hemen eş zamanlı olarak plakalara uyaranlara çözeltisi 20 ml ilave edilmesiyle görüntüler elde.
6. Lüminesans görüntüleri analiz. Tüm ışıldama görüntüler için aynı görüntü aralığını seçin. Faiz (ROI) bölgesini kırpın ve JPEG dosyaları (Şekil 2A) olarak görüntüler oluşturmak. Alternatif olarak, SPE olarak formatındaki dosyalar görüntüleri dışa ve içe aktardıktanİmageJ görüntü analizi yazılımı. ROI ortalama gri değerinin hesaplanmasında ayarlama ölçümleri. ROI alanının aynı boyutunu seçin ve çubuk grafikler (Şekil 2B) olarak ortalama gri ve mevcut verileri ölçmek.

2. Canlı Hücre Eşodaklı Ca ² Görüntüleme

1. Konfokal görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton ihtiva eden% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile case12 Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS tuzları,% 1 sükroz ve% 1.2 agar ihtiva eden bir plaka üzerinde steril tohum ekmek. 2 gün boyunca 4 ° C'de tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde dikey olarak yer plakalar.
2. Kurulum Görüntüleme Chambers
   1. Bir slayt ve lamel (Chamber A) kullanarak bir görüntüleme odasının birleştirin. Slayt ortasında üzerine su batırılmış pamuk parçası yerleştirin. Daha sonra su ile ıslatılmış pamuk üst plaka üzerine bir ya da iki 5 günlük fidan aktarın. Bir lamel, An her köşesine kil küçük parçalar sopalamel ve slayt arasındaki boşluğu (hazne) (Şekil 3A, sol panel) oluşturmak için fidan üstüne d yer lamel. Bir tane 1 ml'lik şırınga polietilen tüp (0.58 mm çapında) bir ucunu ve bölmenin hemen bitişik borunun diğer ucuna yerleştirin. Bant (Şekil 3A, sağ panel) ile yerine boru tutun.
   2. Pleksiglas odasını (Karain B) kullanılarak bir görüntüleme odasının birleştirin.
      1. Pleksiglas odasının her tarafında kanallar içine kaplanmış tüpler iki polietilen borular (0.58 mm çap) etrafında silikon gres ince bir tabaka yayıldı ve basın (Şekil 3B paneli bıraktı). Tüp oluklar içeren haznenin yüzeyi üzerine silikon ince bir yağ tabakası yayıldı ve hazne ağzı (kesilmiş) bir tarafını kapatmak için yağ içine bir lamel basın.
      2. Odasına plakasından beş günlük fidelerden aktarın ve üst o su ile ıslatılmış pamuk parçası yerleştirinfide f. Odanın diğer yüzeyine silikon gres yayıldı ve mühür üstünde başka bir lamel basın. Bir tane 1 ml'lik şırınga tüplerin biri ucunu. Başka boru açık (Şekil 3B sağ panel) ucunu bırakın.
   3. Bir odacıklı cam kapak (Chamber C) kullanarak bir görüntüleme odası hazırlayın. % 70 etanol ile odacıklı cam kapak Sterilize ve kuru kadar kaput üzerinde bırakın. 0.6 ml veya, sırasıyla, bir 2-çukurlu odanın havuzlarında veya bir 8-çukurlu odasına (Şekil 3C sağ panel),% 1 sükroz ve% 0.5 Phytagel içeren tam kuvvet MS ortamı, 0.2 ml ekleyin. Sterilize tohumlar ve berrak bir jel ince bir tabakasını ihtiva eden bölmeli bir kapak camı doğrudan tohum ekmek ve bunları 5 gün boyunca (Şekil 3C) için dikey olarak büyümesine izin.
3. Konfokal mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. , Buz col yavaş yavaş 150 mM NaCl yaklaşık 200 ul enjekte, tuz, soğuk ya da peroksit gibi stres uyaranları, uygulamak içinhemen önce sırasıyla görüntü almak ya da hafifçe 2 veya 8-çukurlu bölmenin oyuğuna uyarıcı çözeltisi 500 ul veya 100 ul için bölme (Oda A veya B) içine akar, su ya da 1mM _{H2O 2} çözeltisi . Yakalama görüntüleri hemen 20X su daldırma lens (Sayısal açıklık 0.75) ile ters Nikon A1R odaklı lazer tarama mikroskobu kullanarak uyaran çözümü uyguladıktan sonra. Sırasıyla 550 nm, ve 512 x 512 piksel çözünürlükte - 488 nm ve 500 uyarma ve emisyon dalga boyları ile 4 sn aralıklarla görüntüleri bir zaman serisi toplayın.
4. Görüntü Analizi
   Nikon Elements kullanarak, ROI'ler ilgi her hücrenin (veya alan) etrafında çizildi. Her ROI içerisindeki toplam yoğunluğu Zaman Ölçümü iletişim kutusunu (İmageJ yerine kullanılabilir) kullanılarak zamanla ölçüldü. Toplam yoğunluğu ölçümleri ihraç ve DataGraph işlenmiştir. Ca ^{2 +} başak genlik inci gibi piklerinde eksi istirahat şiddeti, süresi olarak tanımlandıİki sivri bitişik başak zirveleri arasındaki zaman aralığı olarak başlatılması ve bir başak tamamlanması ve dönem arasında e saati. -test aracı karşılaştırmak için kullanıldı; t.

Representative Results

Mannitol, NaCI ve _{H2O 2,} sırasıyla, kurutma, tuz ve oksidatif stres uyarıcılar temsil etmek üzere kullanılmıştır. Ağır metal iyonu Cu2 ^+, bu üç stres uyaranları herhangi biri ile sinerji içinde kontrol etmek için, Cu2 ⁺ varlığında ya da yokluğunda her bir uyarana Ca ^{2 +} tepkiyi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, FASB lüminesans görüntüleme Arabidopsis fide dehidrasyon, tuz ve oksidatif stres farklı tepki ortaya koymuştur. 1 mM _{H2O 2} indüklerken, bu çalışmada incelenen uyarıcıların bir konsantrasyonu için, 75 mM NaCI, maruz kalma (Şekil 2A orta panel ve Şekil 2B) ilk 40 sn boyunca yapraklar ve köklerde bulgulanmamıştır güçlü Ca2 ⁺ cevabı başlatma birinci ve ikinci 40 sn (Şekil 2A sağ panel) sırasında yapraklar ve köklerde bulgulanmamıştır hem de güçlü bir Ca2 ⁺ cevabı. 400 mM mannit çözeltisi tek indüklenenİkinci 40 sn boyunca yapraklarda ilk 40'lı ve çok zayıf sinyaller esnasında köklerin Ca ² yanıt. Cu güçlü genlik ve NaCl ve mannitol (Şekil 2A sol panel) tarafından tetiklenen Ca ^{2 +} sinyallerin süresini gelişmiş ^2+. Bu Cu ^{2 +} H Ca genlik ve süresini (Şekil 2A sağ panel ve 2B) de azaltarak ²⁺ sinyalleri, uyarılan ₂ O ₂ inhibitör etkilere sahip olduğu görünür.

Case12 Arabidopsis bitkileri kullanarak, biz aynı anda Ca ^{2 +} sitosolde dinamikleri ve çekirdeği ölçülmüştür. Case12 molekül ağırlığı Case12 eksprese eden transjenik bitkiler, bu nedenle, her iki GFP sitosolde sinyaller ve yaprak çekirdek ve kök hücreleri (Şekil 4A) sahip, 46 kDa arasındadır. Özelleştirilmiş (Şekil 3A ve 3B) veya ticari odalar (Şekil 3C), bir canlı hücre confocal görüntüleme için kullanıldımikroskop. Bu bölme içindeki fide için 150 mM NaCl uygulanması biz sitosol ve tek tek hücreler (bir ek Film 1 Şekil 4B ve C) 'nin çekirdeğine hem de floresan yoğunluğunun bir değişiklik gözlenmedi. NIS-Elements (Görüntüleme yazılımını, Nikon Instruments Inc) kullanarak, zamanla ilgi alanları (ROI) bölgelerinde floresan yoğunluğu ölçüldü. Genlik, süre ve sitozolik ve nükleer Ca ^{2 +} titreşim frekansı Şekil 4B grafiksel sunulmaktadır. ^{2 +} sitoplazmada sivri ve çekirdekler aynı kök hücreleri arasında yanı sıra farklı kök hücreler arasında büyük farklılık Ca genlik ve süresi. Sitozolik Ca ^{2 +} sivri genlik ve süresi sırasıyla, 60.36 ± 45.22 AU (keyfi birim) ve 58.24 ± 15.70 sn idi. Nükleer Ca ^{2 +} sivri genlik ve süresi sırasıyla, 316,26 ± 75,24 (AU) ve 61.71 ± 16.31 sn idi. Buna karşılık,sitozolik ve nükleer Ca ^{2 +} sivri süresi sırasıyla 17.43 ± 3.67 sn ve 17.33 ± 2 sn idi hücreleri arasında benzerdi. Odak düzlemi ve / veya yanıt kaybı değişiklikten dolayı olabilir ²⁺ sivri zamanla azaldığını Ca genlik, çünkü in vitro koşullarda olumsuz uyaranlar stres. Bu sonuçlar tuz stresi sitoplazma ve çekirdek hem de ^Ca +2 salınımını tetikler olduğunu göstermektedir.

Şekil 1. Aequorin uyaranlara strese yanıt olarak mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} dinamiklerini ölçmek için FAS sistemine dayalı. A), MS ortamı. B'yi içeren bir plaka dikey olarak, Arabidopsis fide Büyüme, C), fidan en (° C). D, E) bir yapışkan film (B), koyun F) G) orta aşağı filmi kes. 4 saat boyunca suyun h-CTZ 2 ug / ml, filme yapıştırılmış fidan inkübe ve farklı Her parçayı yerleştirin boş bir levha. 5 dakika boyunca karanlıkta plakaları bırakın. Aynı anda kontrol ve uyaranlara çözümleri (fideler tamamen kapalı olduğundan emin olun), ve hemen görüntüler elde uygulayın. Ölçek çubuğu 5 cm.

Mekânsal-zamansal Ca Şekil 2. karşılaştırılması ²⁺ farklı stres uyaranları 10 günlük fidelerin tepki. 400 mM mannit ve 400 mM mannit artı 1 mM CuCl ₂ (A, sol panel), 75 mM NaCI ve 75 mM NaCI artı 1 mM CuCl tabi fide görüntülerin parlaklık A) zaman serisi2 (A, orta panel) ve 1 mM H ₂ O ₂ veya 1 mM H ₂ O ₂ artı 1 mM CuCI ₂ (A, sağ panel). A Üst ve alt paneller sırasıyla ilk 40 sn ve ikinci 40 sn sırasında edinilen lüminesans görüntülerdir. Bir yoğunluk skala çubuğu yüksek (beyaz) düşük (siyah) lüminesan sinyalleri bir artış sağlandı. B) belirtilen gerilme uyarıcıya tepki olarak fidelerin ortalama parlaklık yoğunluğunun çubuk grafiği gösterir.

Canlı bir hücre konfokal görüntüleme deney 3. Kurulum Şekil. A) özelleştirilmiş odası kil ve pamuk dört adet slayt, lamel ile inşa edilmiştir. İki 5 günlük fidelerin lam üzerine yerleştirilir. , Bir polietilen borunun bir ucu monte odasına yanına yerleştirilir ve sabitlenirdiğer ucu pleksiglas ile yapılan bir 1 ml'lik şırınga. B) özel bir sürgüye bağlı olduğu bandın bir adet orta ve kanalın her iki tarafına da bağlı iki kanala açık bir bölüme sahip değildir. Bir lamel sürgünün üst üste yerleştirilir ve iki polietilen boru kanalı yerleştirilir. Lamel ve tüpler silikon gres ile pozisyonda sabitlenir. Tüplerin biri ucu bir 1 ml şırınga ile bağlanır ve başka bir borunun ucu açık kalır. 5 günlük bir fide bölmesi içine yerleştirilir, ve bir coveslip fidenin üzerine konur ve silikon yağı ile kapatılır. Monte odası ile plexigalss slayt mikroskop sahnede yerleştirilir. C) Arabidopsis fidanları MS fitayel% 0.6 ince bir tabaka içeren odacıklı kapak camın sağ sol iki kuyu () veya 8 kuyularda () yetiştirilmektedir medya.

Şekil 4. Sitosolik ve nükleer Ca ^{2 +} tuz strese yanıt olarak salınım. A), Konfokal görüntüler Case12 sitoplazma ve kök hücreleri (sol panel) ve Case12 ifade eden transjenik bitkilerin yaprak hücreleri (sağ panel) çekirdeklerinde ifade edildiğini gösteriyor. Sağ panelde görüntü kloroplastlara kırmızı otofloresansı ve Case12. B yeşil floresan) Tuz Ca ^{2 +} sitosolde salınım (üst panel kaynaklı stres (150 mM NaCl)) ve çekirdekler (alt panel) birleştirilmiş bir görüntü Kök hücreler. Ölçülmüş hücrelerin yerler panelinde sayılarla oklar ile belirtilmiştir.

Discussion

Biz Arabidopsis fidelerinin mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} yanıt kayıt için FAS sistemi göstermiştir. Bu FAS Ca ^{2 +} kayıt sistemi, CA burada sunulmuştur abiyotik stres uyarılara ek olarak çeşitli uyaranlar tarafından tetiklenen ^{2 +} dinamiğini ölçmek için adapte edilebilir bir basit, hassas ve güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu sistemi kullanarak, kolayca bütün bitki düzeyinde doku ya da uyaranlara özgü mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} dinamiklerini karşılaştırabilirsiniz. FAS yüksek hassasiyet, yüksek yoğunluklu stres kullanıldığında hücrelere fiziksel hasarlardan kaynaklanan eserler önlenmesi açısından önemlidir Ca ^{2 +} tepkilerini, kontrolü için düşük yoğunluklu uyarıcının kullanımına izin verir. Farklı fizyolojik aşamalarında fideler belli bir uyarana cevap olarak farklı duyarlılık ve özgüllüğünün sahip olsa, 10 gün yaşlı Arabidopsis fide yedi, doku ya da uyaranlara spesifik Ca ^{2 +} tepki gösterdi. Bu nedenle, biryaklaşık 100 fidan filmin tek parça üzerine yapıştırılır olabilir hangi FAS ölçümlerin verimini artırmak için 7-10 gün eski fidan kullanımı tercih. Birlikte, kolay ve basit bir performans, yüksek hassasiyet ve üretilebilirlik ile, FAS sistem aynı zamanda değiştirilmiş Ca ^{2 +} tepkilerinin EMS mutagenize mutantların taranması için adapte edilebilir. Tarama amaçları için, iyi film üzerine plaka üzerinde büyütüldü ve yapıştırılır düzgün fideleri için çok önemlidir. S-CTZ içeren bir film yapışmış fide dört veya beş saatlik inkübasyon aequorin sulandırma için genellikle yeterlidir. Apoaequorin ve kofaktör reaksiyon oksijen gerektirdiği için delikler ile yapışkan bir film kullanılması tercih edilir. Aynı filmde aslen fidan gruplarını kullanarak doku veya belirli uyaranlara-Ca ^{2 +} yanıtların karşılaştırılması için kritik olduğundan fide ve / veya sulandırma durum fonksiyonel aequorin toplam miktarını etkileyebilecek bir durum. Ne zaman bu requiremeNTS parlaklık tepkisinin fark, doku ya da uyaran spesifik Ca ^{2 +} tepki ile doğru orantılıdır, karşılanır.

Ca ^{2 +} Aequorin sinyallerinin göre ölçüm hücre popülasyonunun oluşan gruplan yansıtmaktadır. Fakat, hücre tipleri ve / veya uyaranlara dokusunun farklı erişilebilirlik heterojen dikkate aequorin sonuçları göre Ca2 ⁺ ölçümleri herhangi bir hücrenin davranışını eşit değildir. Hücresel düzeyde Ca ^{2 +} dinamiklerini anlamak subselüler çözünürlük ile tespit edilebilir bir Ca ^{2 +} göstergesi gerektirir. Floresans proteininin canlı hücre konfokal görüntüleme (FP) Ca ^{2 +} göstergeleri istenilen bir dokuda hücresel çözünürlük hücresel Ca2 ⁺ dinamiklerini kayıt için gelişmiş bir ^Ca +2 tabanlı tarama sistemi sağlar. İşte, canlı hücre konfokal görüntüleme ve FP-tabanlı Ca ^{2 +} göstergeleri kullanarak, biz subsellüler Ca kaydedildi ²⁺ 2 + göstergeleri iki tip farklı özelliklere sahip bitkilerde uygulanmıştır. YÇS ile karşılaştırıldığında, tek GFP tabanlı Ca ^{2 +} göstergesi bazı avantajları vardır: 1. Case12 YFP ve OBP filtre setleri veya birçok varsayımları ve FRET ²² ölçmek için gerekli karmaşık hesaplamaları gerektirmez. Case12 tek uyarılma / emisyon maksimumuna ve kolaylıkla standart GFP filtre seti kullanılarak tespit edilebilir. 2. Case12 fizyolojik pH altında kararlı olan ve nispeten küçük bir proteini (46 kDa) 'dir. Bitkilerde ifade edildiğinde Case12 transjenik bitkiler, aynı zamanda, sitosolik, nükleer Ca ^{2 +} dinamikleri izlemek için kullanılabilir, böylece, hedef olmayan Case12, sitoplazma hem de çekirdek içinde görüntülenir. Bu raportörün bir sakıncası olmayan bir oran ölçer göstergesidir, bu floresan seviyeleri, aynı zamanda, salgılama seviyesi Ca ^{2 +} konsantrasyonu ilişkisizdir etkilenebilir olmasıdırCase12 ve pH derecesi. Bununla birlikte, Case12 aynı deney koşulları altında, farklı genetik geçmişlerde olan malzemeler arasında uzaysal ve zamansal Ca ^{2 +} sitoplazmada dinamikleri ve organellerin karşılaştırma için hücresel Ca2 ⁺ konsantrasyonunu tespit etmek için yeterlidir. Gelecekte, yeni GFP hücresel kayıt için daha iyi göstergeler olabilir ya da Ca ² dinamiklerini subcelluar olabilir, CA Animals gösterdiği GCaMP3 ²⁴ ve GCaMP5 ²⁵ gibi yüksek sinyal-gürültü oranı, hızlı kinetik ve daha tepki ile ²⁺ göstergeleri göre bitkiler.

Burada tarif edilen ve Aequorin Case12 algılama sistemleri in vivo zararsız sırasıyla bütün tohum ve hücre içi düzeyleri, mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} dinamiklerinin ölçümü için yaklaşımlar sağlar. Her iki sistemde de, fizyolojik durum ya da büyüme koşulları CA'yı fidelerin veya hücrelerin ^{2 +} tepkilerini etkileyebilir. Physica EğerLly iyi bir durumda yetiştirilen hasarlı veya değil, hücreler zayıf hatta hiç Ca ^{2 +} tepkiler olabilir. Buna ek olarak, uzaysal ve zamansal Ca ^{2 +} sinyallerinin zaman süresi de bu ölçümler sırasında fidenin koşullarından etkilenir. Işık yayılması veya floresan sinyalleri zaman içinde bağlı uyarıcı kaynaklı hasarı azaltmak ve / veya konfokal görüntüleme durumunda lazer kaynaklı foto-görmesine neden olabilir. Uyarıcı-sebepli hasarı önlenemez de, fototoksisite: Lazere maruz yoğunluğunu ve / veya frekansını sınırlayarak azaltılabilir. Ayrıca, Aequorin göre Ca ^{2 +} kayıt sistemi bir sulandırma adım gerektirir. Hücre ve / veya CTZ ile apoaequorin tepkimesi CTZ difüzyonunu kesme faktörler Ca2 ⁺ konsantrasyonu ile doğrudan ilişkili parlaklık sinyali etkiler. Bu nedenle CTZ konsantrasyonu yanı sıra, süresi ve kuluçkalama CTZ koşulların en iyi hassasiyet ve reproducibil için optimize edilmiş olması gerekirSığ. Genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri yanlış istenmeyen belirli subselüler bölümlerinde, sıcaklık duyarlılığı veya hücresel Ca2 makine ²³ sinyalizasyon + ile muhabir girişime hedefleyen dahil olmak üzere diğer nedenlerle hücresel ^Ca +2 konsantrasyonları bildirebilir. Biz Aequorin veya Case12 sentezleyen bitkiler gibi değişmiş stres toleransı gibi hiçbir belirgin morfolojik veya koşullu fenotiplerini olduğunu bulundu. Bu nedenle bu genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri bitkilerde sinyal ^{Ca2 +} önemli etkileşimler olması olası değildir.

Özetle, biz tüm bitki fidesi ve subselüler düzeydeki mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} sinyalleri ölçmek için burada iki Ca ^{2 +} algılama sistemlerinin kullanımı için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Bu iki sistem, doku (veya hücre tipi) veya uyarılar özgü Ca ^{2 +,} yüksek hassasiyet ile dinamik biçimlerini belirlemek için kullanılabilir vetekrarlanabilirlik. Bu yüzden çeşitli çevresel uyaranlara yanıt Ca ² sinyalini altında yatan gen ağları ortaya çıkması için güçlü araçlardır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG