Summary
Sinalização de Ca2 + regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal 2 + sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.
Abstract
Sinais ambientais e de desenvolvimento induzir oscilações de Ca2 + em células de plantas. Espaço-temporais de Ca2 + padrões específicos de estímulo são detectados por proteínas Ca2 + ligação celulares que iniciam Ca2 + cascatas de sinalização. No entanto, ainda sabemos pouco sobre como estímulo sinais de Ca 2 + específico são gerados. A especificidade de um sinal de Ca2 + pode ser atribuído à regulação sofisticados das actividades dos canais de Ca2 + e / ou transportadores, em resposta a um dado estímulo. Para identificar estes componentes celulares e compreender as suas funções, é essencial a utilização de sistemas que permitem a gravação sensível e robusto de sinais de Ca 2 + em ambos os tecidos e níveis celulares. Codificados geneticamente Ca2 indicadores que são direcionados para diferentes compartimentos celulares têm proporcionado uma plataforma para células vivas imagem confocal de celulares Ca2 + sinais. Aqui descrevemos instruçãos para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca 2 +: aequorina baseado FAS (mudas adesivas película luminescência) de Ca2 + e de imagiologia case12 confocal de fluorescência de células vivas com base de Ca2 + de imagem. Imaging luminescência usando o sistema FAS fornece uma detecção simples, robusto e sensível de Ca2 + sinais espaciais e temporais em nível tecidual, enquanto células vivas imagem confocal usando case12 fornece detecção simultânea de citosólica e Ca2 + sinais nucleares em uma resolução alta.
Introduction
A célula de planta responde ao meio ambiente através de sinalização que coordena as acções de células. Um evento de sinalização precoce de células em resposta a estímulos do meio ambiente é um aumento transitório de Ca2 +. O padrão, ou a assinatura de um aumento transitório da concentração de Ca2 + livre é caracterizado pela sua amplitude, frequência e duração. Assinaturas Ca2 + espaço-temporais distintas regular diferentes atividades celulares 1. Estímulos específicos, como o calor, o frio, o sal, a seca, a luz, ou hormônios vegetais, pode ajustar a atividade espaço-temporal localizada à membrana canais de Ca2 + e / ou transportadores, resultando em específicos de Ca2 + assinaturas. Embora os transportadores de Ca2 + têm sido bem caracterizados, pouco é conhecido sobre as identidades molecular e as funções de canais de Ca 2 + em plantas 1. Telas genéticos para os mutantes com alteração de Ca2 + resposta ao estresse pode ser um estímulo eficaz aproxoach para identificar os componentes que compõem Ca2 + assinaturas. Ca2 sistemas de detecção com base recentemente vários Aequorina têm sido desenvolvidos que facilitam telas genéticos para componentes de sinalização de Ca2 + em resposta a ataque patogénico e stress abiótico 2-4.
Aequorina foi usado pela primeira vez para detectar sinais de Ca2 + em plantas no início de 1990 5. Desde então, a Aequorina foi orientada para diferentes compartimentos celulares, tais como o 5 citoplasma, núcleo 6, 7 cloroplastos, tonoplast 8, 9 mitocôndrias, e estroma 10, bem como para diferentes tipos de células na raiz para monitorar célula específica de Ca 2 + sinais 11. Medições de Ca 2 + base de Aequorina revelar o espacial e temporal de Ca2 + resposta de uma população de células ao estresse estímulos. No entanto, na maioria dos casos, as respostas do Ca2 + de células individuais são unsynchronized no tecido respondendo 4. Por conseguinte, a Aequorina Ca2 + gravação não necessariamente comunicar o sinal de Ca2 + em células individuais. Nos últimos anos, a proteína fluorescente geneticamente codificado (FP) à base de Ca2 + de indicadores, tais como cameleon amarelo (YCS) 12 e 13 casos12 têm sido utilizados para estudar a sinalização de Ca2 + com alta resolução subcelular. YCS são fluorescência transferência de energia de ressonância (FRET) à base de Ca 2 + indicadores, contendo PCP e YFP variantes ligadas pela Ca2 + liga�o ao calmodulina proteínas e peptídeos de ligação à calmodulina M13. A calmodulina sofre uma alteração conformacional, uma vez que se liga a Ca 2 +, pondo assim PCP e YFP mais juntos, o que resulta num aumento da transferência de energia (reforçada FRET). O nível de FRET ao longo do tempo, calculada aproximadamente como a razão entre a intensidade do sinal YFP PCP, reflecte intracelular de Ca2 + dinâmica. Várias versões YC têm sido utilizados em plantas. YC3.6 era targeted para o citosol 14,15, núcleo 16, 17 mitocôndrias e membrana plasmática 18, e YC4.6 e D4ER foram direcionados para o ER 15,19, e D3cpv foi direcionada para os peroxissomos 20. Plantas transgênicas expressando YCS permitir a geração de imagens de células vivas de Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumivelmente Ca lcium se nsor) são proteínas simples permuta circular fluorescentes (cpFPs) abrigam uma calmodulina e peptídeos de ligação à calmodulina M13. Após a ligação ao Ca2 +, os casos sofrer alterações conformacionais, que conduz a um aumento da intensidade da fluorescência. A correlação entre a resposta da fluorescência do CASE e concentração de Ca2 + permite intracelular de Ca2 + dinâmica a ser medido quantitativamente. A variante case12 tem 12 vezes maior de fluorescência nas Ca2 + formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expressing case12 ou plantas de Arabidopsis expressando estavelmente Caso 12 foram usados para estudar Ca 2 + sinalização na defesa e abióticos de estresse 4,21. Asynchronous espacial e temporal Ca2 oscilações nas células respondem ao ataque de patógenos, ou ao estresse desidratação foram revelados com base case12 Ca2 + imagem.
Aqui, apresentamos instruções detalhadas para a Aequorina imagem luminescência base de Tecido e estímulos específicos Ca2 dinâmica em plântulas de Arabidopsis, e por imagem confocal de citosólica e Ca 2 + dinâmica nuclear em células das raízes de Arabidopsis que expressam Caso 12 luminescência de imagem de FAS pode ser adaptado para analisar induzidas pelo stress Ca2 dinâmica em plantas ou tecidos intactos não descritos aqui, ou para pesquisar populações de plantas de Arabidopsis mutantes por mutagénese com o stress alterado induzido Ca2 sinais. A configuração da imagem de células vivas de Ca2 + pode ser adaptado para analisar Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos subcelluar ou em diferentes tipos de células utilizando outros indicadores de Ca2 +.
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Protocol
1. Aequorina Based Ca2 + Imagem Usando o Sistema FAS
- Preparar mudas para imagens de luminescência. Esterilizar as sementes de plantas de Arabidopsis expressando a Aequorina com uma solução de lixívia a 10% contendo 0,01% de Triton-100. Semear as sementes estéreis sobre uma placa quadrada (10 x 10 cm quadrados placa de Petri com grade,) contendo força total MS (Murashige e Skoog Basal Mistura de sal), 1% de sacarose, e 1.2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de crescimento, após a estratificação a 4 ° C durante 2 dias (Figura 1A).
- Transferir as plantas para um filme. Coloque uma película adesiva (Figura 1B) na parte superior, de 7-10 dias de idade em crescimento mudas na placa. Com cuidado, empurre o filme à mão para garantir que as mudas aderir ao filme (Figura 1C). Descascar suavemente a película de modo que as plântulas permanece aderida à película (Figura 1D e 1E)
- Incubar as mudas com cofator. Coloque a umdhered mudas para a placa quadrada (10 x 10 cm) contendo 15 ml de 2 ug / ml de h-CTZ (coelenterazina) em água. Incubar as plântulas, à temperatura ambiente durante 4 horas durante a noite (Figura 1F).
- Prepare-se para imagens de luminescência. Pegue o filme fora da solução h-CTZ e cortá-la ao meio, formando duas partes. Coloque cada pedaço de filme com mudas de face para cima em duas placas diferentes. Deixe as placas no escuro por 5 min.
- Adquirir imagens de luminescência. No escuro, colocar as duas placas ao lado do outro na fase do sistema de imagem de luminescência (Figura 1G). Adquirir imagens imediatamente após a adição de 20 ml de solução de estímulos para as placas simultaneamente.
- Analisar imagens de luminescência. Escolha a mesma faixa de exibição para todas as imagens de luminescência. Cortar a região de interesse (ROI) e gerar as imagens como arquivos JPEG (Figura 2A). Alternativamente, exportar as imagens como arquivos de formato SPE e importá-los para oSoftware de análise de imagem ImageJ. Definir medidas para cálculo do valor médio de cinza de ROI. Selecione o mesmo tamanho da área ROI e medir os dados cinza e presentes médios como gráficos de barras (Figura 2B).
2. vivo celular confocal Ca2 + Imagem
- Preparar mudas para imagem confocal. Esterilizar sementes de plantas de Arabidopsis expressando case12 com solução de água sanitária a 10% contendo 0,01% de Triton. Semear as sementes estéreis em uma placa contendo sais MS força integral, 1% de sacarose e 1,2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de crescimento, após a estratificação a 4 ° C durante 2 dias.
- Câmaras de imagem Setup
- Monte uma câmara de imagem usando uma lâmina e lamela (Câmara A). Coloque um pedaço de algodão embebido de água para o meio da lâmina. Em seguida, transferir uma ou duas mudas de cinco dias de idade a partir da placa para o topo da água encharcada algodão. Cole pequenos pedaços de barro para cada canto de uma lamela, umd lugar lamela no topo de mudas de criar um espaço (câmara) entre a lamela e corrediça (Figura 3A, painel esquerdo). Ligar uma extremidade do tubo de polietileno (0,58 mm de diâmetro) para uma seringa de 1 ml e colocar a outra extremidade do tubo imediatamente adjacente à câmara. Segurar o tubo no lugar com fita adesiva (Figura 3A, painel da direita).
- Monte uma câmara de imagem utilizando uma câmara de plexiglass (Câmara B).
- Espalhar uma camada fina de massa de silicone em torno de dois tubos de polietileno (0,58 mm de diâmetro) e pressionar os tubos revestidos para os canais em cada lado da câmara de plexiglass (Figura 3B painel da esquerda). Espalhar uma camada fina de massa de silicone sobre a superfície da câmara que contém as ranhuras do tubo e apertar uma lamela na graxa para vedar um lado da abertura da câmara (cortadas).
- Transferir uma plântula cinco dias de idade a partir da placa para a câmara e colocar um pedaço de algodão embebido em água na parte superior of a muda. Espalhe massa de silicone sobre a outra superfície da câmara, e pressionar outra lamela sobre a selar. Ligar a extremidade de um dos tubos a uma seringa de 1 ml. Deixar a extremidade do outro tubo aberto (painel direito Figura 3B).
- Preparar uma câmara de imagem usando uma tampa de vidro câmaras (Câmara C). Esterilizar o vidro da tampa câmaras com etanol 70% e deixá-la sobre o capô até secar. Adicionar 0,6 ml ou 0,2 ml de força total meio MS contendo 1% de sacarose e 0,5% de phytagel em cada poço de uma câmara de dois poços ou de uma câmara de 8 poços (Figura 3C painel da direita), respectivamente. Esterilizar sementes e semear as sementes diretamente em uma tampa de vidro câmaras contendo uma fina camada de gel transparente e deixá-los crescer verticalmente, durante 5 dias (Figura 3C).
- Adquirir imagens usando um microscópio confocal. Para aplicar estímulos de estresse, tais como sal, frio ou peróxido, lentamente injete cerca de 200 mL de NaCl 150 mM, ice-cold água ou 1 mM de H 2 O 2 a solução para dentro da câmara (Secção A ou B), imediatamente antes da obtenção de imagens, ou adicionar cuidadosamente 500 ul ou 100 ul de solução de estímulo para o poço de uma câmara 2 ou 8 poços, respectivamente . Capturar imagens imediatamente após a aplicação da solução de estímulo usando uma Nikon A1R microscópio confocal de varredura a laser invertido com uma lente de imersão em água 20X (abertura numérica 0,75). Coletar uma série temporal de imagens em intervalos de 4 s com comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 500-550 nm, respectivamente, e com uma resolução de pixel de 512 x 512.
- Análise de Imagem
Usando Nikon Elements, ROIs foram desenhadas ao redor de cada célula (ou área) de interesse. Intensidade total dentro de cada ROI foi medido ao longo do tempo usando a caixa de diálogo Tempo de medição (ImageJ poderia ser usado em vez disso). Total de medições de intensidade foram exportados e processados em DataGraph. Ca2 + spike amplitude foi definida como a intensidade do pico de menos descansando intensidade, duração como the de tempo entre o início ea conclusão de uma espiga, eo período como o intervalo de tempo entre os picos de pico adjacentes de dois picos. teste t foi utilizado para comparar as médias.
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Representative Results
Manitol, NaCl e H 2 O 2 foram usados como proxies para a desidratação, de sal e de estresse oxidativo estímulos, respectivamente. Para verificar se o ião de metal pesado Cu2 + sinergiza com qualquer destes três estímulos de stress, comparou-se a resposta de Ca 2 + a cada estímulo na presença ou ausência de Cu2 +. Como mostrado na Figura 2, o FAS luminescência imagiologia revelou que as plântulas Arabidoposis responderam diferentemente a desidratação, o sal e o stress oxidativo. Para a concentração de estímulos que examinadas neste estudo, NaCl 75 mM induziu a resposta mais forte de Ca2 + em folhas e raízes durante os primeiros 40 segundos de exposição (Figura 2A painel do meio e a Figura 2B), enquanto que 1 mM de H 2 O 2 induzida uma forte resposta de Ca 2 + em ambas as folhas e raízes durante o primeiro e segundo 40 segundos (Figura 2A painel da direita). A solução de 400 mM de manitol induzida somenteCa2 + resposta nas raízes durante os primeiros 40s e sinais muito fracos nas folhas durante o segundo 40 seg. Cu 2 + reforçada fortemente as amplitudes e duração de Ca2 + sinais desencadeados por NaCl e manitol (Figura 2A painel esquerdo). Afigura-se que o Cu 2 + tinham efeitos inibidores sobre a H 2 O 2 de Ca2 + induzida por sinais, reduzindo tanto a amplitude e duração (Figura 2A e 2B painel direito).
Usando case12 plantas de Arabidopsis expressando, medimos Ca2 dinâmica no citoplasma e núcleos simultaneamente. Peso molecular de 46 kDa case12 é, por conseguinte, as plantas transgénicas que expressam GFP case12 têm sinais tanto no citoplasma e núcleo das células da folha e raiz (Figura 4A). Câmaras personalizado (Figura 3A e 3B) ou comerciais (Figura 3C) foram usados para imagens de células vivas com um confocalmicroscópio. Aplicando NaCl 150 mM para a plântula na câmara, foram observadas mudanças de intensidade de fluorescência, tanto no citoplasma e núcleo das células individuais (Figura 4B e C; suplementar Filme 1). Usando o NIS-Elements (software Imaging, Nikon Instruments Inc.), medimos a intensidade de fluorescência em regiões de interesse (ROI) ao longo do tempo. A amplitude, duração e frequência de citosólica e nuclear Ca2 + oscilação são apresentados graficamente na Figura 4B. A amplitude e período de Ca2 + picos no citoplasma e os núcleos variar muito entre as células da mesma raiz, assim como através das células em diferentes raízes. A amplitude e período de Ca2 + citosólico spikes foram 60,36 ± 45,22 UA (unidade arbitrária) e 58,24 ± 15,70 seg, respectivamente. A amplitude e período de Ca2 + nuclear spikes foram 316,26 ± 75,24 (UA) e 61,71 ± 16,31 seg, respectivamente. Em contraste, oduração de Ca2 + picos citosólicas e nucleares foram semelhantes entre as células, que foram 17,43 ± 3,67 sec e 17,33 ± 2 segundos, respectivamente. A amplitude de Ca2 + picos diminuiu ao longo do tempo, o que pode ser devido à alteração do plano focal e / ou uma perda de resposta ao estresse estímulos devido a uma condição desfavorável em vitro. Estes resultados indicam que o stress sal desencadeia Ca2 + oscilação no citoplasma e núcleo.
Figura 1 Aequorina baseado sistema FAS para medir espaço-temporais Ca2 + dinâmica em resposta ao estresse estímulos. A) crescer plântulas de Arabidopsis verticalmente num prato contendo meios de MS. B, C) Colocar uma película adesiva (B) no topo de plântulas (C). D, E) F) Incubar mudas aderidas à película com 2 ug / ml de h-CTZ em água durante 4 horas. G) Cortar o filme no meio e colocar cada peça em um diferente prato vazio. Deixe as placas no escuro por 5 min. Aplicar simultaneamente controlar e soluções de estímulos (não se esqueça que as mudas sejam totalmente cobertos), e adquirir imagens imediatamente. A barra de escala é de 5 cm.
Figura 2 Comparação de Ca 2 + espaço-temporal de resposta de 10 mudas de um dia para diferentes estímulos de estresse. A) Uma série temporal de imagens de luminescência de mudas submetidas a 400 mM de manitol e 400 mM de manitol mais 1 mM CuCl 2 (A, painel esquerdo), NaCl 75 mM e NaCl 75 mM mais 1 CuCl mM2 (A, painel do meio) e 1 mM de H 2 O 2 ou 1 mM de CuCl H 2 O 2, mais 1 a 2 mM (A, painel da direita). Os painéis superior e inferior de A são imagens adquiridas luminescência durante 40 seg primeira e segunda 40 segundos, respectivamente. Uma barra de escala de intensidade indica um aumento dos sinais de luminescência de baixo (preto) a alta (branco). B) Gráfico de barras de intensidade média luminescência de mudas em resposta a estímulos de estresse indicados.
Figura 3 Configuração de uma célula viva experiência de imagem confocal. A) A câmara personalizado é construído com um slide, lamela com quatro pedaços de argila e algodão. Dois cinco dias da germinação são colocados no slide. Uma extremidade de um tubo de polietileno é colocado ao lado da câmara de montado e fixo comum pedaços de fita adesiva enquanto a outra extremidade está ligada a um B) Um slide seringa de 1 ml. personalizado feito com plexiglass tem uma câmara aberta no meio e dois canais que estão ligados aos dois lados do canal. Uma lamela é colocada sobre a parte superior da lâmina e dois tubos de polietileno de são colocados no canal. Lamela e tubos são fixos na posição com graxa de silicone. A extremidade de um dos tubos está ligado a uma seringa de 1 ml e a extremidade de outro tubo, permanece aberta. Um velho mudas de 5 dias é colocada na câmara e um coveslip é colocada sobre a parte superior da plântula e selado com massa de silicone. A corrediça plexigalss com a câmara montada é colocada sobre o palco de microscópio. Plântulas de Arabidopsis C) são cultivadas em dois poços (esquerda) ou de 8 poços (direita) do vidro de cobertura de câmaras contendo uma fina camada de 0,6% de MS em phytagel mídia.
Figura 4 citosólico e Ca 2 + nuclear oscilação em resposta ao estresse salino. A) mostram que as imagens confocais case12 é expressa no citoplasma e núcleo de células de raiz (painel da esquerda) e de células de folhas (painel da direita) de plantas transgénicas que expressam case12. A imagem sobre o painel do lado direito é uma imagem resultante da fusão de autofluorescência vermelho dos cloroplastos e a fluorescência verde de case12. B) A salinidade (NaCl 150 mM) de Ca2 + induzida por oscilação no citossol (painel superior) e os núcleos (painel inferior) de células das raízes. Locais de células medidos estão indicados por setas, com números do painel.
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Discussion
Nós demonstramos um sistema FAS para a gravação do espaço-temporal de Ca2 + resposta de mudas de Arabidopsis. Este FAS Ca2 + sistema de gravação proporciona uma abordagem simples, sensível e robusto, que pode ser adaptado para medir a Ca2 dinâmica desencadeada por estímulos diversos, para além dos estímulos de stress abiótico, que são aqui apresentados. Usando este sistema, podemos facilmente comparar tecido- ou específicos de estímulos espaço-temporais Ca2 + dinâmica a nível geral da planta. A elevada sensibilidade do FAS permite o uso de estímulos de baixa intensidade para examinar respostas de Ca2 +, o que é importante para evitar interferências provocadas por danos físicos para as células quando a tensão de alta intensidade é utilizado. Sete a 10 dias de idade mostrou plântulas de Arabidopsis tecido ou estímulos específicos de Ca2 +-resposta, embora plântulas em diferentes fases fisiológicas diferentes podem ter sensibilidade e especificidade em resposta a um dado estímulo. Por isso, épreferível usar 7-10 dias da germinação de aumentar a taxa de transferência de medições da FAS, em que cerca de 100 mudas poderiam ser cumpridos em um pedaço de filme. Juntamente com fácil e simples execução, de alta sensibilidade e reprodutibilidade, o sistema FAS também pode ser adaptado para o rastreio de mutantes EMS mutagenizadas para respostas de Ca 2 + alterados. Para fins de rastreio, é crucial ter plântulas uniformes que são bem crescidas na placa e aderidas a película. Quatro a cinco horas de incubação das plântulas película aderida com h-CTZ é geralmente suficiente para a reconstituição de aequorina. Utilizando a película adesiva com orifícios é preferível, porque a reacção de apoaequorina e cofactor requer oxigénio. Para a comparação de tecido ou estímulos específicos respostas Ca2 +, usando grupos de mudas originalmente do mesmo filme é fundamental, porque o estado de mudas e / ou a condição de reconstituição pode afetar a quantidade total de aequorin funcional. Quando estes requiremees sejam atendidas, a diferença de resposta luminescência é proporcional à tecido- ou específicas de estímulo Ca2 + resposta.
Aequorina medição de sinais baseado Ca2 reflectem a resposta de uma população de células. No entanto, tendo em conta a heterogeneidade de tipos de células e / ou a acessibilidade diferente de células nos tecidos para os estímulos, os resultados de Aequorina base de Ca2 + medições não ser igual ao comportamento de qualquer célula. Compreender Ca2 dinâmica a nível celular requer um 2 + Ca indicador que pode ser detectada com resolução subcelular. Célula de imagem confocal ao vivo da proteína de fluorescência (FP) à base de Ca2 + indicadores fornece uma Ca2 + sistema de detecção avançada para gravação de celulares de Ca2 + com resolução dinâmica celular em um tecido desejado. Aqui, utilizando células vivas imagem confocal e baseados em FP Ca2 + indicadores, registramos subcelular de Ca2 + 2 + têm sido implementadas em plantas com características diferentes. Comparado a YCS, único indicador com base em GFP Ca2 + tem algumas vantagens: 1 case12 não requer YFP e PCP conjuntos de filtros ou os muitos pressupostos e cálculos complexos necessários para medir FRET 22. Case12 tem única excitação / máximos de emissão e pode ser facilmente detectada através de conjunto de filtros GFP padrão. 2. case12 é estável em pH fisiológico, e é relativamente pequena de proteína (46 kDa). Quando expressa em plantas, case12 não específico aparece no citoplasma bem como os núcleos, de modo que as plantas transgénicas case12 pode ser utilizado para rastrear citosólicos e nucleares de Ca 2 + simultaneamente dinâmica. Um inconveniente deste repórter é que é um indicador não radiométrica, para que os níveis de fluorescência também são afectados por factores que não estão relacionados com a concentração de Ca2 +, tais como o nível de expressãoCase12 e pH local. No entanto, case12 é suficiente para determinar a concentração de Ca2 + celular de comparação de espaço-temporais Ca2 + dinâmica no citoplasma e organelas entre materiais com diferentes origens genéticas nas mesmas condições experimentais. No futuro, a nova base de Ca2 + GFP indicadores com maior relação sinal-ruído, cinética rápida e maior resposta, como GCaMP3 24 e 25 GCaMP5 demonstrado em animais, podem ser melhores indicadores para a gravação de celular ou subcelluar Ca2 dinâmica em plantas.
Os sistemas de detecção de Aequorina e case12 aqui descritos fornecem não destrutiva in vivo abordagens para a medição do espaço-temporais Ca2 + dinâmica em toda a muda e níveis subcelulares, respectivamente. Em ambos os sistemas, as condições fisiológicas de crescimento de estado ou pode afectar a resposta de Ca 2 + as mudas ou células. Se physically danificado ou não crescido em bom estado, as células poderiam ter fracos ou mesmo sem Ca2 + respostas. Além disso, a duração de espaciais e temporais de Ca2 + sinais também são afectadas pelas condições da muda durante as medições. Os sinais de fluorescência ou de luminescência pode diminuir ao longo do tempo, devido aos danos induzidos por estímulos, e / ou do foto-dano induzido por laser, no caso de imagem confocal. Embora o dano induzido por estímulos não pode ser evitada, fototoxicidade pode ser reduzida por limitação da intensidade e / ou a frequência de exposição ao laser. Além disso, com base Aequorina Ca2 + sistema de gravação requer um passo de reconstituição. Fatores que interrompem a difusão de CTZ para a célula e / ou reação de apoaequorina com CTZ afetaria sinais de luminescência que estão relacionados diretamente a concentração de Ca2 +. Portanto, a concentração de CTZ, bem como a duração e as condições de CTZ incubação precisam ser otimizados para melhor sensibilidade e reproducibildade. Codificados geneticamente Ca2 indicadores podem erroneamente relatar concentrações celulares de Ca2 + por outras razões, incluindo não intencional direcionamento para compartimentos específicos subcelulares, sensibilidade à temperatura, ou interferência do repórter com o Ca2 + celular sinalização máquinas 23. Descobrimos que aequorin ou case12 expressando plantas não têm fenótipos morfológicos ou condicionais óbvios, tais como a tolerância ao estresse alterado. Por isso, é improvável que esses codificados geneticamente Ca2 indicadores têm grandes interferências com sinalização de Ca2 + nas plantas.
Em resumo, apresentamos aqui instruções detalhadas para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca2 + para medir o Ca 2 + espacial e temporal de sinais, tanto todo o mudas de plantas e níveis subcelulares. Estes dois sistemas pode ser utilizado para determinar o tecido (ou tipo de célula) ou Ca 2 + estímulos específicos de padrões dinâmicos com alta sensibilidade ereprodutibilidade. Por isso, eles são ferramentas poderosas para elucidar as redes de genes que são a base Ca 2 + de sinalização em resposta a vários estímulos ambientais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
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