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Biology

Mesure spatiale et temporelle Ca Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51945

Summary

Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca 2 + spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement Ca2 + indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.

Abstract

Les indices de développement de l'environnement et induisent des fluctuations de Ca2 + dans les cellules végétales. spatio-temporelles de Ca2 + modèles spécifiques de stimulation sont détectées par cellulaires Ca2 + protéines de liaison qui initient Ca2 + cascades de signalisation. Cependant, nous en savons encore peu de choses sur la façon dont les signaux de stimulus Ca spécifique sont générés. La spécificité d'un signal de Ca2 + peut être attribuée à la régulation sophistiquées de l'activité des canaux et / ou des transporteurs de Ca en réponse à un stimulus donné. Pour identifier ces composants cellulaires et comprendre leurs fonctions, il est essentiel d'utiliser des systèmes qui permettent un enregistrement sensible et robuste des signaux de Ca à la fois le tissu et niveaux cellulaires. Codés génétiquement Ca2 + indicateurs qui ciblent différents compartiments cellulaires ont fourni une plate-forme pour des cellules vivantes imagerie confocale de cellulaires Ca2 + signaux. Nous décrivons ici l'instructions pour l'utilisation de deux systèmes de Ca2 + de détection: aequorine base (FAS adhésives Les plants de film luminescence) Ca2 + et d'imagerie des cellules vivantes cas12 fluorescence confocal basé imagerie de Ca2 +. imagerie de luminescence en utilisant le système FAS fournit une détection simple, robuste et sensible spatiales et temporelles des signaux Ca2 + au niveau des tissus, tandis que la cellule en direct imagerie confocale en utilisant cas12 permet la détection simultanée de cytosolique de Ca2 + et signaux nucléaires à haute résolution.

Introduction

La cellule de plante répond à l'environnement par l'intermédiaire d'une signalisation qui coordonne les actions cellulaires. Événement de signalisation en réponse à des stimuli de l'environnement d'une cellule début est une augmentation transitoire de Ca2 +. Le modèle, ou la signature d'une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 + libre est caractérisé par son amplitude, la fréquence et la durée. Signatures Ca2 + spatio-temporelles distinctes régissent différentes activités cellulaires 1. Stimuli spécifiques, tels que la chaleur, le froid, le sel, la sécheresse, la lumière, ou des hormones végétales, peuvent affiner l'activité spatio-temporelle de la membrane localisée canaux Ca2 + et / ou transporteurs, entraînant spécifiques Ca2 + signatures. Bien que Ca2 + transporteurs ont été bien caractérisés, on sait peu sur l'identité et les fonctions moléculaires des canaux de Ca dans les plantes 1. Écrans génétiques pour les mutants avec altéré Ca2 + réponse au stress stimuli peuvent être une appr efficaceOach pour identifier les composants qui composent Ca de signatures. Ca2 + systèmes de détection récemment fondé plusieurs Aequorin ont été développés qui facilitent écrans génétiques pour Ca2 + composants de signalisation en réponse à l'attaque d'agents pathogènes et stress abiotique 2-4.

A été utilisé pour la première Aequorin pour détecter des signaux Ca2 + dans les usines dans les années 1990 5. Depuis lors, l'aequorine a été ciblée pour différents compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme 5, le noyau 6, les chloroplastes 7, tonoplastique 8, les mitochondries 9, et le stroma 10, ainsi que de différents types de cellules dans la racine de surveiller cellule spécifique Ca 2 + 11 signaux. Les mesures sur la base de Ca de l'aequorine révèlent le Ca2 + réponse spatiale et temporelle d'une population de cellules pour souligner stimuli. Cependant, dans la plupart des cas, les réponses du Ca de cellules individuelles sont unsynchronized dans le tissu de répondre 4. Par conséquent, l'enregistrement de Aequorin Ca ne rend pas nécessairement le signal Ca2 + dans des cellules individuelles. Au cours des dernières années, la protéine fluorescente génétiquement codé (FP) à base de Ca2 + indicateurs, tels que cameleon jaune (centres jeunesse) 12 et 13 cas12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + avec une résolution subcellulaire élevé. Centres jeunesse sont le transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) à base d'indicateurs de Ca2 +, contenant CFP et YFP variants lié par le liant le Ca2 + et calmoduline de la protéine de peptide liant la calmoduline M13. Calmodulin subit un changement de conformation telle qu'elle se lie au Ca2 +, ce qui apporte CFP et YFP rapprocher, ce qui entraîne un transfert d'énergie accrue (FRET accru). Le niveau de FRET avec le temps, plus ou moins calculé comme le rapport de la YFP à la PCP intensités de signal, traduit la dynamique intracellulaire de Ca2 +. Plusieurs versions YC ont été utilisés dans des plantes. YC3.6 était targeted vers le cytosol 14,15, 16 noyau, les mitochondries 17, et la membrane plasmique 18, et YC4.6 et D4ER ont été ciblés à l'urgence 15,19, et D3cpv a été visé aux peroxysomes 20. Les plantes transgéniques exprimant des centres jeunesse permettent l'imagerie des cellules vivantes de Ca2 + dynamique au sein de différents compartiments cellulaires de différents types de cellules. Cas (probablement Ca lcium soi RNDS) sont des protéines simples circulairement permutées fluorescentes (cpFPs) abritant une calmoduline et le peptide liant la calmoduline M13. Lors de la liaison à Ca2 +, les cas sont soumis à des changements de conformation, conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence. La corrélation entre la réponse de fluorescence de la CAS et concentration de Ca2 + intracellulaire de Ca2 + permet dynamique à mesurer quantitativement. La variante cas12 a 12 fois fluorescence accrue dans les Ca2 + formes saturés. N. plantes benthiminana transitoire expresser cas12 ou de plantes d'Arabidopsis exprimant de façon stable Case 12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + dans la défense et stress abiotique 4,21. Asynchrone spatiale et temporelle Ca2 + oscillations dans les cellules répondant à une attaque pathogène, ou au stress de déshydratation ont été révélés avec la société cas12 Ca2 + imagerie.

Ici, nous présentons des instructions détaillées pour Aequorin imagerie de luminescence en fonction de stimuli et tissulaire spécifique Ca2 + dynamique en plants d'Arabidopsis, et pour l'imagerie confocale de cytosolique et nucléaire Ca 2 + dynamique dans les cellules d'Arabidopsis profondes qui expriment Cas 12: Luminescence imagerie du SAF pourrait être adapté pour analyser le stress induit par Ca2 + dynamique dans les plantes ou les tissus ne sont pas décrits ici intacts, ou pour dépister les populations de plantes d'Arabidopsis mutagénisées des mutants avec le stress a induit des troubles de Ca2 + signaux. L'installation d'imagerie Ca 2 + des cellules vivantes pourrait être adapté pour analyser Ca2 + dynamique au sein des différents compartiments de subcelluar ou dans différents types de cellules à l'aide de Ca2 + autres indicateurs.

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Protocol

1. Aequorin Based Ca2 + Imaging Utilisation du système FAS

  1. Préparer les semis pour l'imagerie de luminescence. Stériliser graines de plantes d'Arabidopsis exprimant Aequorin avec une solution d'eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton-100. Semez les graines stériles sur une plaque carrée (10 x 10 cm de plat carré de Pétri avec grille,) contenant la pleine force MS (Murashige et Skoog basale sel Mélange), 1% de saccharose et 1,2% d'agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours (Figure 1A).
  2. Transférer les plants sur un film. Placer un film adhésif (figure 1B) sur la partie supérieure de 7-10 jours de culture des plantes de semis de la plaque. Poussez doucement le film par la main pour s'assurer que les plants adhèrent au film (figure 1C). Retirer le film doucement pour que les plants restent collés au film (figure 1D et 1E)
  3. Incuber les plants avec cofacteur. Placer la unesemis dhered sur la plaque carrée (10 x 10 cm) contenant 15 ml de 2 pg / ml h-CTZ (coelentérazine) dans l'eau. Incuber les plants à la température ambiante pendant 4 heures à une nuit (figure 1F).
  4. Préparez-vous pour l'imagerie de luminescence. Retirer le film de la solution h-CTZ et le couper par le milieu, formant deux pièces. Placez chaque morceau de film avec des plants face vers le haut en deux plaques différentes. Laisser les plaques à l'obscurité pendant 5 min.
  5. Acquérir les images de luminescence. Dans l'obscurité, placer les deux plaques côte à côte sur la scène du système d'imagerie par luminescence (figure 1G). Acquérir des images immédiatement après l'ajout de 20 ml de solution de stimuli à la fois les plaques.
  6. Analyser les images de luminescence. Choisir la même plage d'affichage de toutes les images de luminescence. Recadrage de la région d'intérêt (ROI) et de générer les images que les fichiers JPEG (figure 2A). Sinon, exporter les images sous forme de fichiers au format SPE et les importer dans leImageJ logiciel d'analyse d'image. Mesures établies pour le calcul de la valeur de gris moyen de retour sur investissement. Sélectionnez la même taille de la zone ROI et de mesurer les données de gris et moyennes présents sous forme de graphiques à barres (figure 2B).

2 Live Cell Imaging confocale Ca2 +

  1. Préparer les semis pour l'imagerie confocale. Stériliser graines de plantes d'Arabidopsis exprimant cas12 avec une solution d'eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton. Semez les graines stériles sur une plaque contenant résistance plein sels MS, 1% de saccharose et 1,2% d'agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours.
  2. Chambres d'imagerie de configuration
    1. Assembler une chambre d'imagerie utilisant une lame et lamelle (Chambre A). Placez un morceau de coton imbibé d'eau sur le milieu de la diapositive. Puis transférer un ou deux 5 jours plantules âgées de la plaque sur le dessus de la laine de coton imbibée d'eau. Collez les petits morceaux d'argile à chaque coin d'une lamelle, uned lieu lamelle sur le dessus des plants de créer un espace (chambre) entre la lamelle et toboggan (figure 3A, panneau de gauche). Raccorder une extrémité du tube de polyéthylène (diamètre 0,58 mm) pour une seringue de 1 ml et placer l'autre extrémité du tube immédiatement adjacente à la chambre. Tenir le tube en place avec du ruban adhésif (figure 3A, panneau de droite).
    2. Assembler une chambre d'imagerie utilisant une chambre en plexiglas (Chambre B).
      1. Étendre une mince couche de graisse de silicone autour de deux tubes en polyéthylène (diamètre 0,58 mm) et appuyez sur les tubes revêtus dans les canaux de chaque côté de la chambre de plexiglas (figure 3B gauche panneau). Étendre une mince couche de graisse de silicone sur la surface de la chambre qui contient les rainures du tube et appuyez sur une lamelle dans la graisse pour sceller un côté de l'ouverture de la chambre (découper).
      2. Transférer un vieux semis de cinq jours à partir de la plaque dans la chambre et placer un morceau de coton imbibé d'eau sur le joint hautf le semis. Etaler de la graisse silicone sur l'autre surface de la chambre, et appuyez sur une autre lamelle sur le dessus pour sceller. Connecter l'extrémité de l'un des tubes à une seringue de 1 ml. Laissez la fin de l'autre tube ouvert (panneau de droite figure 3B).
    3. Préparer une chambre d'imagerie utilisant un couvercle en verre chambré (chambre C). Stériliser le couvercle en verre chambré avec 70% d'éthanol et laisser sur le capot jusqu'à ce que sec. Ajouter 0,6 ml ou 0,2 ml de milieu MS de force complet contenant 1% de saccharose et 0,5% phytagel dans chaque puits d'une chambre à 2 ou bien une chambre à 8 puits (Figure 3C panneau de droite), respectivement. Stériliser les semences et semer les graines directement dans un verre de couverture chambré contenant une fine couche de gel transparent et laisser pousser verticalement pendant 5 jours (figure 3C).
  3. Acquérir des images à l'aide d'un microscope confocal. Pour appliquer des stimuli de stress, tels que le sel, le froid ou le peroxyde, injecter lentement environ 200 pi de 150 mM de NaCl, glace-cold eau ou de 1 mM de H 2 O 2 dans la chambre (chambre A ou B) juste avant l'acquisition d'images, ou ajouter doucement 500 ul ou 100 ul d'une solution de stimulation pour le puits d'une chambre 2 ou 8 puits, respectivement . Les images de capture, immédiatement après application de la solution de stimulus en utilisant un Nikon A1R confocal à balayage laser microscope inversé avec un objectif à immersion dans l'eau 20x (ouverture numérique de 0,75). Recueillir une série temporelle d'images à 4 secondes d'intervalle avec excitation et d'émission des longueurs d'onde de 488 nm et de 500 à 550 nm, respectivement, et à une résolution de pixel de 512 x 512.
  4. Analyse de l'image
    L'aide de Nikon éléments, ROI ont été établis autour de chaque cellule (ou région) d'intérêt. L'intensité totale dans chaque ROI a été mesurée au cours du temps en utilisant la boîte de dialogue Mesure du temps (ImageJ pourrait être utilisé à la place). Nombre de mesures d'intensité ont été exportées et traitées dans Datagraph. Pointe l'amplitude Ca a été définie comme l'intensité de pointe moins l'intensité de repos, la durée comme etemps de e entre le début et la fin d'un pic, et la période de l'intervalle de temps entre les pics de pointes adjacentes de deux pointes. -test T a été utilisé pour comparer les moyennes.

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Representative Results

Mannitol, NaCl et H 2 O 2 ont été utilisés comme substituts pour la déshydratation, le sel et le stress oxydatif stimuli, respectivement. Pour vérifier si les ions de métaux lourds Cu 2 + en synergie avec l'une de ces trois stimuli de stress, on a comparé la réponse de Ca2 + à chacune des stimuli de la présence ou de l'absence de Cu 2 +. Comme le montre la Figure 2, le SAF luminescence imagerie a révélé que les plantules Arabidoposis réagissaient différemment à la déshydratation, le sel et le stress oxydatif. Pour la concentration de stimuli que nous avons examinés dans cette étude, 75 mM de NaCl induit la plus forte réponse de Ca2 + dans les feuilles et les racines pendant les 40 premières secondes d'exposition (figure 2A panneau du milieu et la figure 2B), tandis que 1 mM H 2 O 2 induit une forte réponse de Ca2 + à la fois dans les feuilles et les racines pendant les 40 premiers et deuxième sec (figure 2A panneau de droite). La solution de 400 mM mannitol seulement induiteCa2 + réponse dans les racines durant les premières années 40 et des signaux très faibles dans les feuilles au cours de la deuxième 40 sec. Cu 2 + fortement amélioré les amplitudes et la durée de Ca2 + signaux déclenchés par NaCl et mannitol (figure 2A panneau de gauche). Il semble que Cu 2 + a eu des effets inhibiteurs sur H 2 O 2 induite par Ca2 + signaux, ce qui réduit à la fois l'amplitude et la durée (figure 2A et 2B panneau de droite).

Utilisation cas12 plants d'Arabidopsis exprimant, nous avons mesuré la dynamique de Ca2 + dans le cytosol et les noyaux simultanément. Poids moléculaire de cas12 est de 46 kDa, les plantes transgéniques exprimant donc cas12 ont des signaux de GFP, tant dans le cytosol et les noyaux de la feuille et les cellules des racines (figure 4A). Personnalisée (Figure 3a et 3b) ou commerciales chambres (figure 3C) ont été utilisés pour l'imagerie des cellules vivantes avec un confocalmicroscope. L'application de NaCl 150 mM à la plantule dans la chambre, nous avons observé des changements d'intensité de fluorescence à la fois le cytosol et le noyau des cellules individuelles (figure 4B et C; supplémentaire Film 1). Utilisation de NIS-Elements (logiciel d'imagerie, Nikon Instruments Inc.), nous avons mesuré l'intensité de fluorescence dans les régions d'intérêt (ROI) dans le temps. L'amplitude, la durée et la fréquence des cytosolique et nucléaire de Ca2 + oscillation sont présentés graphiquement sur ​​la figure 4B. L'amplitude et la période de Ca 2 + dans le cytoplasme des pointes et les noyaux varient considérablement entre les cellules de la même origine, ainsi que dans les cellules de différentes origines. L'amplitude et la période de Ca2 + cytosolique pointes étaient 60,36 ± 45,22 UA (unité arbitraire) et 58,24 ± 15,70 s, respectivement. L'amplitude et la période de Ca2 + pointes nucléaires étaient 316,26 ± 75,24 (UA) et de 61,71 ± 16,31 s, respectivement. En revanche, l'durée de Ca2 + pointes cytosoliques et nucléaires étaient similaires entre les cellules, qui étaient 17,43 ± 3,67 s et 17,33 ± 2 secondes, respectivement. L'amplitude des pics de Ca2 + ont diminué au cours du temps, ce qui peut être dû au changement de niveau du plan focal et / ou une perte de la réponse au stress en raison de stimuli dans un état ​​défavorable vitro. Ces résultats montrent que le stress salin provoque une oscillation de Ca2 + dans les deux le cytoplasme et le noyau.

Figure 1
Figure 1 Aequorin basée système FAS pour mesurer spatio-temporelles Ca2 + dynamique en réponse au stress stimuli. A) cultiver des plants d'Arabidopsis verticalement sur ​​une plaque contenant du milieu MS. B, C) ​​et un film adhésif (B) sur le dessus de semis (C). D, E) F) incuber les plants ont adhéré au film avec 2 pg / ml de h-CTZ dans l'eau pendant 4 heures. G) Couper le film au milieu et placer chaque morceau dans un autre assiette vide. Laisser les plaques à l'obscurité pendant 5 min. Appliquer un contrôle simultanément et solutions stimuli (être sûr que les plants sont entièrement couverts), et d'acquérir des images immédiatement. La barre d'échelle est de 5 cm.

Figure 2
Figure 2: Comparaison de Ca 2 + spatio-temporelle réponse de 10 plants d'une journée à différents stimuli de stress. A) Une série temporelle d'images de luminescence des plants soumis à 400 mM de mannitol et du mannitol 400 mM plus 1 mM CuCl2 (A, panneau de gauche), NaCl 75 mM et NaCl 75 mM plus 1 mM de CuCl2 (A, panneau du milieu), et 1 mM H 2 O 2 ou 1 mM H 2 O 2 plus 1 mM CuCl 2 (A, panneau de droite). Des panneaux supérieur et inférieur d'une des images de luminescence sont acquises au cours de 40 premières secondes et la seconde 40 secondes, respectivement. Une barre d'échelle d'intensité indique une augmentation de signaux de luminescence de faible (noir) à élevé (blanc). B) Diagramme à barres d'intensité de luminescence moyenne des semis en réponse à des stimuli de stress indiqués.

Figure 3
Figure 3 Configuration d'une expérience d'imagerie confocale de cellules vivantes. A) Une chambre personnalisée est construit avec une lame, la lamelle avec quatre morceaux d'argile et de la laine de coton. Deux vieux plants de 5 jours sont placés sur la diapositive. Une extrémité d'un tube de polyéthylène est placée à côté de la chambre de montée et fixée avecun morceaux de ruban adhésif tandis que l'autre extrémité est reliée à une seringue de 1 ml. B) un coulisseau adapté à base de plexiglas a une chambre ouverte au milieu et deux canaux qui sont reliés aux deux côtés du canal. Une lamelle couvre-objet est placée sur la partie supérieure de la glissière et deux tubes sont placés dans polyethlene le canal. La lamelle et les tubes sont fixés dans la position de la graisse de silicone. L'extrémité de l'un des tubes est relié à une seringue de 1 ml et l'extrémité d'un autre tube reste ouvert. Un plant âgé de 5 jours est placé dans la chambre et un coveslip est placé sur la partie supérieure du jeune plant et scellé avec de la graisse de silicone. La lame de plexigalss avec la chambre assemblé est placé sur la platine du microscope. C) plants d'Arabidopsis sont cultivées dans deux puits (à gauche) ou de 8 puits (à droite) de la lamelle à chambre contenant une couche mince de 0,6% de phytagel dans la SEP médias.

Figure 4 Figure 4 cytosolique et nucléaire de Ca 2 + d'oscillation en réponse à un stress salin. A) Les images confocales montrent que cas12 est exprimée dans le cytoplasme et des noyaux de cellules de la racine (panneau de gauche) et les cellules de la feuille (panneau de droite) de plantes transgéniques exprimant cas12. L'image sur le panneau de droite est une image fusionnée de autofluorescence rouge des chloroplastes et la fluorescence verte de cas12. B) au stress salin (NaCl 150 mM) induit Ca2 + oscillation dans le cytosol (panneau supérieur) et des noyaux (panneau inférieur) de cellules de la racine. Emplacements des cellules de mesure sont indiquées par des flèches avec des numéros sur le panneau.

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Discussion

Nous avons démontré un système FAS pour l'enregistrement de la spatio-temporelle Ca2 + réponse des plants d'Arabidopsis. Cette 2+ système d'enregistrement FAS Ca offre une approche simple, sensible et robuste qui pourrait être adapté pour mesurer Ca2 + dynamique déclenchée par divers stimuli, en plus des stimuli de stress abiotiques qui sont présentés ici. Grâce à ce système, nous pouvons comparer facilement tissulaires ou des stimuli spécifiques spatio-temporelles Ca2 + dynamique au niveau de la plante entière. La sensibilité élevée de FAS permet l'utilisation de stimuli de faible intensité pour l'examen de Ca de réponses, ce qui est important pour éviter les défauts causés par des dommages physiques aux cellules lorsque le stress de haute intensité est utilisée. Sept à dix jours plantules âgées d'Arabidopsis a montré un tissu ou spécifique à des stimuli réponse Ca2 +, bien que des plants à différents stades physiologiques peuvent avoir une sensibilité et une spécificité différente en réponse à un stimulus donné. Par conséquent, il estpréférable d'utiliser 7-10 jours plantules âgées d'augmenter le débit de mesures FAS, dans lequel environ cent plants pourraient être collées sur une feuille de film. Avec la performance facile et simple, haute sensibilité et la reproductibilité, le système FAS pourrait également être adapté pour le criblage de mutants EMS mutagénisées des réponses Ca2 + altérés. Pour des fins de dépistage, il est crucial d'avoir des plants uniformes qui sont bien cultivées sur la plaque et respectées sur le film. Quatre à cinq heures d'incubation de films adhéré semis avec h-CTZ est généralement suffisant pour la reconstitution de l'aequorine. Utilisant le film adhésif avec des trous est préférable car la réaction de apoaequorine et le cofacteur nécessite de l'oxygène. Pour la comparaison d'un tissu ou spécifique à des stimuli de réponses Ca, utilisant des groupes de plants initialement à partir de la même couche est critique car l'état des plantules et / ou la condition de reconstitution peut influer sur la quantité totale de l'aequorine fonctionnel. Lorsque ces requiremnts sont remplies, la différence de réponse de luminescence est proportionnelle à la réponse Ca2 + spécifique de tissu ou stimulus.

Aequorine de mesure des signaux sur la base de Ca reflète la réponse d'une population de cellules. Toutefois, compte tenu de l'hétérogénéité des types de cellules et / ou l'accessibilité des différentes cellules dans les tissus à des stimuli, les résultats de l'aequorine basé mesures de Ca2 + ne correspondent pas à la conduite selon l'une quelconque cellule. Comprendre la dynamique de Ca2 + au niveau cellulaire nécessite un Ca2 + indicateur qui peut être détectée avec une résolution subcellulaire. Direct cellule imagerie confocale de la protéine de fluorescence (FP) à base d'indicateurs de Ca2 + fournit un Ca2 + système de détection avancée pour l'enregistrement cellulaires Ca2 + dynamique avec une résolution cellulaire dans un tissu désiré. Ici, en utilisant des cellules vivantes imagerie confocale et base-FP Ca2 + indicateurs, nous avons enregistré subcellulaire Ca2 + de base de Ca-FP ont été mises en œuvre dans les usines avec des caractéristiques différentes. Par rapport aux centres jeunesse, seul Ca indicateur basé GFP-2 + présente certains avantages: 1 cas12 ne nécessite pas YFP et CFP jeux de filtres ou les nombreuses hypothèses et de calculs complexes nécessaires pour mesurer FRET 22. Cas12 a seule excitation / émission maxima et peut être facilement détectée en utilisant jeu de filtres GFP standard. 2 cas12 est stable à un pH physiologique, et est une protéine relativement petite (46 kDa). Lorsqu'elle est exprimée dans les plantes, cas12 non ciblée dans le cytoplasme apparaît ainsi que le noyau, de sorte cas12 plantes transgéniques peuvent être utilisés pour suivre cytosoliques et nucléaires Ca2 dynamique simultanément. Un inconvénient de ce journaliste, c'est qu'il est un indicateur non-ratiométrique, si les niveaux de fluorescence sont également affectés par des facteurs qui ne sont pas liés à concentration de Ca2 +, tels que le niveau d'expressionEt cas12 pH local. Néanmoins, cas12 est suffisante pour déterminer la concentration de Ca2 + cellulaire pour la comparaison des spatio-temporelle dynamique de Ca2 + dans le cytoplasme et les organites entre des matériaux ayant des antécédents génétiques différentes dans les mêmes conditions expérimentales. Dans l'avenir, le nouveau GFP base Ca2 + indicateurs à plus forte rapport signal-sur-bruit, une cinétique rapide et une plus grande réponse, comme GCaMP3 24 et 25 GCaMP5 démontré chez l'animal, pourrait être de meilleurs indicateurs pour l'enregistrement cellulaire ou subcelluar Ca2 + dans la dynamique plantes.

Les systèmes de détection de l'aequorine et cas12 décrits ici fournissent des approches non destructive in vivo pour la mesure spatio-temporelles de Ca2 + à toute la dynamique des semis et des niveaux sub-cellulaires, respectivement. Dans les deux systèmes, les conditions physiologiques de l'Etat ou de croissance pourraient affecter le Ca2 + réponses des semis ou des cellules. Si physically endommagé ou n'a pas grandi dans un bon état, les cellules pourraient avoir la faiblesse ou même pas de Ca2 + réponses. En outre, la durée de Ca2 + signaux spatiaux et temporels sont également affectées par les conditions de la plantule, pendant les mesures. Les signaux de luminescence ou de fluorescence peuvent diminuer au cours du temps en raison de dommages induits par des stimuli-, et / ou l'induit par laser photo-dommages dans le cas de l'imagerie confocale. Bien que les lésions induites stimulus ne peut être évitée, la phototoxicité peut être réduite en limitant l'intensité et / ou la fréquence de l'exposition au laser. En outre, le Ca2 + système d'enregistrement sur ​​aequorine nécessite une étape de reconstitution. Les facteurs qui interrompent la diffusion de CTZ à la cellule et / ou de réaction avec apoéquorine CTZ affecteraient signaux de luminescence qui sont liés directement à la concentration de Ca2 +. Par conséquent, la concentration de CTZ, ainsi que la durée et les conditions de CTZ incubation doivent être optimisés pour une meilleure sensibilité et reproducibillité. Codés génétiquement Ca2 + indicateurs peuvent signaler à tort cellulaires concentrations de Ca2 + pour d'autres raisons, y compris le ciblage involontaire à compartiments sous-cellulaires spécifiques, sensibilité à la température, ou d'ingérence de la journaliste avec le Ca2 + cellulaire machines 23 signalisation. Nous avons constaté que Aequorin ou cas12 plantes exprimant n'ont pas de phénotypes morphologiques ou conditionnelles évidentes telles que modifiées tolérance au stress. Il est donc peu probable que ces codés génétiquement Ca2 + indicateurs ont d'importantes interférences avec Ca2 + de signalisation chez les végétaux.

En résumé, nous présentons ici des instructions détaillées pour l'utilisation de deux Ca2 + systèmes de détection pour mesurer Ca 2 + spatiale et temporelle des signaux à la fois l'ensemble de la semis des plantes et des niveaux sub-cellulaires. Ces deux systèmes peuvent être utilisés pour déterminer un tissu (ou d'un type cellulaire) ou de Ca 2 + stimuli spécifiques configurations dynamiques avec une sensibilité élevée etreproductibilité. Par conséquent, ils sont des outils puissants pour élucider les réseaux de gènes qui sous-tendent la signalisation Ca2 + en réponse à divers stimuli environnementaux.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish VWR 60872-310
Adhesive film VWR 60941-062
Polyethylene tubing PerkinElmer 9908265
1 ml syringe VWR 53548-000
Silicone grease Beckman 335148
2-well chambered cover glass  Nalge Nunc international 155379
8-well chambered cover glass Nalge Nunc international 155409
Luminescence imaging system Princeton Instruments N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope Nikon Instruments Inc. N/A Nikon A1R 
Imaging software Nikon Instruments Inc. N/A Nikon Elements 
DataGraph Visual Data Tools Inc N/A DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine NanoLight Technolgies #301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach Any local store N/A
Triton X-100 Fisher BP151500
MS salt Phytotechnology Labs M524-50L
Sucrose VWR BDH8029-12KG
Agar Sigma A1296-5KG
Phytagel Sigma P8169-1KG

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References

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Zhu, X., Taylor, A., Zhang, S., Zhang, D., Feng, Y., Liang, G., Zhu, J. K. Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants. J. Vis. Exp. (91), e51945, doi:10.3791/51945 (2014).

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