Summary
Segnalazione Ca 2 + regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale 2+ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca 2 + indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.
Abstract
Spunti di sviluppo e ambientali inducono Ca 2 + fluttuazioni di cellule vegetali. Specifica-Stimolo spazio-temporali Ca 2 + modelli vengono rilevati da Ca 2 + legame proteine cellulari che avviano Ca cascate di segnalazione 2 +. Tuttavia, sappiamo ancora poco su come i segnali di stimolo specifico Ca 2 + sono generati. La specificità di un segnale Ca 2 + può essere attribuito al sofisticato regolamentazione delle attività di Ca 2 + canali e / o trasportatori in risposta ad un dato stimolo. Per identificare questi componenti cellulari e capire le loro funzioni, è fondamentale utilizzare sistemi che permettono una registrazione sensibile e robusto di segnali Ca2 + sia a livello tissutale e cellulare. Geneticamente codificati Ca 2 + indicatori che sono indirizzate ai vari compartimenti cellulari hanno fornito una piattaforma per cellule in vivo confocale di cellulari Ca 2 + segnali. Qui si descrive l'istruziones per l'utilizzo di due sistemi di rilevamento Ca 2 +: aequorina basa FAS (film piantine adesivi) luminescenza Ca 2 + di imaging e case12 a base di cellule dal vivo confocale Ca 2 + imaging. Di imaging luminescenza utilizzando il sistema FAS fornisce un rilevamento semplice, robusta e sensibile spaziali e temporali Ca 2 + segnali a livello dei tessuti, mentre cellule vive di imaging confocale utilizzando Case12 fornisce rilevamento simultaneo di citosoliche e nucleari Ca 2 + segnali ad alta risoluzione.
Introduction
La cellula vegetale risponde all'ambiente via di segnalazione che coordina le azioni delle cellule. Una cella all'inizio di segnalazione evento in risposta a stimoli ambientali è un transitorio aumento di Ca 2 +. Il modello, o la firma di un aumento transitorio della concentrazione di Ca 2 + libero si caratterizza per la sua ampiezza, frequenza e durata. Firme Ca 2 + spazio-temporali distinti regolano diverse attività cellulari 1. Stimoli specifici, come il caldo, il freddo, il sale, la siccità, la luce, o ormoni vegetali, possono ottimizzare l'attività spazio-temporale della membrana localizzata Ca 2 + canali e / o trasportatori, con conseguente specifici Ca 2 + firme. Sebbene Ca 2 + trasportatori sono stati ben caratterizzati, poco si sa circa l'identità molecolare e le funzioni dei canali del Ca 2 + nelle piante 1. Schermi genetici per mutanti con alterata Ca 2 + risposta allo stress stimoli possono essere un efficace approach per identificare i componenti che compongono Ca 2 + firme. Sistemi di rilevamento Ca 2 + Recentemente fonda diversi aequorina sono stati sviluppati che facilitano schermi genetici per Ca 2 + componenti di segnalamento in risposta agli attacchi patogeni e stress abiotici 2-4.
Aequorina è stato utilizzato prima per rilevare Ca 2 + segnali nelle piante nei primi anni 1990 5. Da allora, equorina è stata mirata ai vari compartimenti cellulari, come il citoplasma 5, nucleo 6, 7 cloroplasti, tonoplasto 8, 9 mitocondri, stroma e 10, nonché di differenti tipi cellulari nella radice di monitorare cella specifica Ca 2 + segnali 11. Ca 2 + base aequorina misurazioni rivelano l'spaziale e temporale Ca 2 + risposta di una popolazione di cellule allo stress stimoli. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, il Ca 2 + risposte di cellule singole sono unsynchronized nel tessuto risposta 4. Pertanto, la registrazione aequorina Ca 2 + non necessariamente riporta il segnale Ca 2 + in celle singole. Negli ultimi anni, proteina fluorescente geneticamente codificato (FP) a base di Ca 2 + indicatori, come cameleon giallo (YCS) 12 e CASEs12 13 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + di segnalazione ad alta risoluzione subcellulare. YCS sono fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di Ca 2 + indicatori, contenente PCP e YFP varianti aggiunto dal Ca 2 + -binding proteina calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Calmodulina subisce un cambiamento conformazionale in quanto si lega al Ca 2 +, quindi porta la PCP e YFP più vicini, con conseguente aumento del trasferimento di energia (maggiore FRET). Il livello di FRET nel corso del tempo, calcolato approssimativamente come il rapporto tra YFP per intensità di segnale della PCP, riflette intracellulare Ca 2 + dinamica. Diverse versioni YC sono stati utilizzati negli impianti. YC3.6 era targeted al citosol 14,15, 16 nucleo, mitocondri 17, e la membrana plasmatica 18, e YC4.6 e D4ER sono stati mirati al pronto soccorso 15,19, e D3cpv è stato destinato ai perossisomi 20. Le piante transgeniche esprimenti YCS consentono al live-cell imaging di Ca 2 + dinamiche all'interno di diversi compartimenti cellulari di diversi tipi di cellule. Casi (presumibilmente Ca lcium se nsor) sono singole proteine circolarmente permutati fluorescenti (cpFPs) ospitano una calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Al legame con Ca 2 +, casi subiscono cambiamenti conformazionali, portando ad un aumento di intensità di fluorescenza. La correlazione tra la risposta di fluorescenza del CASE e Ca 2 + permette la concentrazione intracellulare di Ca 2 + dinamiche da misurare quantitativamente. La variante Case12 è 12 volte maggiore fluorescenza nelle Ca 2 + forme -saturated. N. piante benthiminana transitoriamente expressing Case12 o piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente involucro 12 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + Segnalazione di difesa e lo stress abiotici 4,21. Asincrono Ca spaziale e temporale 2+ oscillazioni nelle cellule rispondono agli attacchi patogeni, o per lo stress disidratazione sono stati rivelati con base Case12 Ca 2 + imaging.
Qui, vi presentiamo le istruzioni dettagliate per aequorina basato luminescenza imaging tessuto- e stimoli specifici Ca 2 + dinamiche di piantine di Arabidopsis, e per l'imaging confocale di citosolico e nucleare Ca 2 + dinamiche nelle cellule della radice di Arabidopsis che esprimono, causa 12 Luminescence imaging FAS potrebbe essere adattato per l'analisi di stress-indotta Ca 2 + dinamiche in impianti o tessuti qui non descritti intatti, o per lo screening popolazioni di piante di Arabidopsis mutagenizzate per mutanti con alterata dello stress indotto Ca 2 + segnali. La configurazione Imaging Ca 2 + cellule vive potrebbe essere adattato per analizzare Ca2+ dinamiche all'interno diversi scomparti subcelluar o in diversi tipi di cellule utilizzando altri indicatori di Ca 2 +.
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Protocol
1 aequorina Based Imaging Ca 2 + Uso del sistema FAS
- Preparare piantine per l'imaging luminescenza. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti aequorina con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton-100. Seminare i semi sterili su un piatto quadrato (10 x 10 centimetri piatto quadrato Petri con griglia,) contenenti piena forza MS (Murashige e Skoog basale Sale Miscela), 1% di saccarosio, e il 1,2% agar. Piastre Inserire verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni (Figura 1A).
- Trasferire le piantine su un film. Inserire un film adesivo (Figura 1B) sulla parte superiore del 7-10 giorno piantine che crescono sulla piastra. Spingere delicatamente la pellicola a mano per garantire che le piantine aderiscono alla pellicola (Figura 1C). Sbucciare la pellicola delicatamente in modo che le piantine restano aderito al film (Figura 1D e 1E)
- Incubare le piantine con cofattore. Posizionare l'unapiantine dhered sulla piastra quadrata (10 x 10 cm) contenente 15 ml di 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazine) in acqua. Incubare le piantine a temperatura ambiente per 4 ore a notte (Figura 1F).
- Preparare per l'imaging luminescenza. Prendere la pellicola dalla soluzione h-CTZ e tagliarlo a metà, formando due pezzi. Mettere ogni pezzo di pellicola con piantine a faccia in su in due piatti diversi. Lasciare le piastre al buio per 5 min.
- Acquisire le immagini di luminescenza. Nel buio, posizionare le due piastre accanto all'altro sul palco del sistema di imaging luminescenza (Figura 1G). Acquisire immagini immediatamente dopo l'aggiunta di 20 ml di soluzione di stimoli alle piastre simultaneamente.
- Analizzare le immagini di luminescenza. Scegliere lo stesso intervallo di visualizzazione per tutte le immagini di luminescenza. Ritagliare la regione di interesse (ROI) e generare le immagini come file JPEG (Figura 2A). In alternativa, esportare le immagini come file in formato SPE e importarli nelSoftware di analisi delle immagini ImageJ. Impostare le misure per il calcolo del valore medio grigio di ROI. Selezionare la stessa dimensione di area ROI e misurare i dati di grigi e presentano media come grafici a barre (Figura 2b).
2. cellulare dal vivo confocale Imaging Ca 2 +
- Preparare piantine per l'imaging confocale. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti case12 con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton. Seminare i semi sterili su un piatto contenente sali di resistenza pieno MS, 1% di saccarosio, e 1.2% agar. Inserire piastre verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni.
- Chambers Setup Imaging
- Montare una camera di imaging utilizzando un vetrino e coprioggetto (Sezione A). Posizionare un pezzo di cotone idrofilo imbevuto di acqua sul centro della diapositiva. Poi il trasferimento di uno o due piantine cinque giorni dalla piastra sulla parte superiore di acqua imbevuto cotone. Stick piccoli pezzi di argilla per ogni angolo di un coprioggetto, und coprioggetto posto sulla cima di piantine per creare un gap (camera) tra il vetrino e il vetrino (Figura 3A, pannello di sinistra). Collegare un'estremità del tubo di polietilene (diametro 0,58 millimetri) per una siringa da 1 ml e posizionare l'altra estremità del tubo immediatamente adiacente alla camera. Tenere il tubo in posizione con nastro adesivo (Figura 3A, pannello di destra).
- Montare una camera di imaging utilizzando una camera di plexiglass (Sezione B).
- Stendere un sottile strato di grasso al silicone attorno a due tubi in polietilene (diametro 0,58 millimetri) e premere i tubi rivestiti nei canali su ogni lato della camera di plexiglass (Figura 3B sinistra del pannello). Stendere un velo di grasso al silicone sulla superficie della camera che contiene le scanalature del tubo e premere un coprioggetto nel grasso per sigillare un lato della camera di apertura (tagliate).
- Trasferire una cinque giorni di età piantina dal piatto nella camera e mettere un batuffolo di cotone imbevuto di acqua sulla parte superiore of la piantina. Spalmare grasso al silicone sulla altra superficie della camera, e premere un altro coprioggetto sulla parte superiore per sigillare. Collegare l'estremità di uno dei tubi di una siringa da 1 ml. Lasciare l'estremità dell'altro tubo aperto (Figura 3B pannello di destra).
- Preparare una camera di imaging con una copertura in vetro a camera (Sezione C). Sterilizzare il vetro di copertura camerata con il 70% di etanolo e lasciare sul cofano fino a secco. Aggiungere 0,6 ml o 0,2 ml di MS media resistenza completa contenente 1% di saccarosio e 0,5% phytagel in ciascun pozzetto di una camera 2-bene o una camera da 8 pozzetti (Figura 3C pannello di destra), rispettivamente. Sterilizzare i semi e seminare i semi direttamente in un vetro di copertura camerata contenente un sottile strato di gel trasparente e farli crescere in verticale per 5 giorni (Figura 3C).
- Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale. Per applicare stimoli di stress, come il sale, il freddo o il perossido, iniettare lentamente circa 200 ml di 150 mM NaCl, ice-cold acqua o 1 mM soluzione H 2 O 2 nella camera (Sezione A o B) appena prima di acquisire immagini, o aggiungere lentamente 500 ml o 100 ml di soluzione di stimolo al pozzo di una camera a 2 o 8 pozzetti, rispettivamente, . Catturare immagini subito dopo l'applicazione della soluzione stimolo utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Nikon A1R invertita con un obiettivo 20X immersione in acqua (apertura numerica 0,75). Raccogliere una serie temporale di immagini ad intervalli di 4 sec con eccitazione e di emissione lunghezze d'onda di 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente, e ad una risoluzione in pixel di 512 x 512.
- Image Analysis
Utilizzando Nikon Elementi, ROI, compilati intorno a ciascuna cella (o area) di interesse. Intensità totale all'interno di ogni ROI è stata misurata nel tempo utilizzando la finestra di dialogo Tempo di misura (ImageJ può essere usato al posto). Misure totali intensità sono stati esportati ed elaborati in Datagraph. Ca 2 + ampiezza picco è stata definita come l'intensità di picco meno di riposo intensità, durata come the di tempo tra l'inizio e il completamento di un picco, e il periodo come l'intervallo di tempo tra i picchi picco adiacenti di due punte. t-test è stato utilizzato per confrontare i mezzi.
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Representative Results
Mannitolo, NaCl e H 2 O 2 sono stati utilizzati come proxy per gli stimoli disidratazione, il sale e lo stress ossidativo, rispettivamente. Per controllare se lo ione metallo pesante Cu 2 + sinergia con qualsiasi di questi tre stimoli di stress, abbiamo confrontato il Ca 2 + risposta ad ogni stimolo in presenza o assenza di Cu 2 +. Come mostrato in Figura 2, FAS di imaging luminescenza rivelato che piantine Arabidoposis risposto diversamente a disidratazione, il sale e lo stress ossidativo. Per la concentrazione di stimoli abbiamo esaminato in questo studio, NaCl 75 mM indotto il più forte Ca 2 + risposta in foglie e radici durante i primi 40 secondi di esposizione (Figura 2A pannello centrale e Figura 2B), mentre 1 mm H 2 O 2 indotta una forte risposta Ca 2 + sia in foglie e radici durante il primo e secondo 40 sec (Figura 2A pannello di destra). La soluzione di mannitolo 400 mM indotta soloCa 2 + risposta radici nei primi anni '40 e segnali molto deboli nelle foglie durante la seconda 40 sec. Cu 2 + fortemente valorizzato le ampiezze e la durata di Ca 2 + segnali innescati da NaCl e mannitolo (Figura 2A pannello di sinistra). Sembra che Cu 2 + ha avuto effetti inibitori sulla H 2 O 2 indotta Ca 2 + segnali, riducendo sia l'ampiezza e la durata (Figura 2A e 2B pannello di destra).
Utilizzando Case12 piante esprimere Arabidopsis, abbiamo misurato Ca 2 + dinamica nel citoplasma e nuclei contemporaneamente. Peso molecolare di Case12 è 46 kDa, quindi piante transgeniche esprimenti Case12 hanno segnali GFP sia nel citoplasma e nuclei di foglie e cellule della radice (Figura 4A). Personalizzato (Figura 3A e 3B) o commerciali camere (Figura 3C) sono stati utilizzati per l'imaging cellulare dal vivo con un confocalemicroscopio. Applicando 150 mM NaCl alla piantina della camera, abbiamo osservato cambiamenti di intensità di fluorescenza sia nel citosol e nucleo delle singole celle (Figura 4B e C; Movie supplementare 1). Utilizzando NIS-Elements (software Imaging, Nikon Instruments Inc.), abbiamo misurato l'intensità di fluorescenza in regioni di interesse (ROI) nel corso del tempo. L'ampiezza, la durata e la frequenza della citosolica e nucleare Ca 2 + oscillazioni sono presentati graficamente nella Figura 4B. L'ampiezza e la durata dei picchi di Ca 2 + nel citoplasma e nuclei variano notevolmente tra le cellule della stessa radice, così come attraverso le cellule in diverse radici. L'ampiezza e la durata di Ca 2 + citosolico punte erano 60.36 ± 45.22 AU (unità arbitrarie) e 58.24 ± 15.70 secondi, rispettivamente. L'ampiezza e la durata della nucleari Ca 2 + punte erano 316,26 ± 75,24 (UA) e 61.71 ± 16.31 secondi, rispettivamente. Al contrario, l'durata della citosolici e nucleari Ca 2 + punte erano simili tra le cellule, che erano 17.43 ± 3.67 sec e 17,33 ± 2 sec, rispettivamente. L'ampiezza di Ca 2 + picchi diminuiscono nel tempo, che può essere dovuto alla variazione del piano focale e / o una minore risposta allo stress stimoli a causa di una sfavorevole condizione vitro. Questi risultati dimostrano che lo stress sale innesca Ca 2 + oscillazione sia nel citoplasma e nucleo.
Figura 1 sistema FAS aequorina basa per la misurazione spazio-temporali Ca 2 + dinamiche in risposta allo stress stimoli. A) Grow piantine di Arabidopsis verticalmente su una piastra contenente MS supporti. B, C) Inserire una pellicola adesiva (B) sulla parte superiore di piantine (C). D, E) F) Incubare piantine aderito al film con 2 mg / ml di h-CTZ in acqua per 4 ore. G) Tagliare la pellicola a metà e posizionare ogni pezzo in un diverso piatto vuoto. Lasciare le piastre al buio per 5 min. Applicare il controllo simultaneo e soluzioni di stimoli (accertarsi che le piantine sono interamente coperte), e di acquisire immediatamente le immagini. La barra della scala è di 5 cm.
Figura 2 Confronto di Ca spazio-temporale 2+ risposta di 10 piantine di un giorno a diversi stimoli di stress. A) Una serie temporale di immagini di luminescenza di piantine sottoposte ad mannitolo 400 mM e mannitolo 400 mM e 1 mM CuCl 2 (A, pannello di sinistra), NaCl 75 mM e NaCl 75 mM e 1 mM CuCl2 (A, pannello centrale), e 1 mm H 2 O 2 o 1 mM H CuCl 2 O 2 più 1 mM 2 (A, pannello di destra). Pannelli superiori e inferiori di A sono immagini di luminescenza acquisite durante il primo e secondo 40 sec 40 sec, rispettivamente. Una barra della scala di intensità indica un aumento dei segnali di luminescenza dal basso (nero) a alto (bianco). B) Diagramma di intensità media luminescenza di piantine in risposta agli stimoli di stress indicati.
Figura 3 Configurazione di un esperimento di imaging confocale cellule vive. A) Una camera di misura è costruito con uno scivolo, coprioggetto con quattro pezzi di argilla e cotone idrofilo. Due vecchi semenzali cinque giorni sono immessi sul vetrino. Una estremità di un tubo di polietilene viene posizionato a fianco della camera montato e fissato conun pezzi di nastro mentre l'altra estremità è collegata ad un B) Una diapositiva 1 ml siringa. personalizzato realizzato con plexiglass comprende una camera aperta in mezzo e due canali che sono collegati ai due lati del canale. Una coprioggetto è posto sulla parte superiore della diapositiva e due tubi in polietilene sono posti nel canale. Coprioggetto e tubi sono fissati in posizione con grasso al silicone. La fine di uno dei tubi è collegato ad una siringa da 1 ml e la fine di un altro tubo rimane aperta. A 5 giorni di età piantina viene posto nella camera e un coveslip è messo sulla parte superiore della piantina e sigillata con grasso al silicone. La slitta plexigalss con la camera montata è posto sul palco del microscopio. C) piantine di Arabidopsis sono coltivate in due pozzi (sinistra) o 8 pozzetti (a destra) del vetro di copertura a camera contenente un sottile strato di 0,6% di phytagel nella SM media.
Figura 4 citosolico e Ca 2 + nucleare di oscillazione in risposta a stress salino. A) le immagini confocale mostrano che Case12 è espresso nel citoplasma e nuclei di cellule radicali (pannello di sinistra) e le cellule fogliari (pannello di destra) di piante transgeniche esprimenti Case12. L'immagine sul pannello di destra è un immagine unita di autofluorescenza rosso dei cloroplasti e fluorescenza verde di Case12. B) Sale lo stress (150 mM NaCl) indotta da Ca 2 + oscillazione nel citosol (pannello superiore) e nuclei (pannello inferiore) di cellule della radice. Sedi delle celle di misura vengono indicati da frecce con i numeri sul pannello.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un sistema FAS per la registrazione del spazio-temporale Ca 2 + risposta di piantine di Arabidopsis. Questo 2+ sistema di registrazione FAS Ca offre un approccio semplice, sensibile e robusto che può essere adattato per misurare Ca 2 + dinamiche innescate da vari stimoli, oltre agli stimoli di stress abiotici che vengono presentati qui. Utilizzando questo sistema, siamo in grado di confrontare facilmente tessutale o stimoli specifici spazio-temporali Ca 2 + dinamiche a livello dell'intera pianta. L'elevata sensibilità della FAS consente l'utilizzo di stimoli a bassa intensità per l'esame di Ca 2 + risposte, che è importante per evitare artefatti causati da danni fisici alle cellule quando viene utilizzato lo stress alta intensità. Sette a 10 giorni di età piantine di Arabidopsis ha mostrato tessuto o specifici stimoli-Ca 2 + risposta, anche se piantine a diversi stadi fisiologici possono avere diverse sensibilità e specificità in risposta ad un determinato stimolo. Pertanto èpreferibile utilizzare 7-10 giorni di età piantine per aumentare il throughput di misure FAS, in cui circa 100 piantine potrebbero essere rispettati su un pezzo di pellicola. Insieme con la prestazione facile e semplice, alta sensibilità e riproducibilità, il sistema FAS potrebbe anche essere adattato per lo screening di mutanti EMS mutagenizzate per le risposte Ca 2 + alterati. Ai fini di screening, è fondamentale avere piantine uniformi che sono ben coltivati sul piatto e rispettati sulla pellicola. Quattro o cinque ore di incubazione della pellicola aderito piantine con h-CTZ è di solito sufficiente per la ricostituzione di aequorina. Utilizzando la pellicola adesiva con fori è preferibile perché la reazione di apoaequorin e cofattore richiede ossigeno. Per il confronto di tessuto o di specifici stimoli-Ca 2 + risposte, utilizzando gruppi di piantine originariamente dalla stessa pellicola è fondamentale perché lo stato delle piantine e / o la condizione di ricostituzione può influenzare la quantità totale di aequorina funzionale. Quando questi REQUISITInti sono soddisfatte, la differenza di risposta luminescenza è proporzionale al tessuto-o specifica-stimolo Ca 2 + risposta.
Equorina misurazione basato su segnali di Ca 2 + riflette la risposta di una popolazione di cellule. Tuttavia, considerando l'eterogeneità dei tipi di cellule e / o la diversa accessibilità delle cellule nei tessuti agli stimoli, i risultati di equorina basato Ca 2 + misure non equivale al comportamento di ogni cella. Capire Ca 2 + dinamiche a livello cellulare richiede un Ca 2 + indicatore che può essere rilevato con una risoluzione subcellulare. Diretta delle cellule di imaging confocale di proteine fluorescenza (FP) a base di indicatori di Ca 2 + fornisce un sistema di rilevamento Ca 2 + avanzate per la registrazione di cellulari Ca 2 + dinamica con una risoluzione cellulare in un tessuto desiderato. Qui, utilizzando cellule vive di imaging confocale e basati su FP Ca 2 + indicatori, abbiamo registrato subcellulare Ca 2 + 2 +-FP sono state implementate in impianti con caratteristiche differenti. Rispetto al YCS, indicatore unico basato GFP-Ca 2 + ha alcuni vantaggi: 1 Case12 non richiede YFP e CFP filtro serie o le tante ipotesi e calcoli complessi necessari per misurare la FRET 22. Case12 dispone di camere singole di eccitazione / massimi di emissione e può essere facilmente rilevato utilizzando set di filtri GFP standard. 2. Case12 è stabile sotto pH fisiologico, ed è relativamente una piccola proteina (46 kDa). Quando espresso in piante, Case12 non mirato appare nel citoplasma e nuclei, così Case12 piante transgeniche possono essere utilizzati per monitorare citosolici e nucleari Ca 2 + dinamiche simultaneamente. Un inconveniente di questo reporter è che è un indicatore non raziometrica, per cui i livelli di fluorescenza sono anche influenzato da fattori che sono estranei alla concentrazione di Ca 2 +, come il livello di espressione diCase12 e pH locale. Tuttavia, Case12 è sufficiente per determinare cellulare concentrazione di Ca 2 + per il confronto delle spazio-temporali Ca 2 + dinamica nel citoplasma e organelli tra materiali con differenti background genetici nelle stesse condizioni sperimentali. In futuro, nuovo GFP basato Ca 2 + indicatori con elevato rapporto segnale-rumore, cinetiche veloci e maggiore risposta, come GCaMP3 24 e 25 GCaMP5 dimostrato negli animali, potrebbe essere migliori indicatori per la registrazione di cellulare o subcelluar Ca 2 + dinamiche in piante.
I sistemi di rilevamento aequorina e Case12 qui descritti forniscono non distruttivi in vivo si avvicina per la misura di spazio-temporali Ca 2 + dinamiche in tutta la piantina e livelli subcellulari, rispettivamente. In entrambi i sistemi, le condizioni di stato o di crescita fisiologici potrebbero influenzare il Ca 2 + risposte delle piantine o cellule. Se Physically danneggiato o non coltivate in buone condizioni, le cellule potrebbero avere deboli o addirittura senza Ca 2 + risposte. Inoltre, la durata spaziali e temporali Ca 2 + segnali sono anche influenzata dalle condizioni della piantina durante le misure. I segnali di luminescenza o fluorescenza può diminuire nel tempo a causa di stimoli indotta danni, e / o la foto-danno indotto laser nel caso di confocale. Sebbene danno stimolo indotto non può essere evitata, fototossicità può essere ridotta limitando l'intensità e / o frequenza di esposizione laser. Inoltre, in base aequorina sistema di registrazione Ca 2 + richiede un passaggio di ricostituzione. I fattori che interrompono la diffusione del CTZ alla cella e / o reazione del apoaequorin con CTZ interesserebbero i segnali di luminescenza che sono legati direttamente alla concentrazione di Ca 2 +. Pertanto, la concentrazione del CTZ, nonché la durata e le condizioni di CTZ incubazione devono essere ottimizzati per la migliore sensibilità e reproducibillità. Geneticamente codificati Ca 2 + indicatori possono erroneamente segnalare cellulari Ca 2 + concentrazioni per altri motivi, tra cui non intenzionale mira a specifici compartimenti subcellulari, sensibilità alla temperatura, o interferenze del giornalista con il cellulare di Ca2 + segnalazione macchine 23. Abbiamo trovato che aequorina o Case12 piante che esprimono non hanno evidenti fenotipi morfologici o condizionali come alterata tolleranza allo stress. Pertanto, è improbabile che questi geneticamente codificati Ca 2 + indicatori sono importanti interferenze con Ca 2 + Segnalazione di piante.
In sintesi, vi presentiamo qui le istruzioni dettagliate per l'utilizzo di due sistemi di rilevazione Ca 2 + per la misurazione Ca spaziale e temporale 2+ segnali sia l'intera pianta piantina e livelli subcellulari. Questi due sistemi possono essere utilizzati per determinare il tessuto (o tipo cellulare) o Ca 2 + stimoli specifici modelli dinamici con alta sensibilità eriproducibilità. Pertanto essi sono strumenti potenti per chiarire le reti di geni che sono alla base di Ca 2 + Segnalazione di risposta a vari stimoli ambientali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
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