時空のCaを測定する Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51945

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Xiaohong Zhu¹, Aaron Taylor², Shenyu Zhang¹, Dayong Zhang^1,3, Ying Feng^1,4, Gaimei Liang^1,5, Jian-Kang Zhu^1,6

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

のCa ^{2 +}シグナル伝達は、植物において、多様な生物学的プロセスを調節する。ここでは、遺伝的にコード化されたのCa ^{2 +}指標エクオリンまたはCASE12を使用して、シロイヌナズナの細胞および組織内の空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルを誘発した非生物的ストレスを監視するためのアプローチを提示します。

Abstract

発生および環境信号は、植物細胞内のCa ^{2 +}の変動を誘発する。刺激固有の空間-時間のCa ^{2 +}のCa ^{2 +}のパターンは、シグナル伝達カスケードを開始し、携帯のCa ^{2 +}結合タンパク質によって感知される。しかし、私たちはまだ、特定のCa ^{2 +}シグナルが生成される刺激方法について少し知っている。のCa ^{2 +}シグナルの特異性は、与えられた刺激に応答してのCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの活性の洗練されたレギュレーションに起因し得る。これらの細胞成分を同定し、その機能を理解するには、組織や細胞レベルの両方でのCa ^{2 +}シグナルの高感度かつ堅牢な記録を可能にするシステムを使用することが重要です。異なる細胞区画を標的とする遺伝的にコードされたのCa ^{2 +}指標は、携帯のCa ^{2 +}シグナルの生細胞の共焦点イメージングのためのプラットフォームを提供してきた。ここでは、命令を記述する2のCa ^{2 +}の検出システムを使用するためのsが：FAS（フィルム接着剤の苗）の発光のCa ^{2 +}イメージングおよびCASE12ベースの生細胞共焦点蛍光カルシウム^{2 +}イメージングベースのエクオリン。 CASE12を用いて生細胞の共焦点イメージングは、高解像度でのサイトゾルおよび核のCa ^{2 +}シグナルの同時検出を提供しながら、FASシステムを用いた発光イメージングは、組織レベルでの空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルの単純な堅牢かつ高感度な検出を提供する。

Introduction

植物細胞は、細胞の行動を調整するシグナリングを介して環境に応答する。環境刺激に応答してイベントをシグナリング初期の細胞は一過性のCa ^{2 +}の増加である。遊離Ca ^{2 +}濃度のパターン、または一過性の上昇の署名は、その振幅、周波数、および期間によって特徴付けられる。個別時空間のCa ^{2 +}署名は異なる細胞活性^1を調節する。例えば、熱、寒さ、塩、干ばつ、光、植物ホルモンなどの具体的な刺激は、微調整も膜局在のCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの時空間的アクティビティを、特定のCa ^{2 +}の署名を得た。のCa ^{2 +}輸送体が十分に特徴付けされているが、ほとんどの植物¹におけるCa ^{2 +}チャネルの分子アイデンティティおよび機能についてはほとんど知られていない。ストレス刺激するために、変化したのCa ^{2 +}応答を持つ変異体についての遺伝子スクリーニングが効果的APPRかもしれのCa ^{2 +}の署名を構成するコンポーネントを識別するためのoach。最近、いくつかのイクオリンベースのCa ^{2 +}検出システムは、病原体の攻撃および非生物的ストレス^2-4に反応してCaのための遺伝子スクリーニング^{2 +}シグナル伝達成分を容易に開発されている。

イクオリンは、まず1990年代初期⁵植物におけるCa ^{2 +}シグナルを検出した。それ以来、イクオリンは、特定のCa ²セルを監視するためにそのような細胞質^5、核⁶などの異なる細胞区画に、葉緑体^7、8、ミトコンドリア^9、および間質¹⁰液胞膜と同様に、ルート内の異なる細胞型に標的化されています⁺シグナル^11。エクオリンベースのCa ^{2 +}測定は、ストレス刺激する細胞の集団の空間的および時間的のCa ^{2 +}応答を明らかにする。しかし、ほとんどの場合、単一の細胞のCa ^{2 +}応答はunsynchroniある応答組織⁴にゼット。そのため、イクオリンのCa ^{2 +}記録は、必ずしも個別のセル内のCa ^{2 +}シグナルを報告しません。近年では、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質（FP）は、黄色カメレオンなどのCa ^{2 +}指標^{（YCS）12を}ベースとCASEs12 ^13は、Caを研究するために使用されている^{2 +}高細胞下解像度とシグナリング。 YCSある蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、CFPを含む、カルシウム^{2 +}指標をベースとYFPのCa ^{2 +}の結合タンパク質のカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13によって連結された変異体。それは、Ca ^{2 +}に結合するようにカルモジュリン、それによって増加したエネルギー移動（FRET強化）で、その結果、より緊密CFPとYFPをもたらし、コンホメーション変化を受ける。 CFPシグナル強度に対するYFPの比として概算時間をかけてFRETレベルは、細胞内Ca ^{2 +}動態を反映している。いくつかのYCバージョンが植物において使用されている。 YC3.6 tはあった細胞質ゾル^14,15、核^16、ミトコンドリア^17、および原形質膜^18、およびYC4.6とD4ERにargetedは、ER ^15,19をターゲットとし、D3cpvはペルオキシソーム²⁰を対象とした。 YCSを発現するトランスジェニック植物は、異なる細胞型の異なる細胞区画内のCa ^{2 +}動態の生細胞イメージングを可能にする。ケース（おそらくカルシウム lcium SE nsor）がカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13を保有する単一の円順列蛍光タンパク質（cpFPs）です。のCa ^{2 +}に結合すると、ケースは、蛍光強度の増加をもたらす、コンフォメーション変化を受ける。 CASEの蛍光応答およびCa ^{2 +}濃度との相関は、細胞内Ca ^{2 +}動態を定量的に測定することができる。 CASE12変異体は、12倍のCa ^{2 +} -飽和形で蛍光が増加している。N. benthiminanaプラント過渡的にはexprディエッサーCASE12または安定的にケース12を発現しているシロイヌナズナ植物が防御と非生物的ストレス^4,21中のCa ^{2 +}シグナル伝達を研究するために使用された。病原体の攻撃に、または乾燥ストレスに応答する細胞内のCa ^{2 +}の非同期空間的および時間的な振動がCASE12ベースのCa ^{2 +}イメージングで明らかにされている。

ここでは、シロイヌナズナの苗において、組織との刺激特定のCA ^{2 +}動態のエクオリンに基づく発光イメージングのための詳細な手順を提示、およびFASのケース12発光イメージングを表現シロイヌナズナの根の細胞内の細胞質ゾルおよび核のCa ^{2 +}動態の共焦点イメージングのためのストレス誘発性のCaここでは記載していない無傷の植物又は組織における^{2 +}動態を分析するために適合させることができる、またはCa ^{2 +}シグナルを誘導し、変更された応力を有する変異体のための突然変異誘発シロイヌナズナ植物集団をスクリーニングする。生細胞のCa ^{2 +}イメージングセットアップは、Caを分析するために適合させることができる他のCa ^{2 +}指標を使用して、異なるsubcelluarコンパートメント内または異なる細胞型において2 +動態。

Protocol

FASシステムを用いた1イクオリンベースのCA ^{2 +}イメージング

1. 発光イメージングのための苗木を準備します。 0.01％のTriton-100を含有する10％漂白溶液でエクオリンを発現するArabidopsis植物の種子を滅菌する。フル強度MS（ムラシゲ·スクーグ基礎塩混合物）、1％スクロース、1.2％寒天を含む角板（グリッド10×10cmの正方形のペトリ皿）上で無菌種をまく。 2日間（ 図1A）、4℃で層別化した後、成長チャンバー内に垂直に配置し、プレート。
2. フィルム上に苗を移します。プレート上で生育7-10日齢の苗の上に接着フィルム（ 図1B）を配置します。ゆっくりと苗はフィルム（ 図1C）に準拠していることを確実にするために手でフィルムを押してください。苗がフィルムに付着したままになるように静かにフィルムをはがします（ 図1Dおよび1E）
3. 補因子と苗をインキュベートします。 Aを配置水の中に2μg/ mlののH-CTZ（セレンテラジン）の15ミリリットルを含む正方形のプレート上dhered苗（10×10センチ）。一晩に4時間（ 図1F）を、室温で苗をインキュベートする。
4. 発光イメージングのための準備をします。 H-CTZ溶液からフィルムを取り出し、中央を、それを切り倒し、二枚を形成する。二つの異なるプレートで表向きに苗木を有するフィルムの各部分を配置します。 5分間、暗所でプレートにしておきます。
5. 発光画像を取得する。闇の中で、発光イメージングシステム（ 図1G）のステージ上に、互いの横に二つのプレートを配置。すぐに同時にプレートに刺激を溶液20mlを加える際に画像を取得する。
6. 発光画像を分析します。すべての発光画像に対して同じ表示範囲を選択します。関心領域（ROI）をクロップし、JPEGファイル（ 図2A）のような画像を生成する。別の方法として、SPE形式のファイルとして画像をエクスポートしにインポートImageJの画像解析ソフトウェア。 ROIの平均グレー値を計算するための測定値を設定します。 ROI領域の同じサイズを選択して、棒グラフ（ 図2B）、平均グレーと現在のデータを測定します。

2生細胞共焦点のCa ^{2 +}イメージング

1. 共焦点イメージングのための苗木を準備します。トリトン0.01％を含む10％の漂白剤溶液でCASE12を表現するシロイヌナズナ植物の種子を滅菌する。フル強度MS塩、1％スクロース、および1.2％寒天を含むプレート上で無菌種をまく。 2日間で4℃で層別化した後、成長チャンバー内に垂直に配置し、プレート。
2. セットアップイメージングチェンバース
   1. スライドとカバーガラス（商工A）を用いたイメージングチャンバーを組み立てます。スライドの真ん中に水に浸した脱脂綿の作品を配置します。その後、水に浸した脱脂綿の上部にプレートから1つまたは2つの5日齢の苗を移す。カバースリップの各コーナーへの粘土の小片、スティックカバーガラスとスライドとの間のギャップ（室）（ 図3A、左パネル）を作成する苗の上のd位のカバースリップ。 1mlシリンジにポリエチレンチューブ（0.58ミリメートル直径）の一端を接続し、チャンバーに直接隣接するチューブのもう一方の端を置きます。テープ（ 図3A、右パネル）で所定の位置にチューブを保持します。
   2. プレキシガラス室（B室）を使用して画像化チャンバを組み立てます。
      1. プレキシガラス室のそれぞれの側のチャネルにコーティングされた管を2ポリエチレン管（0.58ミリメートル径）の周りにシリコーングリースの薄層を広げ、押した（ 図3（b）は、左パネル）。チューブの溝が含まれているチャンバーの表面にシリコーングリースの薄層を広げ、チャンバ開口部（切り出す）の一方の側を密封するグリースにカバースリップを押してください。
      2. チャンバー内にプレートから5日齢の苗を移し、トップO上の水に浸した脱脂綿の一部を置く苗F。チャンバーの他方の面にシリコーングリースを広げ、かつシールするために上に別のカバースリップを押してください。 1ミリリットルの注射器にチューブの一方の端を接続します。他の管開放（ 図3B右パネル）の終わりにしておきます。
   3. チャンバーカバーガラス（商工C）を用いた撮像室を準備します。 70％エタノールでチャンバーカバーガラスを殺菌し、乾燥するまでボンネットの上に残す。それぞれ、2ウェルチャンバーまたは8ウェルチャンバー（ 図3C右パネル）の各ウェルに1％スクロースおよび0.5％phytagelを含む完全な強MS培地の0.6ミリリットルまたは0.2ミリリットルを追加します。種子を殺菌し、透明なゲルの薄層を含むチャンバーカバーガラスに直接種をまく、それらを5日間（ 図3C）のために垂直方向に成長してみましょう。
3. 共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。寒さや過酸化物などの塩などのストレス刺激を、適用するには、ゆっくりと150のNaCl、約200μlの、アイスコルを注入直前にそれぞれ、画像を取得するか、静かに2または8ウェルチャンバーのウェルに刺激溶液500μlまたは100μlのを追加し、チャンバ（チャンバAまたはB）へのd水または1mMのH ₂ O ₂溶液。直ちに20X浸水レンズ（開口数0.75）を用いて反転ニコンA1R共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて刺激剤溶液を塗布した後に画像を取り込む。それぞれ550nmで、および512×512ピクセルの解像度で - 488 nmおよび500の励起波長および発光波長を持つ4秒間隔で画像の時系列を収集します。
4. 画像解析
   ニコンの要素を使用して、ROIが対象とする各セル（又は面積）の周りに描かれた。各ROI内の総強度は、時間測定ダイアログボックス（ImageJの代わりに使用することができる）を用いて経時的に測定した。全強度測定は、データグラフでエクスポート処理した。のCa ^{2 +}スパイク振幅は番目としてピーク強度マイナス休止強度、持続時間として定義した2スパイクの隣接するスパイクピーク間の時間間隔として開始およびスパイクの終了、及び期間の間の電子の時間が-test手段を比較するために使用したトン 。

Representative Results

マンニトール、NaClおよびH ₂ O _2は、それぞれ、脱水、塩および酸化ストレス刺激のためのプロキシとして使用した。重金属イオンのCu ^{2 +は、}これら三つのストレス刺激のいずれかと相乗作用しているかどうかを確認するために、私たちは、Cu ^{2 +}の存在下または非存在下でそれぞれの刺激に対するCa ^{2 +}応答を比較した。 図2に示されるように、FASの発光イメージングはArabidoposis苗脱水、塩および酸化ストレスに対して異なって応答したことを明らかにした。 1 mMのH ₂ O _2が誘導しながら、私たちはこの研究で調べた刺激の濃度について、75のNaClは、露出（ 図2A中央のパネルおよび図2B）の最初の40秒の間に葉と根で最強のCa ^{2 +}応答を誘導した第一および第二40秒（ 図2A右パネル）の間に葉と根の両方で強いのCa ^{2 +}応答。 400 mMのマンニトールの溶液のみ誘発される第40秒の間に、葉の最初の40代、非常に微弱な信号の間の根におけるCa ^{2 +}応答。 Cuは強く振幅とNaClおよびマンニトール（ 図2A左パネル）によってトリガーのCa ^{2 +}シグナルの持続時間を強化^2+。これは、Cu ^{2 +、}振幅と持続時間（ 図2A、右パネルおよび図2B）の両方を減少させる、のCa ^{2 +}シグナルを誘発したH ₂ O ₂に対する阻害効果を有すると思われる。

CASE12はシロイヌナズナ植物体を発現用いて、同時に細胞質ゾルおよび核中のCa ^{2 +}動態を測定した。 CASE12の分子量はCASE12を発現している、したがってトランスジェニック植物は、葉と根細胞（ 図4A）のサイトゾルおよび核の両方でGFPシグナルを持っている、46 kDaである。カスタマイズされた（ 図3Aおよび3B）または商業チャンバー（ 図3C）は 、共焦点で生細胞イメージングのために使用した顕微鏡。チャンバ内の苗を、150mM NaClを適用して、個々の細胞（;補足ムービー1 図4BおよびC）の細胞質ゾルおよび核の両方に蛍光強度の変化を観察した。 NIS-要素（イメージングソフトウェア、ニコンインスツル社）を用いて、経時的関心領域（ROI）で蛍光強​​度を測定した。振幅、持続時間および細胞質と核のCa ^{2 +}振動の周波数は、 図4Bにグラフで示す。細胞質内の振幅とのCa ^{2 +}期間スパイクと核が同じルートのセルの間、ならびに異なる根の細胞によって大きく異なります。細胞質ゾルのCa ^{2 +}スパイクの振幅と周期は、それぞれ、60.36±45.22 AU（任意単位）および58.24±15.70秒であった。核のCa ^{2 +}スパイクの振幅と周期はそれぞれ、316.26±75.24（AU）および61.71±16.31秒であった。対照的に、細胞質ゾルのCa ^{2 +}と核スパイクの持続時間は、それぞれ17.43±3.67秒、17.33±2秒であった細胞、間で同様であった。焦点面および/ ​​または応答の損失の変化によるものであろう^{2 +}スパイクは時間の経過とともに減少したのCaの振幅があるため体外状態で不利なの刺激を強調した。これらの結果は、塩ストレスは細胞質および核の両方でのCa ^{2 +}振動をトリガーすることを示している。

図1は、イクオリンの刺激をストレスに応答して時空間のCa ^{2 +}動態を測定するためのFASシステムをベース。 A））B、C、。MS培地を含むプレート上に垂直にシロイヌナズナの苗を育てる苗（C）、D、E）の上に接着剤フィルム（B）を配置します。F）はG）が真ん中にフィルムをカットします。4時間水にH-CTZを2μg/ mlのフィルムに接着苗をインキュベートし、異なるに各ピースを配置空のプレート。 5分間、暗所でプレートにしておきます。制御し、刺激のソリューション（苗が完全にカバーされていることを確認してください）​​と、すぐに画像を取得、同時に適用します。スケールバーは5cmである。

時空のCa ^{2 +}の比較図2。異なるストレス刺激に対する10日間の実生の応答。 400 mMのマンニトールおよび400mMのマンニトールを加えた1 mMのCuCl ₂を（A、左パネル）、75mMのNaClおよび75mMのNaClを加えた1 mMののCuClを受ける苗の発光画像のA）の時系列図2（A、中央のパネル）、および1mM H ₂ O ₂または1mMのH ₂ O _{2 +}の1mMのCuCl _2（A、右パネル）。 Aの上下のパネルは、それぞれ第40秒、第40秒、中に取得した発光画像である。強度スケールバーは高い（白）、低（黒）からの発光信号の増加となりました。B）指示されたストレス刺激に応答した実生の平均発光強度の棒グラフを示す。

生細胞の共焦点イメージング実験の図3のセットアップ。 A）カスタマイズされたチャンバは、粘土と脱脂綿を4個とスライド、カバーガラスで構築されています。 2つの5日齢の苗は、スライド上に配置されている。ポリエチレンチューブの一方の端部は、組み立て室の隣に配置され、固定されているプレキシガラスで作られ、他端は1mlシリンジに接続されているテープの断片。B）カスタマイズされたスライドは、チャネルの両側に接続されている中央2チャンネルにおける開放室を有している。 Oneカバースリップをスライドの上に配置され、2つのpolyethlene管がチャネル内に配置されている。カバーガラスとチューブはシリコーングリースと位置に固定されている。チューブの一方の端部は、1mlシリンジに接続され、別のチューブの端部は開いたままである。 5日齢の苗は、チャンバ内に配置され、coveslipは、苗の上に置き、シリコーングリースで密封されている。組み立て室とplexigalssスライドは顕微鏡のステージ上に配置されている。C）シロイヌナズナの苗は、MSにおけるphytagelの0.6％の薄層を含むチャンバーカバーガラスの2ウェル（左）または8ウェル（右）で増殖させるメディア。

図4。細胞質と核のCa ^{2 +}塩ストレスに応答して振動。 A）共焦点画像は、CASE12はCASE12を発現するトランスジェニック植物の根細胞（左パネル）および葉細胞（右パネル）の細胞質および核において発現されることを示している。右側のパネル上の画像が葉緑体の赤の自己蛍光及びCASE12の緑色蛍光の合成画像である。B）塩ストレス（150mMのNaCl）誘発性のCa ^{2 +}の細胞質ゾルにおける発振（上のパネル）および核（下のパネル）の根細胞。測定されたセルの位置は、パネル上の数字と矢印で示されている。

Discussion

私たちは、シロイヌナズナの苗の時空間のCa ^{2 +}応答を記録するためのFASシステムを実証している。このFASのCa ^{2 +}記録方式がここに提示されている非生物的ストレス刺激に加えて、さまざまな刺激によって誘発のCa ^{2 +}動態を測定するために適合させることができる、単純な感度かつロバストな手法を提供する。このシステムを用いて、簡単に植物全体レベルでの組織または刺激特異的な時空間のCa ^{2 +}動態を比較することができます。 FASの高い感度は、高強度のストレスが使用される場合、細胞に物理的な損傷によって引き起こされるアーティファクトを回避するために重要でのCa ^{2 +}応答を検査するための低強度の刺激を使用することができる。異なる生理学的段階で苗が与えられた刺激に応じて異なる感度と特異性を持っているかもしれないが7〜10日齢のシロイヌナズナの苗は、組織または刺激特異的のCa ^{2 +}応答を示した。したがって、ある約100苗がフィルムの一枚の上に付着させることができたFAS測定のスループットを向上させるために7-10日齢の実生を、使用することが好ましい。一緒に簡単で単純な性能、高感度、再現性、FASシステムはまた、改変されたのCa ^{2 +}応答をEMS変異誘発変異体をスクリーニングするために適合させることができる。スクリーニング目的のためには、ウェルプレート上で増殖させ、フィルムの上に接着されている均一な苗を持つことが重要です。 H-CTZのフィルムに接着苗の4〜5時間のインキュベーションは、イクオリンの再構成のために通常は十分です。アポエクオリンと補因子との反応は、酸素を必要とするため、穴に接着剤フィルムを使用することが好ましい。苗および/ ​​または再構成条件の状態が機能イクオリンの総量に影響を与える可能性があるため、組織または刺激特異的なカルシウム^{2 +}応答の比較のため、同じフィルム出身苗のグループを使用することは非常に重要です。ときにこれらのrequiremeNTSが満たされ、発光応答の差は、組織または刺激特異的応答のCa ^{2 +}に比例する。

イクオリンのCa ^{2 +}シグナルのベースの測定は、細胞の集団の応答を反映している。しかし、細胞型および/ ​​または刺激に対する組織中の細胞の異なる接近性の不均一性を考慮すると、エクオリンの結果は、もとのCa ^{2 +}測定は、いずれかのセルの動作と同等ではありません。細胞レベルでのCa ^{2 +}のダイナミクスを理解することは、細胞内の分解能で検出することができるのCa ^{2 +}指標が必要です。蛍光タンパク質（FP）の生細胞共焦点イメージングは、Ca ^{2 +}ベースの指標は、所望の組織における細胞の解像度で、携帯のCa ^{2 +}動態を記録するための高度なのCa ^{2 +}検出システムを提供する。ここでは、生きた細胞の共焦点イメージングとFPベースのCa ^{2 +}指標を用いて、私たちは細胞内のCa ^{2 +}を記録した2 +指標の2つのタイプが異なる特性を有する植物において実施されている。 YCSと比較して、単一のGFPベースのCa ^{2 +}指標は、いくつかの利点があります：1。CASE12は、YFPとCFPフィルターセットや多くの仮定およびFRET ^22を測定するために必要な複雑な計算を必要としません。 CASE12は、単一の励起/発光極大を有し、容易に標準GFPフィルターセットを用いて検出することができる。 2 CASE12は、生理的pHで安定であり、比較的小さなタンパク質（46 kDa）がある。植物中で発現された場合CASE12トランスジェニック植物は同時に細胞質ゾルおよび核のCa ^{2 +}動態を追跡するために使用することができるように、非標的CASE12は、細胞質ならびに核内に表示される。このレポーターの欠点は、非レシオメトリック指示薬であることであるので、蛍光レベルはまた、発現レベルなどのCa ^{2 +}濃度とは無関係な要因によって影響を受けるCASE12および局所的なpH。それにもかかわらず、CASE12は、同じ実験条件下で異なる遺伝的背景を持つ材料の間の空間的·時間的なカルシウム^{2 +}細胞質中のダイナミクスと細胞小器官の比較のための細胞のCa ^{2 +}濃度を測定するのに適しています。将来的には、GCaMP3 ²⁴および動物において実証GCaMP5 ²⁵のような、より高い信号対雑音比、速い反応速度とより大きな応答を持つ新しいGFPベースのCa ^{2 +}指標は、中のCa ^{2 +}の細胞またはsubcelluarダイナミクスを記録するためのより良い指標であり得る植物。

ここで説明するイクオリンとCASE12検出システムは、 生体内で非破壊、それぞれ全体の苗および細胞内レベルでの時空のCa ^{2 +}動態の測定のために近づいています。両方のシステムでは、生理的状態または成長条件が苗や、細胞のカルシウム²⁺応答に影響を及ぼす可能性があります。フィジカた場合LLY破損または良好な状態で成長していない、細胞が弱いかまったくないのCa ^{2 +}応答を有する可能性がある。また、空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルの持続時間も測定中苗の条件によって影響される。発光又は蛍光シグナルが原因の刺激によって誘発される損傷に時間の経過とともに減少し、かつ/または共焦点イメージングの場合にはレーザー誘起光損傷があります。刺激によって誘発される損傷を回避することはできないが、光毒性は、レーザー露光の強度および/または周波数を制限することによって低減することができる。また、エクオリンベースのCa ^{2 +}記録システムは、再構成工程を必要とする。細胞および/ ​​またはCTZとのアポエクオリンの反応にCTZの拡散を遮断する因子は、Ca ^{2 +}濃度に直接関連している発光シグナルに影響を与える。したがってCTZのインキュベーションのCTZの濃度、ならびに持続時間及び条件は、最高の感度およびreproducibilのために最適化される必要があるITY。遺伝的にコードされたのCa ^{2 +}インジケーターが不正確に意図しない特定の細胞内コンパートメント、温度感受性、または細胞のCa2が機械^{23 +}信号とレポーターの干渉へのターゲティングを含む、他の理由のための細胞のCa ^{2 +}濃度を報告することがあります。私たちは、エクオリンまたはCASE12発現する植物は、そのような改変されたストレス耐性としての明らかな形態的または条件付きの表現型を有していないことがわかった。したがって、これらの遺伝的にコードされるのCa ^{2 +}指標は、植物においてCa ²⁺シグナルの主要な干渉を持っていることはほとんどありません。

要約すると、ここではプラント全体の苗および細胞内の両方のレベルで空間的および時間のCa ^{2 +}シグナルを測定するための2つのCa ^{2 +}の検出システムを使用するための詳細な手順を提示します。この2つのシステムは、組織（または細胞タイプ）を決定するために使用され得るか、または刺激特異的な高感度でのCa ^{2 +}の動的パターンと再現。そのため彼らは、さまざまな環境の合図に反応してのCa ^{2 +}シグナル伝達の根底にある遺伝子ネットワークを解明するための強力なツールです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG