Summary
칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.
Abstract
발육 및 환경 단서 칼슘보기 식물 세포에서 2+ 변동을 유도한다. 자극 특정 시공간 칼슘 패턴이 칼슘 신호 폭포를 시작 세포의 칼슘 결합 단백질에 의해 감지된다. 그러나, 우리는 여전히 특정 칼슘 신호가 생성되는 자극 방법에 대한 약간 알고있다. 칼슘 신호의 특이성은 주어진 자극에 응답하여 칼슘 이온 채널들 및 / 또는 전송기의 활동 정교한 조절에 기인 할 수있다. 이들 세포 성분을 식별하고 그들의 기능을 이해하기 위해서는 조직 및 세포 수준에서 모두 칼슘 신호를 구분하고 강력한 기록을 허용 시스템을 사용하는 것이 중요하다. 서로 다른 세포 구획을 대상으로 유전자 인코딩 칼슘 지표 세포 칼슘 신호의 라이브 세포 공 촛점 이미징을위한 플랫폼을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 명령을 설명이 칼슘 감지 시스템의 용도들 : FAS (필름 점착 모종), 발광 칼슘 이미징 기반 case12 생균 공 초점 형광 칼슘 이미징 기반의 애큐 오린. Case12를 이용한 생균 공 촛점 이미지는 높은 해상도 세포질과 핵 칼슘 신호의 동시 검출을 제공하면서 FAS 시스템을 사용하여 발광 이미징은 조직 수준에서 시공간적 칼슘 신호의 단순 견고하고 민감한 검출을 제공한다.
Introduction
식물 세포는 세포의 행동을 통해 시그널링 좌표 환경에 응답한다. 환경 자극에 대한 응답으로 이벤트를 신호 초기 셀은 일시적인 칼슘 증가이다. 자유 칼슘 농도의 패턴, 또는 일시적인 증가의 서명은 그 진폭, 주파수 및 시간에 의해 특징된다. 고유 시공간 칼슘 서명은 다른 세포 활동 한을 조절한다. 열, 냉기, 소금, 가뭄, 빛, 또는 식물 호르몬과 같은 특정 자극, 미세 조정할 수 막 화 된 칼슘 채널 및 / 또는 수송의 시공간적 활동을, 특정 칼슘 서명 결과. 칼슘 수송이 잘 특징으로되어 있지만, 작은 식물 하나의 칼슘 채널의 분자 정체성과 기능에 대한 알려져있다. 자극을 강조하는 변경 칼슘 반응과 돌연변이에 대한 유전 스크린은 효과적인 APPR 수 있습니다칼슘 서명을 구성하는 구성 요소를 식별하기위한 oach. 최근 몇 애큐 오린 기반 칼슘 탐지 시스템은 병원균의 공격과 비 생물 적 스트레스 2-4에 대한 응답으로 구성 요소를 신호 칼슘 2에 대한 유전 화면을 용이하게 개발되었다.
애큐 오린 처음 1990 년대 초에 5 칼슘보기 식물체에서 2 + 신호를 검출하는데 사용되었다. 그 이후로, 애큐 오린은 같은 칼슘이 특정 세포를 모니터링 할 수있는 루트에서 8 tonoplast 세포질 5, 핵 6, 엽록체 7, 미토콘드리아 9, 간질 열뿐만 아니라, 서로 다른 종류의 세포 등 다양한 세포 구획을 타겟으로하고있다 + 신호 11. 애큐 오린 기반 칼슘 측정은 자극을 강조하는 세포 집단의 공간과 시간 칼슘 반응을 알 수있다. 그러나 대부분의 경우, 하나의 셀의 칼슘 반응 unsynchroni 아르응답 조직 사에 데이빗. 따라서, 애큐 오린 칼슘 기록은 반드시 각각의 세포에서 칼슘 신호를보고하지 않습니다. 최근 몇 년 동안, 유전자 인코딩 형광 단백질 (FP)는 높은 해상도로 세포 내 신호 칼슘 2를 연구하는 데 사용 된 칼슘에게 같은 노란색 카멜레온 (YCS) 12 CASEs12 (13) 등 2 + 지표를 기반. YCS는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)는 CFP를 포함, 칼슘에게 2 + 지표를 기반 및 YFP이 단백질 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 -binding 2 + 칼슘에 의해 연결된 변종입니다. 이 칼슘 결합으로 칼 모듈 린함으로써 증가 된 에너지 전달 (FRET 강화)의 결과로, 더 가깝게 CFP와 YFP을 제공, 구조적 변화를 겪는다. CFP 신호 강도에 YFP의 비율로 대략적으로 계산 된 시간에 따른 FRET 레벨은, 내 Ca 2 +보기 역학을 반영한다. 여러 YC 버전은 식물에서 사용되어왔다. YC3.6은 t이었다세포질 14, 15, 16 핵, 미토콘드리아 (17) 및 세포막 (18), 그리고 YC4.6 및 D4ER에 argeted는 ER 15,19를 대상으로하고, D3cpv는 퍼 옥시 솜 (20)을 대상으로 하였다. YCS를 발현하는 형질 전환 식물은 서로 다른 세포 유형의 서로 다른 세포 구획 내 칼슘 역학의 라이브 세포 이미징을 할 수 있습니다. 케이스 (아마도 칼슘 lcium 자체 nsor)는 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 품고 하나의 원 순열 형광 단백질 (cpFPs)입니다. 칼슘 이온에 결합되면, 경우는 형광 강도의 증가로 이어지는 구조 변화를 겪는다. CASE의 형광 반응과 칼슘 이온 농도의 상관 관계는 세포 내 칼슘 역학을 정량적으로 측정 할 수 있습니다. Case12 변형이 12 배는 칼슘 포화 지방 형태로 형광을 증가했다. N. benthiminana 식물 일시적으로 EXPR싱 Case12 또는 안정적으로 케이스 (12)를 표현하는 애기 장대 식물은 방어와 비 생물 적 스트레스 4,21에서 칼슘 신호 전달을 연구하는 데 사용되었다. 또는 탈수 스트레스에 병원균의 공격에 대응하는 세포에서 비동기 공간과 시간 칼슘 진동은 Case12 기반의 칼슘 이미징 공개되었다.
여기서 우리는 애기 모종 2 + 역학 칼슘 특정하고, 세포질의 공 초점 이미징 및 핵 CA의 조직 -와 자극의 애큐 오린 기반 발광 이미징에 대한 자세한 지침을 제시 FAS의 케이스 (12) 발광 영상을 표현 애기 루트 세포 2 + 역학 그대로 식물 또는 여기에 설명되지 않은 조직에서 스트레스에 의한 칼슘 역학을 분석하기 위해, 또는 2 + 신호 칼슘에 의한 변형 된 스트레스와 돌연변이에 대한 돌연변이 애기 장대 식물 집단을 선별 적용 할 수있다. 라이브 세포 칼슘 영상 설정은 칼슘을 분석하기에 적합 할 수다른 칼슘 지표를 사용하여 다른 subcelluar 구획 내에서 또는 서로 다른 세포 유형에서 2 + 역학.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FAS 시스템을 사용하여 1 애큐 오린 기반 칼슘 이미징
- 발광 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤-100를 포함하는 10 % 표백제 용액으로 애큐 오린을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 전체 강도 MS (무라 시게와 스쿡 기초 소금의 혼합물), 1 %의 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 사각형 접시 (격자 10 × 10cm 사각형 페트리 접시)에 멸균 씨앗을 뿌리고. 수직으로 이일 4 ° C (그림 1A)에서 층화 후 성장 챔버에 넣어 판.
- 필름에 묘목을 전송합니다. 접시에 성장 7-10일 된 모종의 상단에 접착 필름 (그림 1B)를 놓습니다. 조심스럽게 모종 필름 (그림 1C)을 준수하는지 확인하기 위해 손으로 필름을 밀어 넣습니다. 모종이 필름에 부착 된 상태로 유지되도록 조심스럽게 필름을 벗겨 (그림 1D 및 1E)
- 보조 인자 (cofactor)로 모종을 품어. 배치포함 된 각 접시 (10 × 10cm) 상에 dhered 모종 2 μg의 15 ㎖ / ML의 H-CTZ 물 (coelenterazine). 하룻밤 (그림 1 층)에 4 시간 동안 실온에서 묘목을 품어.
- 발광 이미지를 준비합니다. 두 조각을 형성, H-CTZ 솔루션에서 필름을 가지고 중간을 잘라. 모종은 두 개의 서로 다른 판에 얼굴 필름의 각 조각을 놓습니다. 5 분 동안 어둠 속에서 판을 둡니다.
- 발광 이미지를 획득. 어둠 속에서 옆에 발광 이미징 시스템 (그림 1G)의 무대에서 서로 두 판을 배치합니다. 동시에 즉시 플레이트에 자극 용액 20 ㎖를 첨가시에 화상을 취득.
- 발광 이미지를 분석합니다. 모든 발광 이미지에 대해 동일한 표시 범위를 선택합니다. 관심 (ROI)의 영역을 자르기 및 JPEG 파일 (그림 2A)와 같은 이미지를 생성합니다. 또한, SPE 형식 파일로 이미지를 내보내고로 가져ImageJ에 이미지 분석 소프트웨어. ROI의 평균 그레이 값의 계산을위한 설정 측정. ROI 영역의 같은 크기를 선택하고 막대 그래프 (그림 2B)로 평균 그레이와 현재의 데이터를 측정합니다.
2 라이브 셀 공 촛점 칼슘 이미징
- 공 촛점 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤을 포함하는 10 % 표백제 용액으로 case12을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 풀 강도 MS 염, 1 % 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 접시에 무균 씨앗을 뿌리고. 이일 4 ° C에서 층화 후 성장 챔버에서 수직으로 배치 접시.
- 설치 이미징 챔버
- 슬라이드와 커버 슬립 (상공 회의소)를 사용하여 이미징 챔버를 조립합니다. 슬라이드의 중간에 물을 적신 탈지면의 조각을 놓습니다. 그런 다음 물에 적신 탈지면의 상단에 접시에서 하나 또는 두 개의 오일 된 모종을 전송합니다. 커버 슬립,의 각 모서리에 점토의 작은 조각 스틱커버 슬립 및 슬라이드 사이의 간격 (챔버) (그림 3A, 왼쪽 패널)를 만들 수있는 모종의 상단에 D 장소 coverslip에. 1 ML의 주사기에 폴리에틸렌 관 (0.58 mm 직경)의 한쪽 끝을 연결하고 챔버에 바로 인접 튜브의 다른 쪽 끝을 배치합니다. 테이프 (그림 3A, 오른쪽 패널)와 장소에 튜브를 잡습니다.
- 플렉시 글라스 챔버 (챔버 B)를 사용하여 촬상 챔버를 조립한다.
- 플렉시 글라스 챔버의 양쪽에있는 채널로 코팅 된 튜브를 두 폴리에틸렌 관 (0.58 mm 직경)의 주위에 실리콘 그리스를 얇게 확산 누릅니다 (그림 3b는 왼쪽 패널). 튜브 홈을 포함하는 챔버의 표면 상에 실리콘 그리스를 얇게 펴고 챔버 개구 (잘라)의 한쪽을 밀봉하는 그리스로 커버 슬립을 누른다.
- 챔버로 판에서 오일 된 묘목을 전송하고 상단 오에 물에 흠뻑 탈지면의 조각을 배치묘목 바. 챔버의 다른 표면에 실리콘 그리스를 확산하고, 인감 위에 다른 커버 슬립을 누릅니다. 1 ML의 주사기에 튜브 중 하나의 끝을 연결합니다. 다른 관 오픈 (그림 3B 오른쪽 패널)의 끝을 둡니다.
- 챔버 커버 유리 (챔버 C)를 사용하여 촬상 챔버를 준비한다. 70 % 에탄올로 챔버 커버 유리를 소독하고 건조까지 후드에 두십시오. 0.6 ML 또는 각각이 잘 챔버의 각 웰 또는 8 잘 챔버로 (그림 3C 오른쪽 패널)를 1 % 자당 및 0.5 % phytagel를 포함하는 전체 강도 MS 매체의 0.2 ML을 추가합니다. 종자를 소독하고 명확한 젤의 얇은 층을 포함하는 챔버 커버 유리에 직접 씨앗을 뿌리고 그들을 오일 (그림 3C)에 대해 수직으로 성장 할 수 있습니다.
- 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 얼음-COL 천천히 150 mM의 NaCl을 약 200 μl를 주입, 염분, 감기 나 과산화수소와 같은 스트레스 자극을 적용하려면직전에 각각의 이미지를 획득하거나 부드럽게 2 또는 8 잘 챔버의 웰에 자극 용액 500 ㎕를 100 μl를 추가로 실 (챔버 A 또는 B)에 D 물 또는 1 ㎜ H 2 O이 솔루션 . 이미지 캡처 즉시 20X 물 침지 렌즈 (개구 수 0.75) 반전 니콘 A1R 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 자극 솔루션을 적용한 후. 각각 550 나노 미터, 512 X 512 픽셀의 해상도에서 - 488 nm 내지 500의 여기 및 발광 파장의 4 초 간격으로 화상의 시계열을 모은다.
- 이미지 분석
니콘 요소를 사용하여, ROI를 원하는 각 셀 (또는 영역)의 주위에 그려졌다. 각 투자 수익 (ROI) 내에서 전체 강도는 시간 측정 대화 상자 (ImageJ에 대신 사용될 수있다)를 사용하여 시간이 지남에 따라 측정 하였다. 전체 강도 측정은 수출 및 DataGraph에서 처리되었다. 칼슘 스파이크 진폭 번째로 피크 강도 마이너스 휴식 강도, 지속 기간으로 정의 하였다이 스파이크의 스파이크 인접한 피크 사이의 시간 간격 등의 개시 및 종료 스파이크 및 기간 간의 전자 시간. -test는 수단과 비교하는 데 사용 된 T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
만니톨, 염화나트륨 및 H 2 O 2는 각각, 탈수, 소금 및 산화 스트레스 자극에 대한 프록시로서 사용 하였다. 중금속 이온의 Cu 2 +이 세 스트레스 자극 중 어느 synergizes 여부를 확인하기 위해, 우리는 2 +의 Cu의 존재 또는 부재의 각 자극에 칼슘 응답을 비교 하였다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, FAS 발광 이미징 Arabidoposis 모종 탈수, 소금, 산화 스트레스에 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 1 ㎜ H 2 O 2가 유도하는 동안 우리는이 연구에서 조사 자극의 농도를 들어, 75 mM의 염화나트륨은, 노출 (그림 2A 가운데 패널 및도 2b)의 처음 40 초 동안 잎과 뿌리에서 가장 강력한 칼슘 반응을 유도 제 1 및 제 2 40 초 (그림 2A 오른쪽 패널) 동안 잎과 뿌리에 모두 강한 칼슘 응답. 400 밀리미터 만니톨 용액 만 유도초 40 초 동안 잎에서 처음으로 40 대와 매우 약한 신호 동안 뿌리 칼슘 반응. 구리 강하게 진폭 및 염화나트륨 및 만니톨 (그림 2A 왼쪽 패널)에 의해 트리거 칼슘 신호의 지속 시간을 향상 2+. 그것은 구리 2 +는 H 칼슘 진폭과 기간 (그림 2A 오른쪽 패널 및 2B)을 모두 줄 2 + 신호, 유도 2 O 2에 대한 억제 효과를 한 것으로 나타납니다.
Case12 표현 애기 장대 식물을 사용하여, 우리는 동시에 칼슘에게 2 + 세포질에서 역학과 핵을 측정 하였다. Case12의 분자량을 표현 Case12 따라서 GFP 형질 전환 식물의 세포질에서 두 신호의 잎과 뿌리 핵 세포 (도 4a)가 46 kDa의 것이다. 사용자 정의 (그림 3a 및 3b) 또는 상업적 챔버 (그림 3C)는 공 초점으로 라이브 세포 이미징을 사용 하였다현미경입니다. 챔버 종묘 150 mM의 NaCl을 적용, 우리는 세포질 및 각 셀 (; 보충 한 동영상도 4b 및 C)의 핵 모두에서 형광 강도의 변화를 관찰했다. NIS 요소 (이미징 소프트웨어, 니콘 인스트루먼트 사)을 사용하여, 우리는 시간이 지남에 관심 (ROI)의 지역에서 형광 강도를 측정 하였다. 진폭, 기간 및 세포질과 핵 칼슘 진동의 주파수는 그림 (b)에 그래픽으로 표시됩니다. 2 + 세포질에서 스파이크와 핵 동일한 루트의 세포 사이뿐만 아니라 다른 뿌리 세포에 걸쳐 매우 다양 칼슘의 진폭과 기간. 세포질 칼슘 스파이크의 진폭과 기간은 각각 60.36 ± 45.22 AU (임의의 단위) 및 58.24 ± 15.70 초였다. 핵 칼슘 스파이크의 진폭과 기간은 각각 316.26 ± 75.24 (AU)과 61.71 ± 16.31 초였다. 이에 대해,세포질과 핵 칼슘 스파이크의 기간은 각각 17.43 ± 3.67 초와 17.33 ± 2 초였다 세포 사이 유사 하였다. 초점 평면 및 / 또는 응답의 손실의 변화에 기인 할 수있다 2+ 스파이크가 시간이 지남에 따라 감소 칼슘의 진폭이 때문에 생체 조건에서의 불리한 자극을 강조한다. 이러한 결과는 소금 스트레스가 세포질과 핵에 모두 칼슘 진동을 유발 것을 알 수있다.
도 1은 애큐 오린 스트레스 자극에 반응하여 시공간 칼슘 동역학을 측정 FAS 시스템을 기반. A) MS 매체. B를 함유하는 플레이트 상에 수직으로 애기 모종 성장, C)는 모종의 상부 (C). D, E)에 접착 필름 (B)를 배치 F)는 G)가 미드 필름을 잘라. 4 시간 동안 물에 H-CTZ의 2 μg / ml의 필름에 부착 된 모종을 품어하고 다른로 각 조각을 배치 빈 접시입니다. 5 분 동안 어둠 속에서 판을 둡니다. 동시에 제어하고 자극 솔루션 (묘목이 완전히 덮여 확인) 즉시 이미지를 수집 적용됩니다. 스케일 바는 5cm입니다.
시공간 칼슘의 그림 2와 비교 2+ 다른 스트레스 자극에 십일 모종의 반응. 400 MM의 만니톨 및 400 mM의 만니톨 플러스 1 ㎜의 CuCl 2 (A, 왼쪽 패널), 75 mM의 NaCl을 75 mM의 NaCl을 더한 1 ㎜의 CuCl을 실시 모종의 발광 이미지 A) 시계열2 (A, 가운데 패널) 및 1 ㎜ H 2 O 2 또는 1 ㎜ H 2 O 2 플러스 1 ㎜의 CuCl 2 (A, 오른쪽 패널). 의 상부 및 하부 패널은 각각 첫번째 40 초 및 초 40 초 동안 획득 발광 이미지입니다. 강도 눈금 막대 높은 (흰색) 낮은 (검정)에서 발광 신호의 증가. B) 지정된 스트레스 자극에 대한 반응에 모종의 평균 발광 강도의 막대 차트를 표시합니다.
라이브 셀 공 촛점 이미징 실험의 3 설치 그림. A) 사용자 정의 챔버는 점토와 탈지면의 네 조각과 슬라이드, 커버 슬립과 함께 내장되어 있습니다. 두 오일 된 모종은 슬라이드에 배치됩니다. 폴리에틸렌 관의 일단은 조립 실의 옆에 배치되고 고정된다타단 플렉시 만든 1ml를 주사기. B) 정의 슬라이드에 연결되어있는 동안 테이프 조각 중간 채널의 양측에 연결되는 두 개의 채널의 개방 챔버를 갖는다. 하나의 커버 슬립을 슬라이드의 상부에 배치되어 두 폴리에틸렌 관은 채널에 배치된다. 커버 슬립 및 튜브는 실리콘 그리스와 위치에 고정되어 있습니다. 튜브 중 하나의 단부는 1 ml의 시린지에 연결되고 다른 튜브의 단부는 개방 유지된다. 오래된 오일은 모 챔버 내에 배치되고 coveslip는 경종의 상단에 놓고 실리콘 그리스로 밀봉된다. 조립 챔버와 plexigalss 슬라이드는 현미경의 스테이지에 배치됩니다. C) 애기 모종은 MS의 phytagel의 0.6 %의 얇은 층을 포함하는 챔버 커버 유리의 오른쪽에서 왼쪽이 우물 () 또는 8 우물 ()에서 재배되는 미디어.
그림 4 세포질과 핵 칼슘 염 스트레스에 응답하여 진동. A) 공 초점 이미지 Case12이 세포질 루트 세포 (왼쪽 패널)과 Case12을 표현 형질 전환 식물의 잎 세포 (오른쪽 패널)의 핵으로 표현되는 것을 알 수있다. 오른쪽 패널의 이미지는 엽록체의 빨간색 형광도 및 Case12. B의 녹색 형광)의 소금 칼슘 세포질에서 진동 (상단 패널에 의한 스트레스 (150 mM의 염화나트륨)) 및 핵 (하판)의 병합 된 이미지입니다 루트 세포. 측정 셀의 위치는 패널의 숫자와 화살표로 표시됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 애기 장대 모종의 공간 - 시간 칼슘 응답을 기록하는 FAS 시스템을 증명하고있다. 이 FAS 칼슘 기록 시스템은 칼슘 여기되게됩니다 비 생물 적 스트레스 자극뿐만 아니라 다양한 자극에 의해 발생 2 + 역 동성을 측정하기 위해 적용 할 수있는, 간단한 민감하고 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 쉽게 전체 플랜트 레벨에서 조직 - 또는 자극 특정 시공간 칼슘 역학을 비교할 수있다. FAS의 고감도 고강도 응력을 사용할 때 셀에 물리적 손상으로 인한 아티팩트를 방지하는 것이 중요하다 칼슘 응답을 조사하기위한 저 강도의 자극을 사용할 수있다. 다른 생리 학적 단계에서 모종은 주어진 자극에 대한 응답으로 다른 민감도와 특이도를 가질 수 있지만 십일 애기 모종 세븐, 조직 또는 자극 특정 칼슘 반응을 보였다. 따라서이다약 100 모종 필름의 한 조각에 부착 될 수있는 FAS 측정의 처리량을 증가시키기 7~10일 오래 묘를 사용하는 것이 바람직. 함께 쉽고 간단 성과, 높은 감도와 재현성, FAS 시스템은 변경 칼슘 응답을 EMS 돌연변이 변이체를 선별하도록 구성 될 수있다. 스크리닝 목적을 위해, 또한 필름 상에 접시에 성장 및 접착 균일 모종을하는 것이 중요하다. H-CTZ 필름 부착 모종의 4 ~ 5 시간 배양 애큐 오린의 재구성을위한 충분합니다. apoaequorin 및 보조 인자의 반응이 산소를 필요로하기 때문에 구멍이 접착 필름을 사용하는 것은 바람직하다. 동일한 필름으로부터 모종 원래의 그룹을 사용하여 조직 또는 특정 자극 - 칼슘 응답의 비교를 위해 중요하므로 모종 및 / 또는 재구성 조건 기능적 애큐 오린의 총량에 영향을 미칠 수있는 상태. 때 이러한 requiremeNTS는 발광 응답의 차이는 조직 - 특이 혹은 자극 칼슘 응답에 비례 충족.
애큐 오린 칼슘 신호 기반 측정은 세포 집단의 반응을 반영한다. 그러나, 세포 유형 및 / 또는 자극에 대한 조직의 세포의 다른 접근성의 이질성을 고려하여, 애큐 오린의 결과를 기반 칼슘 측정은 하나의 셀의 동작 동일시하지 않는다. 세포 수준에서 칼슘에게 2 + 역 동성을 이해하는 것은 세포 내 해상도로 검출 할 수있는 칼슘 2 + 표시가 필요합니다. 형광 단백질의 라이브 세포 공 촛점 이미징 (FP)는 칼슘 지표 원하는 조직 세포 해상도로 세포 칼슘 역학을 기록하는 고급 칼슘 감지 시스템을 제공 기반. 여기에, 라이브 셀 공 촛점 이미징 및 FP 기반 칼슘 지표를 사용하여, 우리는 세포 내 칼슘을 기록 2 + 칼슘 지표 두 종류의 서로 다른 특성을 갖는 식물체에서 구현되었다. YCS에 비해 단일 GFP 기반 칼슘 지표는 몇 가지 장점이 있습니다 : 1 Case12이 YFP와 CFP 필터 설정하거나 많은 가정 및 FRET (22) 측정에 필요한 복잡한 계산을 필요로하지 않습니다. Case12 단일 여기 / 발광 최대 값을 가지며 용이 표준 GFP 필터 세트를 이용하여 검출 할 수있다. 2 Case12 생리적 산도에서 안정하고, 상대적으로 작은 단백질 (46 kDa의)입니다. 식물에서 발현시 형질 전환 식물 Case12 동시에 세포질과 핵 칼슘 역학을 추적하는 데 사용될 수 있도록, 비 - 표적 Case12는 세포질뿐만 아니라 핵에 나타난다. 이 리포터의 단점은 비 비율 적 지표이므로, 형광 레벨은 또한 발현 수준과 같은 칼슘 2 + 농도에 관련이없는 요인에 의해 영향을받는 것입니다Case12 지역의 pH. 그럼에도 불구하고, Case12 같은 실험 조건에서 서로 다른 유전 적 배경을 가진 물질 사이의 공간 - 시간 칼슘 세포질에서 역학과 세포 소기관의 비교를위한 세포 칼슘 농도를 결정하기에 적절하다. 앞으로 새로운 GFP 세포 녹음 더 나은 지표가 될 나에 칼슘에게 2 + 역 동성을 subcelluar 수, 칼슘에게 동물에서 입증 GCaMP3 24 GCaMP5 25와 같은 높은 신호 대 잡음 비율, 빠른 반응 속도와 더 큰 응답과 2 + 지표를 기반으로 식물.
여기에 설명 및 애큐 오린 Case12 탐지 시스템은 생체 내에서 비파괴가 각각 온 및 모 세포 내 수준에서 시공간 칼슘 동역학 측정을 위해 접근 제공한다. 두 시스템 모두에서, 생리 학적 상태 또는 성장 조건은 CA에게 모종 또는 셀의 2 + 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. physica 경우에서야 좋은 조건에서 재배 손상 여부, 세포가 약하거나 심지어 더 칼슘 응답을 가질 수있다. 또한, 시공간 칼슘 신호의 지속 시간은 또한 측정시 종묘의 조건에 의해 영향을 받는다. 발광 또는 형광 신호는 시간 경과에 의한 자극에 의해 유도 된 손상을 감소 및 / 또는 공 초점 화상의 경우 레이저 광 - 유도 손상있다. 자극 유발 된 손상을 회피 할 수는 없지만, 광독성 레이저 노광의 강도 및 / 또는 주파수를 제한함으로써 감소 될 수있다. 또한, 애큐 오린 기반 칼슘 기록 시스템은 재구성 단계가 필요하다. 셀 및 / 또는 CTZ와 apoaequorin의 반응 CTZ의 확산을 방해하는 요인이 칼슘 농도에 관련된 발광 신호에 영향을 미칠 것이다. 따라서 CTZ의 농도뿐만 아니라, 재생 시간 및 CTZ 배양 조건은 최고의 감도와 reproducibil 대해 최적화 될 필요성만. 유전자 인코딩 칼슘 지표 부정확 의도하지 않은 특정 세포 내 구획, 온도 감도, 세포의 Ca2는 기계 (23) 신호 +와 기자의 간섭으로 대상을 포함, 다른 이유로 휴대 칼슘 농도를보고 할 수 있습니다. 우리는 애큐 오린 또는 Case12 표현하는 식물은 변경된 스트레스 내성 등의 명백한 형태 나 조건 표현형이없는 것으로 나타났습니다. 따라서이 유전자 인코딩 칼슘 지표 식물에 신호 칼슘 2와 주요 간섭이 거의 없습니다.
요약하면, 우리는 전체 식물 묘목 및 세포 내 수준 모두에서 공간과 시간적 카에게 2 + 신호를 측정 여기이 칼슘 감지 시스템의 사용에 대한 자세한 지침을 제시한다. 이러한 두 시스템은 조직 (또는 세포 유형) 또는 자극 특정 칼슘 고감도 동적 패턴을 결정하기 위해 사용될 수 있고재현성. 따라서 그들은 다양한 환경 신호에 반응하여 칼슘 신호의 기초 유전자 네트워크를 해명하기위한 강력한 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
