Summary
Ca 2 + signale regulerer diverse biologiske prosesser i planter. Her presenterer vi tilnærminger for å overvåke abiotiske stresset indusert romlig og tidsmessig Ca 2 +-signaler i Arabidopsis celler og vev ved hjelp av genetisk kodet Ca 2 + indikatorer Aequorin eller Case12.
Abstract
Utviklings og miljømessige signaler indusere Ca 2 + svingninger i planteceller. Stimulus-spesifikke romlige-temporal Ca 2 + mønstre blir detektert av cellulære Ca 2 + bindende proteiner som setter i gang Ca 2 + signal kaskader. Men vi vet fortsatt lite om hvordan stimulans bestemt Ca 2 +-signaler genereres. Spesifisiteten til et Ca 2 +-signal kan tilskrives den raffinerte regulering av aktivitetene til Ca 2 +-kanaler og / eller transportører som reaksjon på et gitt stimulus. Å identifisere disse cellulære komponenter og forstå deres funksjoner, er det avgjørende å bruke systemer som tillater en følsom og robust opptak av Ca 2 +-signaler på både vev og cellulære nivåer. Genetisk kodet Ca 2 + indikatorer som er målrettet mot ulike cellulære avdelinger har gitt en plattform for levende celle confocal avbildning av cellulære Ca 2 +-signaler. Her beskriver vi instruksjons for bruk av to Ca 2 + deteksjonssystemer: aequorin basert FAS (film selvklebende frøplanter) luminescens Ca 2 + bildebehandling og case12 basert levende celle confocal fluorescens Ca 2 + bildebehandling. Luminescens bildebehandling bruker FAS system gir en enkel, robust og sensitiv deteksjon av romlige og tidsmessige Ca 2 +-signaler på vevet nivå, mens levende celle confocal avbildning ved hjelp Case12 gir samtidig påvisning av cytosolisk og kjernefysiske Ca 2 +-signaler med høy oppløsning.
Introduction
Den plantecelle svarer til miljøet via signalering som koordinerer celle handlinger. En tidlig cellesignaleringshendelse som respons på miljømessige stimuli er en forbigående økning Ca 2 +. Mønsteret, eller signaturen til en forbigående økning i frie Ca 2 + konsentrasjon er preget av sin amplitude, frekvens og varighet. Distinkte spatio-temporale Ca 2 + signaturer regulere ulike cellulære aktiviteter en. Spesifikke stimuli, som for eksempel varme, kulde, salt, tørke, lys eller plantehormoner, kan fininnstille spatio-temporal aktivitet av membran-lokaliserte Ca 2 + kanaler og / eller transportører, noe som resulterer i konkrete Ca 2 + signaturer. Selv Ca 2 + transportører har blitt godt preget, er lite kjent om de molekylære identiteter og funksjoner av Ca 2 + kanaler i planter en. Genetiske skjermer for mutanter med endret Ca 2 + reaksjon på stress stimuli kan være en effektiv caoach for å identifisere de komponentene som utgjør Ca 2 + signaturer. Nylig flere Aequorin basert Ca 2 + deteksjonssystemer har blitt utviklet som lette genetiske skjermer for Ca 2 + signale komponenter som svar på patogen angrep og abiotiske stresset 2-4.
Aequorin ble først brukt til å oppdage Ca 2 +-signaler i planter i begynnelsen av 1990-tallet fem. Siden da, har Aequorin blitt rettet til forskjellige cellulære avdelinger, slik som cytoplasma 5, kjernen 6, 7 kloroplaster, tonoplast 8, mitokondrier 9, og stroma 10, så vel som til forskjellige celletyper i roten for å overvåke cellespesifikk Ca 2 + signaler 11. Aequorin basert Ca 2 + målinger avsløre romlig og tidsmessig Ca 2 + respons av en populasjon av celler mot stress stimuli. Men i de fleste tilfeller, Ca 2 + reaksjoner fra enkeltceller er unsynchronized i respons vevet 4. Derfor ikke Aequorin Ca 2 + opptak ikke nødvendigvis rapportere Ca 2 +-signalet i enkeltceller. I de senere årene, genetisk kodet fluorescerende protein (FP) -baserte Ca 2 + indikatorer, som gul Cameleon (YCS) 12 og CASEs12 13 har blitt brukt til å studere Ca 2 + signaliserer med høy subcellulære oppløsning. YCS er fluorescens resonans energi overføring (FRET) -baserte Ca 2 + indikatorer, som inneholder CFP og YFP varianter koblet av Ca 2 + -binding protein calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Calmodulin gjennomgår en konformasjonsendring som det binder seg til Ca 2 +, og dermed bringer CFP og YFP tettere sammen, noe som resulterer i økt energioverføring (forbedret FRET). Gnage nivå over tid, omtrent beregnes som forholdet mellom YFP til CFP signalintensitet, reflekterer intracellulær Ca 2 + dynamikk. Flere YC versjoner har blitt brukt i planter. YC3.6 var targeted til cytosol 14,15, nucleus 16, mitokondrier 17, og plasma membran 18, og YC4.6 og D4ER ble rettet til ER 15,19, og D3cpv var rettet til de peroxisomes 20. Transgene planter som uttrykker YCS tillate live-cell imaging av Ca 2 + dynamikk innenfor ulike cellulære avdelinger av ulike celletyper. Tilfeller (formodentlig Ca lcium se nsor) er single sirkulært permuted fluorescerende proteiner (cpFPs) skjuler en calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Ved binding til Ca 2 +, tilfeller gjennomgå konformasjonsendringer, som fører til en økning av fluorescens intensitet. Korrelasjonen mellom sakens fluorescens respons og Ca 2 + konsentrasjon gjør at intracellulær Ca 2 + dynamikk måles kvantitativt. Den Case12 varianten har 12 ganger økt fluorescens i de Ca 2 + -saturated former. N. benthiminana planter forbigående exprEssing Case12 eller Arabidopsis planter stabilt uttrykker Sak 12 ble brukt til å studere Ca 2 + signalisering i forsvar og abiotiske stresset 4,21. Asynkron romlig og tidsmessig Ca 2 + svingninger i cellene reagerer på patogen angrep, eller til dehydrering stresset har blitt avslørt med Case12 basert Ca 2 + bildebehandling.
Her presenterer detaljerte instruksjoner for Aequorin basert luminescence avbildning av vevs- og stimuli bestemt Ca 2 + dynamikk i Arabidopsis frøplanter, og for konfokal avbildning av cytosolisk og kjernekraft Ca vi 2 + dynamikk i Arabidopsis rot celler som uttrykker Sak 12. Luminescence avbildning av FAS kunne tilpasses analysere stressrelaterte Ca 2 + dynamikk i intakte planter eller vev som ikke er beskrevet her, eller å skjerme mutageniserte Arabidopsis plantepopulasjoner for mutanter med endret stresset indusert Ca 2 +-signaler. Den levende celle Ca 2 + bildeoppsett kan tilpasses til å analysere Ca2 + dynamikk innenfor ulike subcelluar avdelinger eller i ulike celletyper bruker andre Ca 2 + indikatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aequorin Basert Ca 2 + Imaging Bruke FAS System
- Forbered frøplanter for luminescens bildebehandling. Sterilisere frø av Arabidopsis planter som uttrykker Aequorin med 10% blekemiddel løsning som inneholder 0,01% Triton-100. Purke sterile frø på en firkantet plate (10 x 10 cm firkantet petriskål med rutenett,) som inneholder full styrke MS (Murashige og Skoog Basal saltblanding), 1% sukrose, og 1,2% agar. Plasser platene vertikalt i et vekstkammer etter lagdeling ved 4 ° C i 2 dager (figur 1A).
- Overfør spirene på en film. Plasser en klebende film (figur 1B) på toppen av 7-10 dager gamle planter som vokser på plate. Skyv filmen for hånd for å sikre at frøplanter holde filmen (figur 1C). Peel filmen forsiktig slik at frøplantene forblir festet til filmen (figur 1D og 1E)
- Inkuber spirene med kofaktor. Plasser endhered frøplanter ut mot den firkantede plate (10 x 10 cm) inneholdende 15 ml 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazine) i vann. Inkuber frøplanter ved romtemperatur i 4 timer til over natten (figur 1F).
- Forbered luminescens imaging. Ta filmen ut av h-CTZ løsning og klippe den ned på midten, danner to stykker. Plasser hvert stykke film med frøplanter med forsiden opp i to forskjellige plater. La platene i mørket i 5 min.
- Erverve luminescens bilder. I mørket, plasserer de to plater ved siden av hverandre på fasen av luminescens avbildningssystem (figur 1G). Innhente bilder umiddelbart etter tilsette 20 ml stimuli løsningen til platene samtidig.
- Analyser luminescens bilder. Velge samme visningsområde for alle luminescens bilder. Beskjære regionen av interesse (ROI) og generere bildene som JPEG-filer (Figur 2A). Alternativt eksportere bildene som SPE format filer og importere dem inn iImageJ bildeanalyse programvare. Set målinger for beregning av gjennomsnittet grå verdien av ROI. Velg samme størrelse på ROI området og måle gjennomsnitts grå og presentere data som søylediagrammer (Figur 2b).
2. Levende Cell Confocal Ca 2 + Imaging
- Forbered frøplanter for confocal bildebehandling. Sterilisere frø av Arabidopsis planter uttrykker case12 med 10% blekemiddel løsning som inneholder 0,01% Triton. Sow sterilt frøene på en plate inneholdende full styrke MS-salter, 1% sakkarose og 1,2% agar. Plasser platene vertikalt i et vekstkammer etter stratifisering ved 4 ° C i 2 dager.
- Setup Imaging Chambers
- Sett sammen en bildekammeret ved hjelp av et lysbilde og dekkglass (Chamber A). Legg et stykke vann fuktet bomullsdott på midten av lysbildet. Deretter overfører en eller to 5 dager gamle frøplanter fra platen på toppen av vann fuktet bomullsdott. Stick små biter av leire til hvert hjørne av et dekk, end sted dekkglass på toppen av frøplanter å skape et gap (kammer) mellom dekkglass og lysbilde (figur 3A, venstre panel). Den ene enden av polyetylen-rør (diameter 0,58 mm) i en 1 ml sprøyte, og plasserer den andre enden av røret umiddelbart tilstøtende til kammeret. Hold slangen på plass med tape (figur 3A, høyre panel).
- Sett sammen en bildekammeret ved hjelp av en plexiglass kammeret (Chamber B).
- Spre et tynt lag av silikonfett rundt to polyetylen-rør (0,58 mm diameter) og trykker de belagte rør inn i kanalene på hver side av pleksiglasskammer (figur 3B venstre panel). Spre et tynt lag av silikonfett på overflaten av kammeret som inneholder røret sporene og trykker på en dekkglass inn i smørefett for å forsegle den ene siden av kammeråpningen (kuttet ut).
- Overfør en fem dagers gammel frøplante fra platen inn i kammeret og legge et stykke bomullsdott dynket med vann i topp of frøplante. Spre silikonfett på den andre overflate av kammeret, og et annet trykk på dekkglass på toppen for å forsegle. Koble enden av et av rørene til en 1 ml sprøyte. La enden av det andre røret åpen (figur 3B høyre panel).
- Forbered en avbildningskammeret ved hjelp av en kamret cover glass (Chamber C). Steriliser kammer cover glass med 70% etanol og la den på panseret til den er tørr. Tilsett 0,6 ml eller 0,2 ml av full styrke MS medium inneholdende 1% sukrose og 0,5% phytagel inn i hver brønn av en 2-well kammer eller en 8-brønners kammer (figur 3C høyre panel), henholdsvis. Sterilisere frø og sår frø direkte i et kammer dekkglass som inneholder et tynt lag med klar gel og la dem vokse vertikalt for 5 dager (Figur 3C).
- Hente bilder ved hjelp av en konfokal mikroskop. For å søke stresset stimuli, som for eksempel salt, kulde eller peroxide, sakte injisere ca 200 mL av 150 mM NaCl, is-cold vann eller 1 mM H 2 O 2-løsning inn i kammeret (kammer A eller B) like før skaffe bilder, eller tilsett 500 pl eller 100 pl av stimulus løsning på brønn av en med 2 eller 8-brønners kammer hhv . Ta bilder umiddelbart etter påføring av stimulus løsning ved hjelp av en omvendt Nikon A1R konfokal laser-scanning mikroskop med en 20X vann nedsenking objektiv (numerisk apertur 0,75). Samle en tidsserie med bilder på 4 sek intervaller med eksitasjon og utslippsbølgelengder av 488 nm og 500-550 nm, henholdsvis, og på en piksel oppløsning på 512 x 512.
- Bildeanalyse
Bruke Nikon Elements, ble Rois trukket rundt hver celle (eller område) av interesse. Total intensitet innenfor hver ROI ble målt over tid med dato Måling dialogboksen (ImageJ kunne brukes i stedet). Totale intensitet målinger ble eksportert og behandles i DataGraph. Ca 2 + pigg amplitude ble definert som peak intensitet minus hvile intensitet, varighet som the tid mellom initiering og gjennomføring av en pigg, og perioden som tidsintervallet mellom tilstøtende pigg toppene av to pigger t. -Test ble brukt til å sammenligne midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannitol, NaCl og H 2 O 2 ble brukt som proxyer for dehydrering, salt og oksidativt stress stimuli, henholdsvis. For å kontrollere om den tunge metallion Cu 2 + synergizes med en hvilken som helst av disse tre stress-stimuli, sammenlignet vi Ca2 + responsen til hver stimuli i nærvær eller fravær av Cu 2 +. Som vist i figur 2, FAS luminescens avbildning avslørte at Arabidoposis frøplanter reagert forskjellig på dehydrering, salt og oksidativt stress. For konsentrasjonen av stimuli vi undersøkt i denne studien, 75 mM NaCl indusert den sterkeste Ca 2 + respons i blader og røtter i løpet av første 40 sek eksponering (figur 2A midtpanelet og figur 2B), mens 1 mm H 2 O 2 indusert en sterk Ca 2 + respons både blader og røtter i løpet av første og andre 40 sek (figur 2A høyre panel). Løsningen på 400 mM mannitol bare indusertCa 2 + respons i røtter i løpet av de første 40-årene og svært svake signaler i blader i løpet av andre 40 sek. Cu 2+ sterkt forbedret amplitudene og varigheten av Ca 2 +-signaler utløst av NaCl og mannitol (Figur 2A venstre panel). Det ser ut til at Cu 2 + hadde hemmende effekter på H 2 O 2 indusert Ca 2 +-signaler, noe som reduserer både amplitude og varighet (figur 2A og 2B høyre panel).
Bruke Case12 uttrykke Arabidopsis planter, målte vi Ca 2 + dynamikk i cytosol og kjerner samtidig. Molekylvekt av Case12 er 46 kDa, således transgene planter som uttrykker Case12 har GFP signaler i begge cytosol og kjerner av blad og rot-celler (figur 4A). Tilpasset (figur 3A og 3B) eller kommersielle kamre (Figur 3C) ble brukt for live cell imaging med en confocalmikroskop. Bruk av 150 mM NaCl til frøplante i kammeret, observerte vi endringer av fluorescensintensiteten både i cytosol og kjernen av de enkelte celler (figur 4B og C; Tilsetnings Film 1). Ved hjelp av NIS-Elements (bildebehandling, Nikon Instruments Inc.), målte vi fluorescens intensitet i regioner av interesse (ROI) over tid. Den amplitude, varighet og hyppighet av cytosolisk Ca 2 + og kjerne oscillasjon er presentert grafisk i figur 4B. Den amplitude og periode av Ca 2 + toppene i cytoplasma og kjerner varierer sterkt mellom celler av samme rot, så vel som på tvers av celler i forskjellige røtter. Amplitude og periode med cytosoliske Ca 2 + toppene var 60.36 ± 45.22 AU (vilkårlig enhet) og 58.24 ± 15,70 sek, henholdsvis. Amplitude og periode med kjernefysiske Ca 2 + toppene var 316,26 ± 75,24 (AU) og 61.71 ± 16,31 sek, henholdsvis. I kontrast,varigheten av cytosoliske og kjernefysiske Ca 2 + toppene var lik mellom celler, som var 17,43 ± 3,67 sek og 17.33 ± 2 sek, henholdsvis. Amplituden av Ca 2 + pigger redusert over tid, som kan være på grunn av endringen i fokalplanet og / eller et tap av respons på stress stimuli på grunn av et ugunstig in vitro tilstand. Disse resultatene viser at salt stress utløser Ca 2 + svingning både i cytoplasma og cellekjernen.
Figur 1. Aequorin basert FAS-system for måling av romlig-temporale Ca 2 + dynamikk som svar på stress stimuli. A) Grow Arabidopsis frøplanter vertikalt på en plate inneholdende MS-mediet. B, C) Plasser en klebende film (B) på toppen av frøplanter (C). D, E) F) Inkuber frøplanter levd opp til filmen med 2 mikrogram / ml h-CTZ i vann i 4 timer. G) Kutt filmen ned på midten og legg hver del til en annen tom plate. La platene i mørket i 5 min. Apply samtidig kontrollere og stimuli løsninger (husk spirene helt dekket), og hente bilder umiddelbart. Målestokken er 5 cm.
Figur 2. Sammenligning av romlig-temporal Ca 2 + respons av 10 dagers frøplanter til ulike stress stimuli. A) En tidsserie av bilder av luminescens frøplanter utsettes for 400 mM mannitol og 400 mM mannitol pluss 1 mM CuCl 2 (A, venstre panel), 75 mM NaCl og 75 mM NaCl plus 1 mM CuCl2 (A, midtpanelet), og 1 mm H 2 O 2 eller 1 mm H 2 O 2 pluss 1 mM CuCl 2 (A, høyre panel). Øvre og nedre paneler av A er luminescens bilder ervervet under første 40 sek og andre 40 sek, henholdsvis. En intensitet skala bar indikerer en økning av luminescens signaler fra lav (svart) til høy (hvit). B) Bar diagram av gjennomsnittlig luminescence intensiteten av frøplanter i respons til de angitte stresset stimuli.
Figur 3. Oppsett av en levende celle confocal bildebehandling eksperiment. A) En tilpasset kammeret er bygget med et lysbilde, dekkglass med fire stykker av leire og vatt. To fem dager gamle frøplanter er plassert på lysbildet. En ende av en polyetylen rør er plassert ved siden av den monterte kammeret og festes meden stykker av båndet, mens den andre enden er koblet til en 1 ml sprøyte. B) En tilpasset glide laget med plexiglass har et åpent kammer i midten og to kanaler som er knyttet til de to sider av kanalen. En dekkglass er plassert på toppen av lysbildet og to POLYETHLENE rørene er plassert i kanalen. Dekkglass og rør er løst i stillingen med silikonfett. Den enden av et av rørene er forbundet til en 1 ml sprøyte, og den annen ende av røret er åpen. En 5 dagers gammel frøplante er plassert i kammeret, og en coveslip er satt på toppen av frøplante og forseglet med silikonfett. Den plexigalss lysbilde med den sammensatte kammeret er plassert på scenen av mikroskopet. C) Arabidopsis spirene dyrkes i to brønner (venstre) eller 8 brønner (til høyre) det kamret dekkglass som inneholder et tynt lag 0,6% av phytagel i MS media.
Figur 4. cytosoliske Ca 2 + og kjerne svingning i respons til salt stress. A) confocal bilder viser at Case12 er uttrykt i cytoplasma og kjerner av rot celler (venstre panel) og bladceller (høyre panel) av transgene planter som uttrykker Case12. Bildet på høyre panel er en sammenslått bilde av rød autofluorescence av kloroplaster og grønn fluorescens av Case12. B) Salt stress (150 mM NaCl) indusert Ca 2 + svingning i cytosol (øvre panel) og kjerner (nedre panel) av rot celler. Steder av de målte cellene er angitt med piler med tall på panelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist en FAS system for registrering av romlig-temporal Ca 2 + respons Arabidopsis frøplanter. Dette FAS Ca 2 + opptakssystem gir en enkel, følsom og robust tilnærming som kan tilpasses for å måle Ca 2 + dynamikk som utløses av ulike stimuli i tillegg til de abiotiske stress-stimuli som presenteres her. Ved hjelp av dette systemet kan vi enkelt sammenligne vevs- eller stimuli-spesifikke romlig-temporale Ca 2 + dynamikk på hele anlegget nivå. Den høye følsomheten til FAS tillater bruk av lav intensitet stimuli for behandlingen av Ca 2 + responser, noe som er viktig for å unngå artifakter forårsaket av fysiske skader på cellene når høyintensitets belastning anvendes. Syv til 10 dager gamle frøplanter Arabidopsis viste vev eller stimuli-spesifikke Ca 2 + respons, selv frøplanter ved forskjellige fysiologiske tilstander kan ha forskjellig sensitivitet og spesifisitet i respons til en gitt stimulus. Det er derforå foretrekke å bruke 7-10 dager gamle frøplanter for å øke gjennomstrømningen av FAS målinger, der rundt 100 frøplanter kan overholdes på ett stykke film. Sammen med lett og enkelt ytelse, høy sensitivitet og reproduserbarhet, kunne FAS-systemet også bli tilpasset for screening EMS mutageniserte mutanter for endrede Ca 2 + responser. For screening formål, er det avgjørende å ha ensartede frøplanter som er godt dyrket på plate, og levd på film. Fire til fem timer inkubasjon av film levd frøplanter med h-CTZ er vanligvis tilstrekkelig for tilberedning av aequorin. Ved hjelp av den klebende film med hull er å foretrekke fordi reaksjonen av apoaequorin og kofaktor krever oksygen. For sammenligning av vev eller stimuli-spesifikke Ca 2 + svar, ved hjelp av grupper av frøplanter opprinnelig fra den samme filmen er kritisk fordi staten av frøplanter og / eller tilberedning tilstanden kan påvirke den totale mengden av funksjonelle aequorin. Når disse requirements er oppfylt, vil forskjellen i luminescens reaksjon er proporsjonal med vevskulturer eller stimulus-spesifikke Ca 2 + respons.
Aequorin-basert måling av Ca 2 +-signaler reflekterer responsen av en populasjon av celler. Imidlertid vurderer heterogenitet av celletyper og / eller den annen tilgjengelighet av celler i vevene til stimuli, resultatene av Aequorin basert Ca 2 + målinger ikke tilsvare virkemåten til et hvilket som helst celle. Forstå Ca 2 + dynamikk på cellenivå krever en Ca 2 + indikator som kan oppdages med subcellulære oppløsning. Levende celle confocal avbildning av fluorescens protein (FP) -baserte Ca 2 + indikatorer gir en avansert Ca 2 + deteksjon system for registrering av mobilnettet Ca 2 + dynamikk med mobilnettet oppløsning i en ønsket vev. Her, ved hjelp av levende celle confocal bildebehandling og FP-baserte Ca 2 + indikatorer, registrerte vi subcellulær Ca 2 + 2 + indikatorer har blitt implementert i planter med ulike egenskaper. Sammenlignet med YCS, har enkelt GFP-baserte Ca 2 + indikator noen fordeler: 1. Case12 krever ikke YFP og CFP filtersett eller de mange forutsetninger og kompliserte beregninger for å måle FRET 22. Case12 har enkelt eksitasjon / emisjon maxima og kan lett oppdages ved hjelp av standard GFP filtersettet. 2. Case12 er stabilt ved fysiologisk pH, og er et forholdsvis et lite protein (46 kDa). Når uttrykt i planter, vises ikke-målrettede Case12 i cytoplasma og kjerner, så Case12 transgene planter kan brukes til å spore cytosoliske Ca 2 + og atom dynamikk samtidig. En ulempe ved denne reporteren er at det er en ikke-ratiometrisk indikator, slik at fluorescens-nivåer er også påvirkes av faktorer som ikke er relatert til Ca 2 + konsentrasjon, slik som uttrykket nivåetCase12 og lokale pH. Ikke desto mindre er Case12 tilstrekkelig å bestemme cellulær Ca 2 + konsentrasjon for sammenlikning av romlig-temporale Ca 2 + dynamikk i cytoplasma og organeller mellom materialer med forskjellige genetiske bakgrunner under de samme eksperimentelle betingelser. I fremtiden, ny GFP basert Ca 2 + indikatorer med høyere signal-til-støy-forhold, raske kinetikk og større respons, som GCaMP3 24 og GCaMP5 25 demonstrert i dyr, kan være bedre indikatorer for opptak mobil eller subcelluar Ca 2 + dynamikk i planter.
De Aequorin og Case12 deteksjonssystemer som er beskrevet her gir ikke-destruktiv in vivo tilnærminger for måling av romlig-temporale Ca 2 + dynamikk på hele frøplante og subcellulære nivåer, hhv. I begge systemer, kan den fysiologiske tilstand eller vekstbetingelser påvirke Ca 2 + responser av frøplantene eller celler. Hvis Physically skadet eller ikke vokst i god stand, kan cellene har svake eller ingen Ca 2 + svar. I tillegg er varigheten av romlige og tidsmessige Ca 2 +-signaler også påvirket av forholdene i frøplante under målingene. De luminescens eller fluorescens-signaler kan avta over tid på grunn av stimuli-indusert skade og / eller laser-induserte foto-skade i tilfelle av konfokal avbildning. Selv stimulus-fremkalt skade som ikke kan unngås, kan fototoksisitet reduseres ved å begrense intensiteten og / eller frekvensen for lasereksponering. I tillegg krever Aequorin basert Ca 2 + opptakssystem en rekonstituering trinn. Faktorer som avbryter spredning av CTZ til cellen og / eller reaksjon av apoaequorin med CTZ ville påvirke luminescens signaler som er knyttet direkte til Ca 2 + konsentrasjon. Derfor er konsentrasjonen av CTZ, samt varighet og betingelser for CTZ inkubering må optimaliseres for best mulig følsomhet og reproducibiltet. Genetisk kodet Ca 2 + indikatorer kan feilaktig rapportere cellulære Ca 2 + konsentrasjoner av andre grunner, inkludert utilsiktet mot bestemte subcellulære avdelinger, temperatur følsomhet, eller forstyrrelser av reporter med mobil Ca2 + signale maskiner 23. Vi fant at Aequorin eller Case12 uttrykker planter har ingen åpenbare morfologiske eller betinget fenotyper som endret stresstoleranse. Derfor er det lite sannsynlig at disse genetisk kodet Ca 2 + indikatorer har store forstyrrelser med Ca 2 + signalering i planter.
I sammendraget, presenterer vi her detaljerte instruksjoner for bruk av to Ca 2 + deteksjonssystemer for måling av romlig og tidsmessig Ca 2 +-signaler både på hele anlegget frøplante og subcellulære nivåer. Disse to systemer kan brukes for å bestemme vev (eller celle-type) eller stimuli spesifikke Ca 2 + dynamiske mønstre med høy følsomhet ogreproduserbarhet. Derfor er de kraftige verktøy for å belyse genet nettverk som ligger bak Ca 2 + signalisering i respons på ulike miljø signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
