Summary
Ca2 +-signalering reglerar olika biologiska processer i växter. Här presenterar vi metoder för övervakning av abiotisk stress rumsliga och tidsmässiga Ca2 +-signaler i Arabidopsis celler och vävnader med hjälp av genetiskt kodade Ca 2 + indikatorer aequorin eller Case12.
Abstract
Develop och miljömässiga signaler inducerar Ca2 + fluktuationer i växtceller. Stimulus specifika rumsliga-temporala Ca2 + mönster avkänns av cellulära Ca2 +-bindande proteiner som initierar Ca2 + signaleringskaskader. Men vi vet fortfarande lite om hur stimulans specifik Ca2 +-signaler genereras. Specificiteten för en Ca2 +-signal kan tillskrivas den sofistikerade reglering av verksamheten i Ca2 +-kanaler och / eller transportörer som svar på en given stimulus. För att identifiera dessa cellkomponenter och förstå deras funktioner, är det viktigt att använda system som möjliggör en känslig och robust inspelning av Ca2 +-signaler på både vävnad och cellulära nivåer. Genetiskt kodade Ca 2 + indikatorer som är inriktade på olika cellulära fack har gett en plattform för levande cell konfokala avbildning av cellulära Ca 2 +-signaler. Här beskriver vi instruktioners för att använda två Ca 2 + detekteringssystem: aequorin baserade FAS (film självhäftande plantor) luminiscens Ca 2 + avbildning och case12 baserade levande cell konfokala fluorescens Ca 2 + avbildning. Luminiscens avbildning med FAS-systemet ger en enkel, robust och känslig detektion av rumsliga och tids Ca2 +-signaler på vävnadsnivå, medan levande cell konfokala avbildning med Case12 ger samtidig detektion av cytosolic och nukleära Ca2 +-signaler med hög upplösning.
Introduction
Den växtcell reagerar på miljön via signalering som samordnar cell åtgärder. En tidig cell signalering händelse som svar på miljöstimuli är en transient Ca2 + ökning. Mönstret, eller underskrift av en övergående ökning i fri Ca2 + koncentrationen kännetecknas av sin amplitud, frekvens och varaktighet. Distinkta spatio-tempo Ca2 + signaturer reglerar olika cellulära aktiviteter 1. Specifika stimuli, såsom värme, kyla, salt, torka, ljus eller växthormoner, kan finjustera tid och rum aktivitet membran lokaliserad Ca2 +-kanaler och / eller transportörer, vilket resulterar i specifika Ca 2 + underskrifter. Även Ca 2 + transportörer har väl definierade, lite är känt om de molekylära identiteter och funktioner för Ca2 +-kanaler i anläggningar 1. Genetiska skärmar för mutanter med förändrad Ca 2 + svar på stress stimuli kan vara ett effektivt caoach för att identifiera de komponenter som utgör Ca2 + signaturer. Nyligen flera Aequorin baserade Ca 2 + detekteringssystem har utvecklats som underlättar genetiska skärmar för Ca2 + signalering komponenter som svar på patogener attack och abiotisk stress 2-4.
Aequorin användes först för att detektera Ca2 +-signaler i fabriker i början av 1990-talet 5. Sedan dess har Aequorin riktats till olika cellulära avdelningar, till exempel cytoplasman 5, kärnan 6, kloroplaster 7, tonoplast 8, mitokondrier 9, och stroma 10, samt till olika celltyper i roten för att övervaka cellspecifika Ca 2 + signaler 11. Aequorin baserade Ca2 + mätningar avslöjar den rumsliga och tidsmässiga Ca 2 + svar på en population av celler för att betona stimuli. Men i de flesta fall, den Ca2 + svaren av enskilda celler är unsynchronized i den svarande vävnaden 4. Därför gör Aequorin Ca 2 + inspelning inte nödvändigtvis rapportera Ca2 +-signalen i enskilda celler. Under de senaste åren, genetiskt kodade fluorescerande protein (FP) baserade Ca 2 + indikatorer, till exempel gult came (YCS) 12 och CASEs12 13 har använts för att studera Ca2 + signalering med hög subcellulär upplösning. YCS är fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-baserade Ca2 + indikatorer, innehållande GFP och YFP-varianter länkade av Ca2 + -bindande proteinet kalmodulin och kalmodulinbindande peptid M13. Calmodulin genomgår en konformationsändring som det binder till Ca2 +, därigenom närmar gemensamma fiskeripolitiken och YFP närmare varandra, vilket resulterar i ökad energiöverföring (förstärkt FRET). FRET-nivå över tiden, beräknat grovt som förhållandet YFP till GFP signalintensiteter, återspeglar den intracellulära Ca2 + dynamik. Flera YC versioner har använts i växter. YC3.6 var targeted till cytosolen 14,15, kärnan 16, mitokondrier 17 och plasmamembran 18, och YC4.6 och D4ER var riktade till ER 15,19 och D3cpv var riktad till peroxisomer 20. Transgena växter som uttrycker YCS tillåta live-cell-avbildning av Ca2 + dynamiken i olika cellulära fack i olika celltyper. Fall (förmodligen Ca lcium se nsor) är ensamstående cirkulärt permuterat fluorescerande proteiner (cpFPs) hyser ett calmodulin och kalmodulinbindande peptid M13. Vid bindning till Ca2 +, CASEs genomgå konformationsförändringar, vilket leder till en ökning av fluorescensintensiteten. Korrelationen mellan CASE s fluorescens respons och Ca2 + koncentrationen möjliggör intracellulär Ca2 + dynamik som skall mätas kvantitativt. Den Case12 varianten har 12 gånger ökad fluorescens i Ca2 + -saturated former. N. benthiminana växter transient exprEssing Case12 eller Arabidopsis plantor stabilt uttrycker Case 12 användes för att studera Ca2 +-signalering i försvar och abiotisk stress 4,21. Asynkron rumsliga och tidsmässiga Ca2 + svängningar i celler som svarar på patogen attack, eller till uttorkning stressen har uppenbarats med Case12 baserade Ca 2 + avbildning.
Här presenterar vi detaljerade instruktioner för Aequorin baserade luminiscens avbildning av vävnader och stimuli specifika Ca2 + dynamik i Arabidopsis plantor och för konfokal avbildning av cytosolic och nukleära Ca2 + dynamik i Arabidopsis rot celler som uttrycker mål 12 Luminiscens avbildning av FAS skulle kunna anpassas för att analysera stressinducerade Ca 2 + dynamik i intakta växter eller vävnader som inte beskrivs här, eller för att screena muterade Arabidopsis växtpopulationer för mutanter med förändrad stress Ca 2 +-signaler. Den levande cell Ca 2 + imaging inställning skulle kunna anpassas för att analysera Ca2 + dynamik inom olika subcelluar fack eller i olika celltyper med hjälp av andra Ca2 + indikatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Aequorin Based Ca 2 + Imaging Använda FAS System
- Förbered plantor för luminiscens avbildning. Sterilisera frön av Arabidopsis plantor som uttrycker Aequorin med 10% blekmedel lösning innehållande 0,01% Triton-100. Sås de sterila frön på en kvadratisk platta (10 x 10 cm fyrkantig petriskål med galler,) som innehåller full styrka MS (Murashige och Skoog Basal saltblandning), 1% sackaros och 1,2% agar. Placera plattorna vertikalt i en tillväxtkammare efter skiktning vid 4 ° C under 2 dagar (Figur 1A).
- Överför de plantor på en film. Placera en limfilm (Figur 1B) på toppen av 7-10 dagar gamla plantor som växer på plattan. Tryck försiktigt filmen för hand för att säkerställa att plantor hålla sig till filmen (Figur 1C). Skala filmen försiktigt så att plantorna förblir följt filmen (Figur 1D och 1E)
- Inkubera plantorna med kofaktor. Placera endhered plantor har laddats in i kvadratisk platta (10 x 10 cm) innehållande 15 ml av 2 ^ g / ml h-CTZ (coelenterazin) i vatten. Inkubera plantorna i rumstemperatur i 4 timmar till över natten (Figur 1F).
- Förbered för luminiscens avbildning. Ta filmen ur h-CTZ-lösning och skär den i mitten, bildar två stycken. Placera varje bit av film med plantor sidan upp i två olika plattor. Låt plattorna i mörker i 5 min.
- Skaffa luminiscens bilder. I mörkret, placera de två plattorna bredvid varandra på scenen av den luminiscens avbildningssystemet (figur 1G). Hämta bilder omedelbart efter tillsats av 20 ml av stimuli lösning till plattorna samtidigt.
- Analysera luminiscens bilder. Välj samma visningsintervall för alla luminiscens bilder. Beskär regionen av intresse (ROI) och generera bilderna som JPEG-filer (Figur 2A). Alternativt exportera bilderna som SPE-format och importera dem tillImageJ bildanalysmjukvara. Ange mått för beräkning av medelvärdet gråa värdet av ROI. Välj samma storlek på ROI området och mäter de genomsnittliga gråa och presentera data som stapeldiagram (Figur 2B).
2 Levande cell Confocal Ca 2 + Imaging
- Förbered plantor för konfokal avbildning. Sterilisera frön av Arabidopsis plantor som uttrycker case12 med 10% blekmedel lösning innehållande 0,01% Triton. Sås de sterila frön på en platta som innehåller full styrka MS-salter, 1% sackaros och 1,2% agar. Placera plattorna vertikalt i en tillväxtkammare efter skiktning vid 4 ° C under 2 dagar.
- Inställnings Imaging Chambers
- Montera en avbildning kammare med hjälp av en bild och täckglas (kammare A). Lägg en bit vatten indränkt bomull på mitten av bilden. Överför sedan en eller två 5 dagar gamla plantor från plattan på toppen av vatten indränkt bomull. Stick små bitar av lera till varje hörn av ett täckglas, end plats täck på toppen av plantor för att skapa ett gap (kammare) mellan täckglas och skjut (Figur 3A, till vänster). Anslut en ände av polyetenrör (0,58 mm diameter) till en 1 ml spruta och placera den andra änden av röret i direkt anslutning till kammaren. Håll slangen på plats med tejp (Figur 3A, högra panelen).
- Montera ett avbildningskammaren med användning av en plexiglaskammare (kammare B).
- Bred ett tunt lager silikonfett kring två polyetenrör (0,58 mm diameter) och tryck de belagda rören in i kanalerna på varje sida av plexiglaskammare (figur 3B vänstra panelen). Sprid ett tunt skikt av silikonfett på ytan av den kammare, som innehåller rörde spåren och tryck på ett täckglas i fett för att täta en sida av kammaröppningen (klipp ut).
- Överför en fem dagars gammal planta från plattan in i kammaren och placera en bit bomull indränkt med vatten på toppen of plantan. Bred silikonfett på den andra ytan av kammaren, och trycker på en annan täckglas ovanpå för att täta. Anslut änden av ett av rören till en 1 ml spruta. Lämna i slutet av det andra röret öppet (Figur 3B höger panel).
- Förbered en avbildning kammare med hjälp av en chambered täckglas (avdelningen C). Sterilisera chambered täckglas med 70% etanol och lämna den på huven tills det är torrt. Lägg 0,6 ml eller 0,2 ml av full styrka MS-medium innehållande 1% sackaros och 0,5% Phytagel i varje brunn i en 2-brunnars kammare eller en 8-brunnars kammare (figur 3C höger panel), respektive. Sterilisera frön och så frön direkt i en chambered täckglas som innehåller ett tunt lager klar gel och låta dem växa vertikalt under 5 dagar (Figur 3C).
- Förvärva bilder med hjälp av en konfokalmikroskop. För att ansöka stresstimuli, såsom salt, kyla eller peroxid, sakta injicera cirka 200 l av 150 mM NaCl, ice-cold vatten eller 1 mM H 2 O 2-lösning in i kammaren (kammare A eller B) precis före förvärva bilder, eller försiktigt lägga 500 l eller 100 l av stimulans lösning på brunnen i en 2-eller 8-väl kammare respektive . Ta bilder omedelbart efter applicering av stimulans-lösning med ett inverterat Nikon A1R konfokala laserskanning mikroskop med en 20X nedsänkning i vatten lins (numerisk bländare 0,75). Samla en tids serie bilder på 4 sek intervaller med excitation och emissionsvåglängder av 488 nm och 500-550 nm, respektive, och vid en upplösning på 512 x 512.
- Bildanalys
Genom att använda Nikon Elements ades ROI dras runt varje cell (eller area) av intresse. Total intensitet inom varje ROI mättes över tiden med hjälp av tidsmätnings dialogrutan (ImageJ skulle kunna användas i stället). Totalt intensitetsmätningar exporterades och bearbetas i DataGraph. Ca 2 + spik amplitud definierades som toppintensitet minus vila intensitet, duration som the tid mellan initiering och slutförande av en spik, och period som tidsintervallet mellan angränsande spik toppar på två spikar. t-test användes för att jämföra de medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannitol, NaCl och H2O 2 användes som ombud för uttorkning, salt och oxidativ stress stimuli, respektive. För att kontrollera om tungmetalljoner Cu 2 + synergistiskt med någon av dessa tre spännings stimuli, vi jämförde Ca 2 + svar på varje stimuli i närvaro eller frånvaro av Cu 2 +. Såsom visas i fig 2, avslöjade FAS luminiscens avbildning som Arabidoposis plantor svarade olika på uttorkning, salt och oxidativ stress. För koncentrationen av stimuli som vi som granskats i denna studie, 75 mM NaCl inducerade den starkaste Ca 2 + svar på blad och rötter under den första 40 sekunder av exponering (Figur 2A mittpanelen och figur 2B), medan 1 mM H 2 O 2 inducerad ett starkt Ca 2 + svar i både blad och rötter under första och andra 40 sek (Figur 2A högra panelen). Lösningen av 400 mM mannitol endast induceradCa 2 + svar i rötter under de första 40-talet och mycket svaga signaler i bladen under andra 40 sek. Cu2 + starkt förbättrat amplituder och varaktighet Ca2 +-signaler utlöses av NaCl och mannitol (Figur 2A vänstra panelen). Det framgår att Cu2 + hade hämmande effekter på H 2 O 2-inducerad Ca2 +-signaler, vilket minskar både amplituden och varaktigheten (Figur 2A högra panelen och 2B).
Använda Case12 uttrycker Arabidopsis plantor, mätte vi Ca2 + dynamiken i cytosolen och kärnor samtidigt. Molekylvikt på Case12 är 46 kDa, alltså transgena växter som uttrycker Case12 har GFP signaler i både cytosolen och kärnor av blad och rot celler (Figur 4A). Anpassad (Figur 3A och 3B) eller kommersiella kammare (Figur 3C) användes för levande cell imaging med en konfokalmikroskop. Tillämpa 150 mM NaCl till plantan i kammaren, observerade vi förändringar av fluorescensintensitet både i cytosolen och kärnan i de individuella cellerna (figur 4B och C; Kompletterande Movie 1). Använda NIS-Elements (Imaging programvara, Nikon Instruments Inc.), mätte vi fluorescensintensiteten i regioner av intresse (ROI) över tid. Amplituden, varaktighet och frekvens cytosoliska och nukleära Ca2 + svängning presenteras grafiskt i figur 4B. Amplituden och period av Ca 2 + spikar i cytoplasman och kärnorna varierar kraftigt mellan celler av samma rot, liksom över celler i olika rötter. Den amplitud och period av cytosoliska Ca 2 + spikar var 60.36 ± 45.22 AU (godtycklig enhet) och 58.24 ± 15,70 sek, respektive. Den amplitud och period av kärn Ca 2 + spikar var 316,26 ± 75.24 (AU) och 61.71 ± 16.31 sek, respektive. I motsats härtillvaraktighet cytosoliska och nukleära Ca2 + spikar var liknande mellan celler, som var 17.43 ± 3,67 sek och 17.33 ± 2 sek, respektive. Amplituden av Ca 2 + spikar minskade med tiden, vilket kan bero på den ändrade fokalplanet och / eller en förlust av svar att betona stimuli på grund av en ogynnsam in vitro skick. Dessa resultat visar att salt stress utlöser Ca2 + oscillation i både cytoplasman och kärnan.
Figur 1 Aequorin baserade FAS system för att mäta rumslig-tids Ca2 + dynamik som svar på stress stimuli. A) Grow Arabidopsis plantor vertikalt på en platta som innehåller MS media. B, C) ut en självhäftande film (B) på toppen av plantor (C). D, E) F) Inkubera plantorna vidhäftade filmen med 2 mikrogram / ml h-CTZ i vatten under 4 timmar. G) Skär filmen i mitten och placera varje bit till en annan tom tallrik. Låt plattorna i mörker i 5 min. Ansök samtidigt styra och stimuli lösningar (se plantorna är helt täckt) och hämta bilder direkt. Skalan bar är 5 cm.
Figur 2 Jämförelse av spatial-temporal Ca2 + svar av 10 dagars plantor till olika stress stimuli. A) En tidsserie för luminiscens bilder av plantor utsattes för 400 mM mannitol och 400 mM mannitol plus 1 mM CuCl2 (A, vänster panel), 75 mM NaCl och 75 mM NaCl plus 1 mM CuCl2 (A, mellersta panel) och 1 mM H 2 O 2 eller 1 mM H 2 O 2 plus 1 mM CuCl2 (A, högra panelen). Övre och nedre paneler av A är luminiscens bilder förvärvas under första 40 sek och andra 40 sek, respektive. En intensitet skalfältet indikerar en ökning av luminescens-signaler från låg (svart) till högt (vitt). B) Stapeldiagram av genomsnittlig luminescensintensiteten av plantor som svar på de angivna stresstimuli.
Figur 3 Inställning av en levande cell konfokala imaging experiment. A) En anpassad kammare är byggd med en slid, täckglas med fyra bitar av lera och vadd. Två 5 dagar gamla plantor placeras på objektglaset. Den ena änden av ett polyetenrör är placerad intill den monterade kammare och fixerades meden tejpbitar medan den andra änden är ansluten till en 1 ml spruta. B) En anpassad slide gjord med plexiglas har en öppen kammare i mitten och två kanaler som är anslutna till de två sidorna av kanalen. Ett täckglas placeras på toppen av bilden och två Polyethlene Rören placeras i kanalen. Täckglas och rören fixeras i position med silikonfett. Slutet på ett av rören är anslutet till en 1 ml spruta och änden av ett annat rör förblir öppen. En 5 dagars gammal planta placeras i kammaren och en coveslip sätts på toppen av plantan och förseglas med silikonfett. Den plexigalss bild med den sammansatta Kammaren står på scenen i mikroskop. C) Arabidopsis plantor odlas i två brunnar (vänster) eller 8 brunnar (höger) i chambered täckglas som innehåller ett tunt lager på 0,6% av Phytagel i MS medier.
Figur 4 cytosoliska och nukleära Ca2 + svängning som svar på saltstress. A) Konfokala bilder visar att Case12 uttrycks i cytoplasman och kärnor av rot-celler (till vänster) och bladceller (högra panelen) av transgena växter som uttrycker Case12. Bilden på den högra panelen är en sammanslagen bild av rött autofluorescens av kloroplaster och grön fluorescens Case12. B) Salt stress (150 mM NaCl) inducerad Ca2 + oscillation i cytosolen (övre panelen) och kärnor (nedre fältet) i rotceller. Platser för de uppmätta cellerna indikeras med pilar med siffror på panelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat en FAS-systemet för inspelning av den rumsliga-temporala Ca2 + respons av Arabidopsis plantor. Denna FAS Ca 2 + inspelningssystem är en enkel, känslig och robust metod som skulle kunna anpassas för att mäta Ca 2 + dynamik som utlöses av olika stimuli utöver de abiotisk stress stimuli som presenteras här. Med hjälp av detta system kan vi enkelt jämföra vävnads- eller stimuli specifika spatial-temporala Ca2 + dynamiken på hela anläggningsnivå. Den höga känsligheten hos FAS tillåter användning av låg intensitet stimuli för att pröva Ca2 + svar, vilket är viktigt för att undvika artefakter orsakade av fysiska skador på celler när högintensiv belastning används. Sju till 10 dagar gamla Arabidopsis plantor uppvisade vävnad eller stimuli-specifika Ca 2 + svar, även plantor vid olika fysiologiska stadier kan ha olika känslighet och specificitet som svar på en given stimulus. Därför är detbättre att använda 7-10 dagar gamla plantor för att öka genomströmningen av FAS mätningar, där omkring 100 plantor kan följas på en bit av film. Tillsammans med snabbt och enkelt prestanda, hög känslighet och reproducerbarhet kunde FAS-systemet även anpassas för screening EMS muta mutanter för förändrade Ca2 + svar. För screeningsyfte, är det viktigt att ha enhetliga plantor som är väl odlas på plattan och vidhäftade på filmen. Fyra till fem timmars inkubation av film vidhäftat plantor med h-CTZ är vanligen tillräcklig för beredning av aequorin. Användning av självhäftande film med hål är att föredra eftersom reaktion apoaequorin och kofaktor kräver syre. För jämförelsen av vävnad eller stimuli-specifika Ca2 + svar, med hjälp av grupper av plantor ursprungligen från samma film är kritisk eftersom staten av plantor och / eller beredning tillstånd kan påverka den totala mängden funktionell aequorin. När dessa requirements uppfylls, skillnaden i luminiscens svar är proportionell mot vävnads eller stimulus specifik Ca 2 + svar.
Aequorin baserad mätning av Ca2 +-signaler återspeglar svaret från en population av cellerna. Men med tanke på heterogeniteten celltyper och / eller olika tillgängligheten av celler i vävnaderna till stimuli, resultaten av Aequorin baserade Ca 2 + mätningar inte motsvara beteendet hos någon cell. Förstå Ca 2 + dynamik på cellnivå kräver en Ca2 +-indikator som kan detekteras med subcellulär upplösning. Live cell konfokala avbildning av fluorescerande protein (FP) baserade Ca2 + indikatorerna ger en avancerad Ca2 + detektionssystem för registrering av cellulära Ca 2 + dynamik med cellupplösning i en önskad vävnad. Här, med hjälp av levande cell konfokala imaging och FP-baserade Ca2 + indikatorer, spelade vi subcellulära Ca2 + + indikatorer har genomförts i anläggningar med olika egenskaper. Jämfört med YCS, har enstaka GFP-baserade Ca 2 + indikator vissa fördelar: 1 Case12 kräver inte YFP och GFP filtersatser eller de många antaganden och komplicerade beräkningar som behövs för att mäta FRET 22. Case12 har enstaka excitation / emission maxima och lätt kan upptäckas med hjälp av standard GFP filter set. 2. Case12 är stabil under fysiologiskt pH, och är en relativt ett litet protein (46 kDa). När de uttrycks i växter, verkar icke öron Case12 i cytoplasman liksom kärnorna, så Case12 transgena växter kan användas för att spåra cytosoliska och nukleära Ca 2 + dynamik samtidigt. En nackdel med denna reporter är att det är en icke-ratiometrisk indikator, så fluorescens nivåer påverkas också av faktorer som inte är relaterade till Ca2 + koncentrationen, såsom uttrycksnivånCase12 och lokal pH. Ändå är Case12 tillräcklig för att bestämma cellulär Ca 2 + koncentrationen för jämförelse av spatial-temporal Ca2 + dynamiken i cytoplasman och organeller mellan material med olika genetiska bakgrunder under samma försöksbetingelser. I framtiden, nya GFP baserade Ca 2 + indikatorer med högre signal-till-brus-förhållande, snabb kinetik och större respons, liksom GCaMP3 24 och GCaMP5 25 påvisas hos djur kunde vara bättre indikatorer för inspelning cellulär eller subcelluar Ca 2 + dynamik i växter.
Aequorin och Case12 detekteringssystem som beskrivs här ger icke-förstörande in vivo metoder för mätning av rumsliga-temporala Ca2 + dynamiken på hela plantan och subcellulära nivåer, respektive. I båda systemen kan de fysiologiska staten eller tillväxtbetingelser påverkar Ca2 + svar plantorna eller celler. Om Physically skadad eller inte odlas i ett gott skick, kan celler har svaga eller ingen Ca 2 + svar. Dessutom är längden på rumsliga och tids Ca 2 +-signaler även av villkoren i plantan under mätningarna. Luminiscensen eller fluorescenssignaler kan minska med tiden på grund av stimuli-inducerade skador, och / eller laserinducerad fotoskador i fallet med konfokal avbildning. Även om stimulus-inducerad skador inte kan undvikas, kan fototoxicitet minskas genom att begränsa intensiteten och / eller frekvensen för laserexponering. Dessutom kräver Aequorin baserade Ca2 + inspelningssystem en beredning steg. Faktorer som stör spridningen av CTZ till cellen och / eller reaktion av apoaequorin med CTZ skulle påverka luminiscens signaler som är direkt relaterade till Ca2 +-koncentrationen. Därför koncentrationen av CTZ, samt tider och villkor för CTZ inkubation behöver optimeras för bästa känslighet och reproducibilheten. Genetiskt kodade Ca 2 + indikatorer kan felaktigt rapportera cellulära Ca 2 + koncentrationer av andra skäl, inklusive oavsiktlig inriktning på specifika subcellulära fack, temperaturkänslighet, eller störningar av reportern med den cellulära Ca2 + signalering maskiner 23. Vi fann att aequorin eller Case12 uttrycker växter har inga uppenbara morfologiska eller villkor fenotyper såsom förändrad stresstolerans. Därför är det osannolikt att dessa genetiskt kodade Ca 2 + indikatorerna har stora störningar med Ca2 + signalering i växter.
Sammanfattningsvis presenterar vi här detaljerade instruktioner för användning av två Ca 2 + detekteringssystem för mätning av geografiska och tidsmässiga Ca 2 +-signaler på både hela anläggningen plantor och subcellulära nivåer. Dessa två system kan användas för att bestämma vävnad (eller celltyp) eller stimuli specifika Ca2 + dynamiska mönster med hög känslighet ochreproducerbarhet. Därför är de kraftfulla verktyg som ger kunskaper genen nätverk som ligger bakom Ca2 +-signalering som svar på olika miljö ledtrådar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
