Summary
Muscle neurones sensoriels sont impliqués dans la signalisation propriocepteur et signalent également sur les événements métaboliques de l'Etat et des blessures liées. Nous décrivons une souris adulte in vitro préparation musculaire du nerf pour les études sur les afférences musculaires extensibles activé.
Abstract
Muscle neurones sensoriels innervant les fuseaux neuromusculaires et organes tendineux de Golgi codent des changements essentiels à la proprioception longueur et de force. Fibres afférentes supplémentaires surveillent d'autres caractéristiques de l'environnement musculaire, y compris métabolite accumulation, de la température, et des stimuli nociceptifs. Dans l'ensemble, une activation anormale des neurones sensoriels peut conduire à des troubles du mouvement ou des syndromes de douleur chronique. Nous décrivons l'isolement du long extenseur des orteils (EDL) musculaire et nerveuse pour l'étude in vitro des réponses afférentes étirement évoqué chez la souris adulte. Activité sensorielle est enregistré à partir du nerf avec une électrode d'aspiration et les afférences individuelles peut être analysé en utilisant un logiciel de tri pic. In vitro préparations permettent des études bien contrôlées sur les afférences sensorielles sans les facteurs de confusion potentiels de l'anesthésie ou modifié perfusion musculaire. Nous décrivons ici un protocole pour identifier et tester la réponse des afférences de broche de muscle à l'étirement. Fait important,cette préparation prend également en charge l'étude des autres sous-types de afférences musculaires, des propriétés de réponse suite à l'application de la drogue et de l'incorporation des approches génétiques puissants et des modèles de la maladie chez les souris.
Introduction
Les muscles squelettiques sont innervés par les neurones sensoriels qui fournissent le système nerveux central des renseignements importants sur l'environnement musculaire. Les fuseaux neuromusculaires sont des structures composées de fibres encapsulées musculaires intrafusoriales qui se trouvent en parallèle avec les fibres musculaires extrafusales hautement spécialisés. Broches sont innervés par le groupe Ia et II afférences qui codent pour des changements dans la longueur du muscle et intrafusales ton de fibre est dynamique réglementés par les neurones moteurs innervant gamma 1. Groupe afférences Ib sont positionnés entre les fibres musculaires et de leurs insertions tendineuses et sont sensibles aux variations de la force musculaire, par exemple au cours de la contraction du muscle 2. Le groupe Ia, Ib et II afférences proprioceptives fournissent une rétroaction qui aide dans le contrôle moteur approprié. D'autres populations de afférences musculaires situées tout au long du muscle (groupes III et IV) servir pour signaler une accumulation metabolite, la présence de stimuli nociceptifs, et la température des muscles
Un système in vitro a les avantages de l'accessibilité pharmacologique et un contrôle direct de variables perfusat et physico-chimiques telles que la température et le pH. Une approche in vitro élimine le potentiel in vivo confond l'anesthésie et le muscle état de perfusion. Bien que la préparation nerf-muscle permet l'étude de la réponse directe d'une perturbation sur les afférences, la possibilité d'étudier la modulation gamma efférent de sensibilité broche et d'autres réponses intégrées qui est possible avec 14 in vivo ou ex vivo trois préparations sont sacrifiés il n'y a pas de corps cellulaires neuronaux de cette préparation.
Cette préparation a déjà été utilisé pour caractériser la réponse des afférences de broche de muscle de souris à une batterie de rampe et tenir les étirements et les vibrations et il a été déterminé que les responsab afférentes de la broche de la sourises étaient similaires à ceux rapportés dans d'autres espèces comme le rat, le chat et l'homme. Souris réponses broche afférentes ont été jugés similaires à la fois 24 ° C et 34 ° la température du bain de C, mais à 34 ° C des taux de combustion absolue étaient plus rapides et les afférences sont plus en mesure de répondre à la longueur plus rapide change 15. Nous décrivons ci-dessous comment cette préparation peut être utilisée pour identifier et étudier les afférences du fuseau musculaire. En outre, cette préparation peut être facilement modifié pour étudier la réponse des autres sous-types afférentes musculaire 13, à comparer les propriétés des afférences sensorielles en réponse à un état de drogue ou d'une maladie ou d'autres variables assortis (par exemple, l'âge, le sexe, le gène knock-out).
Protocol
Éthique nationaux et institutionnels appropriés doivent être obtenus avant de procéder à des expérimentations animales.
1. Suppression des EDL musculaires et nerveuses
- Peser et anesthésier profondément une souris adulte avec isofluorane inhalée à l'aide d'un vaporisateur avec 5% isofluorane majoré d'un taux de 1,5 L / min d'oxygène flux ou une cloche de verre trempé isofluorane coton sur le fond.
- Assurez-vous que la souris est profondément anesthésié et ne répond pas à une pincée de pointe. Décapiter rapidement à l'aide de grands ciseaux pointus ou une guillotine.
- Faire une coupe médiane ventrale à travers les côtes à l'aide de ciseaux et enlever les organes internes.
- Peau de l'animal en le saisissant par la peau du cou et le tirant passé les pieds.
- Retirez les jambes en coupant au-dessus des hanches et placer les jambes à la peau dans un plat avec frais (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% de CO 2) faible taux de calcium, de magnésium de haute bicarbonate tamponnée contai de solution salinetion en mM: 128 NaCl, KCl 1,9, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl2, 6,5 MgSO 4, et 10 glucose (pH de 7,4 ± 0,05) 16. Le faible taux de calcium, solution de haute magnésium inhibe la transmission synaptique lors de la dissection.
- Placez les jambes côté dorsal dans le plat et épinglez les jambes et les hanches vers le bas en utilisant des aiguilles ou des épingles insectes ainsi que les articulations du genou et de la cheville sont à un angle de 90 °. Placer une broche à chaque extrémité du pied et une tige sur chacune de la partie antérieure et postérieure des cuisses pour maintenir le tissu en place.
- Utilisation Castroviejo ciseaux à ressort, soulevez la couche supérieure du muscle au niveau des cuisses et de faire une ligne médiane couper pour exposer le nerf sciatique directement ci-dessous. Le nerf sciatique est situé juste en dessous de la couche musculaire haut et passe au-dessus du fémur de sa sortie près des hanches jusqu'à ce qu'il se ramifie en sciatique poplité externe et le nerf tibial juste avant l'articulation du genou.
- Retirer le muscle au-dessus du nerf sciatique jusqu'à la point à laquelle les plongées nerf de la branche péroniers profondément dans le muscle fléchisseur de l'hallux (FHL) est visible.
- En utilisant # 55 forceps, disséquer le tissu conjonctif autour de la branche péronier à le libérer des jumeaux et soléaire, qui sont sur le côté interne du tibia. Couper les tendons des jumeaux et soléaire et les enlever soigneusement sous le nerf.
- Retirer le muscle superficiel sur le côté latéral du tibia pour exposer trois faisceaux tendineux distinctes à l'articulation de la cheville-de dedans en dehors: FHL, EDL, et jambier antérieur (TA), avec l'EDL caché sous la TA.
- Couper le tendon TA à l'articulation de la cheville, soulevez le TA et loin de l'EDL, et couper le muscle près du genou pour le supprimer.
- Couper le tendon FHL à la cheville et soulevez-le pour atteindre la zone où le nerf pénètre dans la FHL. Coupez juste en dessous de ce point et retirer ~ 2/3 du muscle FHL.
- Couper le nerf sciatique au plus près de l'articulation de la hanche que possible et dépouiller doucement toutes les branches nerveuses, sauf pour la branche tibial antérieur.
- Couper les tendons EDL à la fois les chevilles et les articulations du genou à l'aide de grands ciseaux à ressort.
- Avec des ciseaux pointus, retirer le permis de conduire Plus, la FHL restant et le nerf du tissu environnant en coupant à travers l'os du tibia au genou et à mi-chemin à travers la cuisse. Coupez le tibia os restant de sorte que tout l'EDL, une partie de la FHL et les nerfs restent.
2 Montage de l'EDL et nerveuse dans le bain de tissu (figure 1A)
- Avant le début de l'expérience, la préparation du bain de tissu. Toujours perfuser le bain avec oxygénée (100% de O 2) de fluide interstitiel synthétique (SIF) contenant (en mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl2, 9,5 NaC 6 H 11 O ( le gluconate de sodium), 5,5 glucose, saccharose 7,5, et 10 -2 N-hydroxyethylpiperazine- N '-2-etacide hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Un taux de 15 à 30 ml / min est recommandée. Montré est un bain disponible dans le commerce de 25 ml de capacité avec deux électrodes de stimulation fixe au fond de la baignoire, un poste de tissu monté et un support pour un contrôleur de la force et de la longueur (dimensions de bain d'environ 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; pour les spécifications voir le tableau des Matériaux / Équipement).
- Utilisez le tissu FHL restant à traiter le muscle-nerf isolé et placez-le dans le bain de tissu. Placer une petite pièce de Sylgard sur le fond de la boîte et en utilisant une broche à travers le tissu insecte FHL restant à stabiliser le muscle.
- Utilisez 6-0 sutures de soie à nouer les deux tendons et fixer une extrémité au poste de tissu et l'autre sur le bras de levier de la force et le contrôleur de longueur (voir le tableau des Matériaux / Équipement pour les spécifications). Utiliser la plus petite longueur de fil de suture qui est pratique. Retirer la goupille d'insectes et Sylgard après avoir lié les tendons. REMARQUE: Pour faciliter facileconnexion au bras d'un levier petit morceau de fil peut être courbé dans une "j" en forme de crochet et fixée sur le bras de levier avec de l'époxy. Le fil de suture peut alors être lié à la place du fil enfilé dans le petit trou sur le bras de levier.
- Assurez-électrodes d'aspiration de 16 SA verre en utilisant d'abord un extracteur micropipette de verre (chaleur = 286, Pull = 0, vitesse = 150, Temps = 200); briser la pointe arrière et la main broyer sur une pierre à aiguiser jusqu'à il ya environ 3 mm cône. Faire fondre la pointe en utilisant un microforge à la pointe souhaitée diamètre intérieur compris entre 10 à 100 um en fonction de la zone de nerf on souhaite échantillonner (voir les figures 1B-1C pour électrode schématique et Table des Matières / Équipement pour des informations).
- Remplir une électrode d'aspiration de verre préfabriqué pour le fil d'argent interne avec SIF.
- Aspirer la fin de la coupe de nerf dans l'électrode et la connexion au port positive d'un amplificateur différentiel. Enveloppez l'électrode avec de l'argent chloréfil qui se connecte à l'orifice de la headstage négatif. Rez de bain SIF en exécutant un deuxième fil chlorée d'argent de la salle de bain sur le port au sol de l'headstage. Aussi la terre la tubulure de perfusion de la cage de Faraday en plusieurs points afin d'atténuer le bruit électrique introduit par les pompes à perfusion.
- Stimuler le muscle par l'intermédiaire des électrodes montées de chaque côté du muscle dans le bain de tissu pour provoquer une contraction de la secousse. En variante placer une électrode de stimulation à la fin de la coupe de nerf. Augmenter la tension de stimulation jusqu'à ce qu'une force de contraction de pic est observé, puis augmenter la tension de 15% pour atteindre la tension supramaximale (0,5 ms de largeur d'impulsion). Continuer les contractions de contraction à la tension supramaximale, avec un repos de 10 secondes entre les deux, mais de faire varier la longueur du muscle jusqu'à ce qu'une force de contraction maximale est atteinte pour déterminer la longueur optimale (L o) du muscle. Toutes les rampes de longueur et les vibrations vont commencer avec le muscle à ce lenge.
- Laisser la préparation nerf-muscle de rester dans le bain pendant au moins une heure avant la collecte de données ultérieure pour permettre au tissu d'atteindre la température du bain et de la transmission synaptique normale de récupération suivant dissection dans une solution faible de calcium.
- Pour collecter des données, à une température autre que la température ambiante, placer une sonde de température dans le bain de tissu près du muscle. Porter lentement le bain à la température de l'eau chauffée par pompage à travers la plaque de base de bain de tissu. Enveloppez argile coussins chauffants au micro-ondes dans le réservoir SIF pour aider à maintenir une température constante.
3 Collecte des données
- Pour identifier un afférente comme un afférent de la broche, enregistrer l'activité neuronale pendant les contractions répétées de contraction produites par une tension de stimulation supramaximale 0,5 msec délivré une fois par seconde. REMARQUE: Muscle afférences de la broche doivent pause au cours de la contraction de 18,19 contraction (figure 2).
- Utilisez dalogiciel d'acquisition ta appliquer les changements de longueur à des vitesses différentes et de différentes longueurs. Utilisez un script personnalisé pour automatiser cette tâche (voir informations supplémentaires pour une capture d'écran du script et des directives sur la façon de personnaliser les données étendues). Appliquer tronçons de rampe et de maintien de 4 sec à des longueurs d'étirement de 2,5%, 5% et 7,5% L o et la vitesse d'étirement de 20, 40, ou 60% de L o / sec 15. NOTE: Voir le mode d'emploi de la force spécifique et un contrôleur de longueur pour nécessaire facteur de conversion tension-millimètre.
- A la fin de l'expérience, de déterminer la santé des muscles à 24 ° C en utilisant des contractions tétaniques isométriques maximales (500 trains ms, 120 Hz fréquence des trains, 0,5 ms largeur d'impulsion, la tension supramaximal). Comparer la force contractile pic de valeurs précédemment rapportées (~ 24 N / cm 2 9,20).
Representative Results
La réponse des afférences musculaires peuvent être enregistrées suivant une variété de perturbations, selon lequel le sous-type est afférente à l'étude. Réponses représentatives des afférences de broche de muscle à la contraction musculaire et la rampe et maintenez tronçon sont présentés ici. Pour identifier un afférente comme un afférent broche, à contraction contractions sont donnés une fois par seconde (0,5 ms de largeur d'impulsion) pour voir si il ya une pause dans la cuisson lors de la contraction 18,19. Figure 2 montre une trace représentant l'activité neuronale et la tension musculaire pendant ces contractions de contraction. Aucune activité neuronale est observée pendant les contractions de contraction, comme prévu pour les afférences broche. Si la afférente a été enregistré un afférent de l'organe tendineux de Golgi Groupe Ib, une augmentation du taux de décharge durant la contraction on pouvait s'y attendre.
Dans des conditions de contrôle de la plupart des afférences avec un motif de licenciement régulier (~ 12 impulsions / sec à 24 ° C et ~ 32 impulsions / sec à 34 ° C) Sont musculaires afférences de la broche. Un sous-ensemble des afférences de broche ne se déclenche pendant tronçon (dans nos mains ~ 11% des afférences de broche) 15. Figure 3A montre une trace brute représentant de deux afférences de broche de muscle en réponse à une rampe et maintenez tronçon produite par le contrôleur de la force et de la longueur. La fonction de Spike histogramme de LabChart est utilisé pour identifier et analyser la fréquence de mise à feu instantanée des deux neurones individuels séparément (figures 3B-3C).
Figure 1: isolé Muscle Préparation A) Le long extenseur des orteils (EDL) et innervant nerf sciatique sont montés dans un bain de tissu isolé perfusé avec du liquide interstitiel synthétique oxygéné (SIF). Amplificateur extracellulaire relié à un suctisur l'électrode enregistre l'activité neuronale. Un double la force et la longueur contrôleur pour les logiciels-contrôles et des mesures appropriées la force musculaire et de la longueur. Les électrodes de bain de tissus fournissent des stimuli pour produire contraction ou contractions tétaniques. Pompage de l'eau chauffée par la voie de la plaque de bain interne contrôle la température du bain de tissu. B) Tiré verre de l'électrode d'aspiration avec ~ 3 mm pointe effilée. C) agrandie représentation de la forme de pointe idéal pour l'électrode d'aspiration qui est produit en utilisant une microforge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Réponse afférente à la broche Twitch contraction. Activit neuronaleY (tracé supérieur) et la tension musculaire (trace inférieure) de 30 contractions de contraction se superposent avec haut trace de chevauchement en noir. Activité afférente pause pendant l'augmentation de la tension induite par la contraction, ce qui est une caractéristique de réponse des afférences de broche musculaire. Support et flèche au-dessus de la trace en haut indiquent le temps lors de la contraction lorsque l'activité est en pause.
Figure 3 broche réponse afférente à rampe et Maintenez la position A) l'activité neuronale Raw de deux afférences (haut traces) au cours d'une rampe et maintenez étirement appliqué à l'EDL (longueur musculaire indiqué dans la trace du bas). B) instantanée de la fréquence de mise à feu (Inst. Fr., impulsions par seconde) de l'unité présentant une activité à L o de A (en bleu). C) Instantanéous la fréquence de mise à feu de l'unité inférieure qui ne se déclenche au cours de l'étirement (représenté en orange). Les deux unités présentent une adaptation de la fréquence de pic pendant tronçon qui est caractéristique des fibres afférentes de la broche 1 du muscle.
Discussion
Le but de cet article est de décrire une méthode pour enregistrer à partir des afférences du fuseau musculaire dans une préparation souris muscle-nerf isolé. Nous avons trouvé que les afférences de la broche de la souris réagissent de manière similaire à étirer que celles de rats, les chats et les humains 15 et d'autres laboratoires ont utilisé des souris comme organismes modèles pour étudier les neurones sensoriels à la fois dans le muscle et la peau in vitro (par exemple 3,13) .
Muscle afférences sensorielles peuvent être enregistrées pendant au moins 6-8 heures à la fois 24 ° C et 34 ° C. Afin de minimiser la manipulation du EDL et nerveuse, utiliser la partie restante de la FHL à manipuler le tissu chaque fois que possible. Après la dissection, attendre au moins 1 heure pour commencer la collecte de données pour permettre le tissu s'équilibrer à la température du bain et de la transmission synaptique normale pour récupérer. Auparavant, la santé des muscles ont été vérifiées sur un sous-ensemble de muscles utilisés dans cette préparation en déterminant que la contra maximale tétaniquectile active générée par les muscles est similaire à celle rapportée par d'autres au début et à la fin de l'expérience 15.
Muscle afférences de la broche ont été identifiés fonctionnellement dans cette préparation par la recherche d'une pause caractéristique à tirer en réponse à la contraction contraction (figure 2) ainsi que la fréquence augmente instantanées attendus en réponse aux changements de longueur (Figure 3). Dans notre expérience, la plupart des afférences qui tirent dans des conditions de contrôle sont les afférences du fuseau musculaire. La longueur du nerf retenu dans cette préparation (~ 7 mm maximum) n'est pas assez longtemps pour utiliser les différences de vitesse de conduction afférents à identifier les sous-types afférentes musculaire 13. En outre, contrairement à chez les chats et les humains, les mesures de sensibilité dynamique n'étaient pas en mesure de différencier clairement groupe Ia et les afférences II chez la souris (pour plus de discussion, voir Wilkinson et al. 15). D'autres sous-types de fibres afférentes (c.. Groupe III et IV) peuvent être identifiés en utilisant des tests fonctionnels supplémentaires dans cette préparation, par exemple par addition de substances comme la capsaïcine, de l'ATP, ou la bradykinine, ce qui diminue le pH bain, ce qui expose le muscle à une ischémie, etc 3,13,21-23 En utilisant des électrodes d'aspiration permet l'activité des neurones sensoriels de multiples devant être enregistrées en même temps, ce qui augmente la quantité de données qui peuvent être collectées à partir d'un seul muscle. Cette préparation peut être utilisé pour évaluer l'effet global d'une perturbation sur sensorielles réponses des populations de neurones ou les réponses des afférences identifiés. Si les formes de pic sont assez uniques, jusqu'à 4 neurones sensoriels peuvent être discriminés par le logiciel (à la fois Spike2 (Cambridge Electronic Design) et Pro LabChart (AD Instruments) ont effectué la même manière). Dans les cas où les neurones ne peuvent pas être discriminés, les changements dans le placement des électrodes ou le diamètre de la pointe peuvent facilement être mises en œuvre.
En résumé, la souris muscle-nerf en prépar vitroation est une approche expérimentale simple qui peut être utilisé pour étudier les propriétés de réponse des muscles afférences sensorielles à différents modèles perturbations, les blessures et les maladies physico-chimiques. En outre, cette préparation est idéale pour profiter des outils génétiques puissants disponibles chez la souris, y compris les animaux transgéniques et des outils optogénétiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
| Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
| 2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
| Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
| Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
| Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
| Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
| Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
| Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
| Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
| Microforge | Narishige | MF-9 | |
| Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
| 6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O2/5% CO2 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
| Sodium chloride | Sigma | S9888-1KG | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Sodium gluconate | Sigma | S2054-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | |
| Glucose | Sigma | G5767-500G | |
| Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
| HEPES | Sigma | H3375-250G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
References
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