Summary
Retina neural de um rato com idade entre 8 dias é em cima de um bloco de gelatina 4%. Após o isolamento da camada de fotorreceptores (200 mm) por vibratome, as células fotorreceptoras são cultivadas após dissociação enzimática e mecânica para a cultura. A camada de fotorreceptores pode ser utilizado para análises moleculares, bioquímicas ou transplante.
Abstract
A retina é uma parte do sistema nervoso central que tem organizado arquitectura, com neurónios nas camadas de fotorreceptores, ambos os cones e bastonetes em contacto com o epitélio pigmentado da retina, na parte mais distante na retina, considerando a direcção da luz, ea as células ganglionares da distância mais proximal. Esta arquitectura permite que o isolamento da camada de fotorreceptores por vibratome seccionamento. A retina neural dissecado de um rato com idade entre 8 dias é flat-incorporado em 4% de gelatina em cima de uma fatia de 20% de gelatina camada de fotorreceptores voltado para baixo. Usando um vibratome e uma lâmina de barbear de dois gumes, o 100 um retina interna de espessura é segmentado. Esta secção contém as células ganglionares e a camada interna com nomeadamente as células bipolares. Uma seção intermediária de 15 mm é descartada antes de 200 mm da retina exterior que contém os fotorreceptores é recuperado. A gelatina é removido por aquecimento a 37 ° C. Pedaços de camada externa são incubated em 500 ul de solução de Ringer com 2 unidades de papaína activada durante 20 minutos a 37 ° C. A reacção é parada pela adição de 500 ul de 10% de soro fetal de vitelo (FCS) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), em seguida, 25 unidades de ADNase I é adicionado antes da centrifugação à temperatura ambiente, lavou-se várias vezes para remover o soro e as células são ressuspensas em 500 ul de DMEM e semeadas a 1 x 10 5 células / cm2. As células são cultivadas até 5 dias in vitro e a sua viabilidade registados com vivo / morto ensaio. A pureza da cultura é determinado em primeiro lugar por meio de observação microscópica durante a experiência. A pureza é validada por semeadura e que fixa as células em uma lâmina histológica e análise utilizando um policlonal de coelho anti-SAG, um marcador de fotorreceptores e rato monoclonal anti-RHO, um marcador específico para fotorreceptores. Alternativamente, a camada de fotorreceptores (97% de bastonetes) pode ser usado para a análise da expressão do gene ou de proteína e de transplante.
Introduction
A retina é uma parte integrante do sistema nervoso central que tem uma arquitectura conservado entre os vertebrados. Os neurónios da retina neural são organizadas em camadas, com o mais distante para a luz incidente, a camada de fotorreceptores em estreito contacto com o epitélio pigmentado da retina (EPR) na parte de trás do olho. Bastonetes e cones photorecptors são células sensíveis à luz que dependem de moléculas sensíveis opsina para captura de fótons. Estas moléculas são fechados em membranas de disco com uma estrutura celular de, localizadas no segmento exterior do fotorreceptor, que aponta na direcção do EPR 1. Esta estrutura, que é muitas vezes influenciada muito precoce em casos de degenerações fotorreceptoras, é renovada a uma taxa de 10% de todos os dias. A camada interior chamada contém a maioria dos outros neurónios que computam o sinal recebido dos fotorreceptores, o bipolar, amacrine e células horizontais bem como as células ganglionares. Estes últimos com os seus axóniosformar um feixe que é o nervo óptico. Esta camada é tão conservado que os biólogos têm usado o termo deslocado células amácrinas quando as células são encontradas fora da camada plexiforme interna 2. Camadas de neurônios são distribuídos dentro de uma armadura de células da glia radial Müller. Células bipolares fotorreceptores ligar a células ganglionares. Eles estão localizados entre a camada plexiforme externa e a camada plexiforme interna. As células ganglionares formar a camada plexiforme interna em conexão com as células bipolares. As células amacrin são nomeados como células de associação localizados na camada plexiforme interna entre as células bipolares e células ganglionares. A camada plexiforme externa contém células horizontais. Esta combinação única de camadas neuronais do sistema nervoso central permite o isolamento da camada de fotorreceptores na camada celular interna da retina por corte plana montada utilizando um vibratome.
Originalmente, esta técnica foi utilizada para isolar fotorreceptores para transplantation no olho do rato RD1, um modelo de retinite pigmentosa humana (RP) 3. O rato RD1 portador de uma mutação recessiva no gene Pde6b que codifica para a subunidade beta da fosfodiesterase específica de haste. Mutações recessivas deste resultado gene em RP em humanos 4. Depois de bastonetes se degeneraram, o paciente perde a visão noturna, e surpreendentemente fotorreceptores cone, que não expressam o gene mutado, degeneram como uma segunda etapa. Porque os cones são necessários para a visão de cores e acuidade visual, os pacientes tornam-se progressivamente cego e um tratamento eficaz para a doença ainda não se desenvolveu. Enxertando camada de fotorreceptores de um rato do tipo selvagem a degeneração cone do mouse anfitrião não for 3,5. As hastes perdida no modelo degenerativa haste de cone não poderia ser substituído por um transplante devido a conexão sináptica entre as hastes e as células bipolares só pode ser obtido numa fase específica de rdesenvolvimento etinal, marcada pelo aparecimento de expressão Nrl 6. A camada de fotorreceptores é introduzido por cirurgia no espaço sub-retinal na retina de RD1-haste menos, entre a EPR e da retina externa que corresponde a apenas 3% dos fotorreceptores restantes, os cones. Duas semanas após a cirurgia, 40% dos cones a partir do animal transplantado com uma camada de fotorreceptores normais sobreviveram, em comparação com o animal transplantado com uma camada normal das células da retina interna, ou para o animal de operação simulada. A topografia do cone de sobrevivência, espalhar-se por toda a superfície da retina mutada localizada na posição do tecido enxertado indica que o efeito protector é devida a uma molécula difusível 7.
Em seguida, utilizou-se um sistema de co-cultura, bem como meios de cultura condicionados para validar o facto de que o efeito de protecção baseia-se na secreção de uma proteína por hastes de 8,9. Nossa hipótese é que essa proteína será exprEssed contínua e especificamente por hastes e que a sua morte durante a primeira fase da doença irá desencadear cone degeneração secundária pela perda de um sinal de proteção das hastes de forma autónoma não-célula 10. Devido à importância de cone mediada visão central nos primatas desta proteína putativa vai ser uma ferramenta terapêutica altamente relevante para o PR. Preservar os cones em RP teoricamente impedir que um total de 1,5 milhões de pacientes em todo o mundo para tornar-se cego 11. Nós usamos uma abordagem de alta triagem de conteúdo e um modelo de cultura enriquecido com cone para identificar um cDNA que codifica Rod derivado Cone Viabilidade Factor (RdCVF) a partir de uma biblioteca de cDNA da retina 12. RdCVF é o produto de splicing do gene NXNL1 que, curiosamente é homólogo ao gene que codifica para proteínas envolvidas em tioredoxina homeostase redox 13. O segundo produto de splicing do gene, RdCVFL é uma enzima que protege o seu objectivo, a proteína TAU contra oxidativo dAmage 14. A administração de RdCVF impede a degeneração secundária de cones e a perda de sua função visual em um recessivo, e modelo dominante de RP 12,15. Isso demonstra dois aspectos importantes desta estratégia terapêutica inovadora 16. Em primeiro lugar, ela pode ser aplicada na maioria dos casos de PR de uma forma independente do gene. Em segundo lugar, ao contrário do factor de sobrevivência de CNTF concorrente, RdCVF está associada com a manutenção da função visual 17. A ausência de efeito funcional pode explicar a razão da ausência de benefícios clínicos da administração de CNTF a pacientes RP 18. RdCVF é mais provável que um dos sinais de sobrevivência importante entre os cones e bastonetes desde resgate cone in vitro é inibida por RdCVF imunodepleção 12. Além disso, a ruptura do gene de viabilidade cone derivado de haste conduz a disfunção fotoreceptoras e susceptibilidade ao estresse oxidativo 19.
O uso decamada de fotorreceptores está na origem da identificação de RdCVF e de um sinal de redox novo envolvido em doenças neurodegenerativas 20. Este manuscrito descreve o protocolo utilizado para o isolamento e cultura de células a partir da camada de fotorreceptores para caracterizar a actividade de RdCVF. Os fotorreceptores podem ser mantidas em cultura durante 5 a 7 dias 21. Esta técnica também pode ser utilizada para estudar a expressão de genes específicos fotorreceptoras.
Protocol
NOTA: O procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Darwin Pierre e Marie Curie (CE5 / 2009/048)
1. Preparação da solução de gelatina, Instrumentos, Vibratome, Cultura, Mídia e Cultura Placa
- Prepara-se uma solução de gelatina a 20% pelo menos um dia antes da experiência.
- Sob o capô, adicionar 500 mL de gentamicina [10 mg / mL] para um frasco de 500 ml contendo CO 2 forma independente (CO 2 -i).
- Numa proveta separada, adicionar 20 ml de CO2-I (a partir do passo 1.1.1) e aquecer a 95 ° C num bloco de aquecimento com agitação constante durante 15 min. Observar uma mudança de cor para amarelo, indicando que a solução está pronta para utilização adicional.
- Pesar 4 g de gelatina e gradualmente pobre para a solução preparada acima (passo 1.1.2) com o aumento da agitação e aquecimento a 95 ° C durante 45 min, para se obter uma solução de cor amarela. Permitir que a solução de gelatina a arrefecer sobo capuz durante aproximadamente 5 min.
- Pour 4 ml da solução de gelatina de 35 mm em placas de cultura de diâmetro sem introduzir bolhas de ar. Manter o prato a 21 ° C durante 30 min. Cubra os pratos com filme plástico, e transformar os pratos de cabeça para baixo. Opcionalmente, os pratos armazenar a 4 ° C durante até 2 meses antes da utilização.
- Prepara-se uma solução de gelatina a 4%.
- Sob o capô, adicionar 25 ml de CO 2 -i forma de um recipiente de plástico estéril, e aquece-se a 42 ° C num bloco de aquecimento. Remover o meio do bloco de aquecimento e gradualmente adicione 1 g de gelatina para o meio quente e mexa. Retornar rapidamente o recipiente sobre o bloco de aquecimento (42 ° C) e mantê-lo aquecido durante o processo.
- Definindo-se o aparelho vibratome:
- Retirar as placas contendo solução de gelatina a 20% armazenada a 4 ° C. Cortar a gelatina com um bisturi. Vire a fatia de gelatina e colá-la no disco apoio preto do vibratome usando uma gota de scola uper.
- Quebre uma lâmina de barbear em duas metades, e inserir um meio para o vibratome segurando receptáculo. Insira o disco de apoio preto sobre o aparelho vibratome. Ligue o botão preto para o lado direito. Corrigir o receptáculo segurando a cabeça do vibratome. Adicionar uma quantidade suficiente de CO 2 -i meio no tanque de vibratome para cobrir o bloco de gelatina.
- Ligue o vibratome e cortou três fatias de 100 um bloco de gelatina. Manter o bloco de gelatina para utilização posterior.
- Preparar 40 ml de meio de cultura:
- Prepare meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) sob o capô. Prepare 1 mg / ml de poli-D-lisina usando tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4.
- Numa placa de 96 poços, adicionar 2 g / cm 2 de Poli-D-Lisina para revestir o fundo dos poços. Incubar a placa durante 45 minutos a 37 ° C dentro de 5% de CO2. Após a incubação, remover PBS e substituir com 200 ul/ Poço de DMEM e novamente lugar a 37 ° C em 5% de CO2 antes de usar.
2. Dissecção da Retina Entire
- Enuclear o mouse:
- Sacrifique o mouse de acordo com a directiva europeia 2010/63: por deslocamento cervical. Corte a cabeça com curvas-tesoura e coloque-o em uma placa de Petri de diâmetro 100 milímetros, depois de ter desinfectado o olho com desinfetante.
- Remova o olho depois de ter destacado o nervo óptico por seccionamento lo com muito cuidado usando um aperto curvo. Em seguida, colocar ambos os olhos numa placa de 35 milímetros de Petri contendo meio de CO 2 -i estéril a 21 ° C.
- Removendo a retina:
- Fazer um buraco no nível do olho-membro com a ajuda de uma agulha de 18 G, deve ser capaz de introduzir a tesoura para o globo ocular. Introduzir tesoura reta no interior do buraco e cuidadosamente cortada na esclera abaixo da íris em todo o perímetro do globo ocular para remover o corpo ciliar.
- Aumento do globo ocular e descascá-lo como um "laranja". Retire a retina da esclera e epitélio pigmentado da retina (EPR). Retire a retina ainda ligado ao nível do nervo óptico com muito cuidado com curvas-tesoura fina.
- Separe o vítreo restante da periferia para o centro da retina com dois apertos finas. Certifique-se de que todo o vítreo é completamente removido para permitir que o achatamento da retina.
- Cortar a extremidade de uma pipeta de plástico e transferir a retina para um diâmetro de 35 milímetros placa de Petri contendo meio de CO 2 -i com a pipeta de plástico.
3. Selagem de-Mounte Planod Retina para Gelatin Bloco
- Remover 20-30 ml de CO 2 médio -i do tanque vibratome (o bloco de gelatina é gratuita) para permitir a vedação de retina flat-montado.
- Transferir a retina para uma lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico e adicionar uma gota de meio de CO 2 -i antes de transferir para a fatia de gelatina com o foto-receptor voltado para baixo sobre a fatia de gelatina.
- Encaixe da retina para o bloco de gelatina por injecção aqueceu-se suavemente a 4% de gelatina, de um lado do bloco entre a retina e o bloco de gelatina e simultaneamente expulsar gelatina quente, por outro lado.
- Aspirar 4% de gelatina com uma pipeta de pasteur. Aguarde 10 minutos para permitir a vedação total. Adicionar CO 2 médio -i para mergulhar o bloco ea lâmina completamente.
4. Seccionamento da Retina
NOTA: Este passo é crítico para se obter uma camada de células fotorreceptoras sem as outras células da retina (Figura 1).
- A partir da parte superior sobre o bloco de gelatina, 100 mm cortar secções em série para atingir a retina. Em seguida, retira 100-120 mm secções da camada interior. Dependendo da aplicação, esta camada pode ser descartada ou armazenada em azoto líquido. Assegure-se que a velocidade de vibratome é muito lento (a 1 ou 2), durante o corte das camadas ou camadas interiores fotorreceptores.
- Realizar intermédios 15 mm secções da retina que corresponde à interface entre o interior e exterior da retina. Observe esta seção sob um microscópio. A ausência de vasos sanguíneos indica que a retina externa foi atingido.
- Cortar 200 um da retina externa (a camada de fotorreceptores) com gelatina e transferi-lo para um prato de 35 milímetros de diâmetro cheia com 3 mL de meio de CO 2 -i. Mantê-lo em gelo até são obtidas todas as seções da camada de fotorreceptores de todos os retinas.
5. dissociar as células fotoreceptoras
- Leve o prato (es) contendo a camada (s) de fotorreceptores e colocá-lo (eles) em uma incubadora a 37 ° C durante 10 min.
- Usando fórceps suavemente separar a camada de fotorreceptores da gelatina e transferi-lo num prato novo cheio com 3 ml de solução de Ringer. Repita este passo (5.2) para cada preparação camada de fotorreceptores.
- Incubar 2 unidades de papaína com 25 ul de solução de activador (1,1 mM de EDTA; 5,5 mM de L-cisteína; 60 uM β-mercaptoetanol) em 5 ml de um tubo de polipropileno estéril e incubar-lo 30 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora . A activação da papaína é conseguida a 37 ° C. Durante esta incubação, cortar a camada de fotorreceptores em 2 milímetros 2 peças (não muito pequenos) e transferir estas peças em um 5 ml tubos.
- Lavar a retina duas vezes com 1,5 ml de solução de solução de Ringer, seguido por sedimentação por gravidade. Remova todo o restante solução de Ringer do tubo com a amostra.
- Adicionar 475 ul de solução de Ringer para o tubo que contém papaína activada e mistura. Adicionar esta solução para o tubo contendo a retina.
- Incubar o tubo com a retina durante 20 minutos a 37 ° C dentro de 5% de CO2. Parar a reacção por adição de 1 ml de FCS a 10% em DMEM. Adicionar 25 L de desoxirribonuclease I (ADNase I) para ADN digerido a partir de células de morte. Homogeneizar cuidadosamente a suspensão de células utilizando uma pipeta de 1 ml. Gire a 50 g durante 6 min em temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante para remover vestígios de soro e adicionar meio DMEM com suplementos (ver tabela de reagents_equipment específica) para o sedimento de células e ressuspender cuidadosamente a suspensão de células com uma pipeta de 1 ml. Gire a 50 g durante 6 min em temperatura ambiente. Repita este passo (5.7) mais uma vez.
6 A cultura as células fotoreceptoras
- A camada de fotorreceptores de um rato em PN8 contém cerca de 1-1500000 células utilizando esta técnica. Semente as células fotorreceptoras a 15 x 10 células / cm2 numa placa de cultura com meio de cultura e a cultura das células durante 5 dias a 37 ° C dentro de 5% de CO2. No dia 5, prossiga para imunoquímica e de estudo de acordo com métodos de transferência Western fornecidos pelos anticorpos fornecedores.
NOTA: Passos para parar a cultura e os ensaios preliminares são descritos na referência 21.
Representative Results
Além de transplante, as camadas fotorreceptoras também têm sido utilizados para estudar a sinalização celular por sementeira de células para fazer as culturas de fotorreceptores 12,22. Além disso, eles são utilizados para estudar a expressão de genes e ritmo circadiano 23,24. Usámos a camada de fotorreceptores célula de um ratinho de tipo selvagem ao dia pós-natal 8 para preparar culturas de fotorreceptores na ausência de FCS e as células mantidas durante 5 dias a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO 2 (Figura 1E ). As células foram então fixadas com 4% e, em seguida, procedeu paraformadehyde para análise imunocitoquimica utilizando métodos proporcionados pelos fornecedores de anticorpos quer com anticorpo monoclonal anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) ou anticorpo policlonal de coelho anti-SAG (1: 200, uma generosa dom de Igal Gery e David Hicks). Usamos anti-RHO e anti-SAG (embora anti-SAG cones de etiqueta e varetas), devido ao fato de que o anti-SAG é um marcador mais precoce, do que anti-RHO. A proporção de cells positivos para o anticorpo anti-RHO é menor do que daqueles positivos para os anticorpos anti-SAG (Figura 2). Isto pode ser explicado pelo fato de que a SAG, a haste arrestina é também expresso por cones que tornam 3% de fotorreceptores na camada isolado, ou, alternativamente, pelo facto de durante a maturação pós-natal da retina, a expressão de SAG que precede de RHO 25,26.
A camada de fotorreceptores foi também utilizado para controlar a expressão de genes específicos por fotorreceptores do tipo selvagem retina e do cérebro de animais com 35 dias de ARN foram preparadas utilizando ultracentrifugação em CsCl 27 e hibridaram com chip de ADN de matriz de rato. Os mensageiros de rodopsina (Rho), S-arrestina (Sag) e cone-transducina (Gnat2) são especificamente expressos na retina, em comparação com o cérebro (Figura 3A). A expressão é proeminente na camada de fotorreceptores (PR) do que em toda a retina, que englobaa camada interna da retina, mostrando que estes genes são expressos na verdade por fotorreceptores. Para Gnat2, a expressão relativa, em comparação com Rho e Sag mostra que ela é expressa por cones contidos na camada de fotorreceptores isolado. A expressão de recoverin (Rcvrn) na camada de fotorreceptores, em comparação com toda a retina é aumentada (Figura 3B).
A camada de fotorreceptores foi também utilizado para controlar a expressão de RHO e western blotting utilizando GNAT2 seguinte métodos proporcionados pelos fornecedores de anticorpos e para comparar com a camada interior da retina (Figura 4). Observe a ausência de RHO e GNAT2 28, os marcadores de cones e bastonetes, respectivamente, em toda a retina e na retina do RD1 mouse no dia pós-natal 35.
Figura 1. Representação esquemática do corte vibratome de rato retina. (A) Montagem da retina plana montada com o foto-receptor voltado para baixo sobre a fatia de gelatina. (B) Secção da retina interna com a lâmina vibratome. (C) Secção da retina externa adicional de gelatina. (D) Controlo de a presença de fotorreceptores na extremidade do fragmento de retina após o isolamento da camada de fotorreceptores. Barra de escala utilizada para fluorescência verde é usado de um microscópio de luz branca. Os fotorreceptores estão localizados na margem da figura. (E) células fotorreceptoras Cultivadas (pós e cinco dias). (F) Maior ampliação de painel E.
Figura 2. A expressão diferencial de RHO e SAG na cultura do mouse fotorreceptores. (A) A coloração de núcleos (azul), (B) coloração SAG (verde), (C) coloração RHO (vermelho). (D) Mesclado imagem. Porque coloração da SAG é expresso mais cedo do que a coloração RHO, apenas duas células são duplamente marcada SAG e RHO (veja *). Barra de escala:. 23 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação da expressão de três genes em cérebro inteiro e retina e fotorreceptores dos animais de tipo selvagem com idades compreendidas entre 35 dias. (A) A rodopsina (Rho), S-arrestin (Sag) e cone-transducina (Gnat2). (B) Calbindina (Calb1) e Recoverin (Rcvrn). Os dados são apresentados como a expressão relativa. A expressão relativa é um valor da expressãoobtido a partir de dados de microarranjos após normaliszation com o software robusto multi-array Average (RMA) disponíveis no banco de dados de conhecimento KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/).
Figura 4. Expressão de RHO e GNAT2 na retina externa a partir de uma retina do tipo selvagem no dia pós-natal 35. Ausência de sua expressão na retina interna e na retina do rato RD1 em pós-natal dia 35. ACTB, beta actina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
| Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
| Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
| Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
| 96-well plates | Greiner bio-one | 655-095 | |
| Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
| CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
| Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
| Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
| Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
| Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
| Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
| Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
| Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
| Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
| Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
| Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
| Scissor | Moria | 15396-00 | |
| Sodium pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
| Sodium selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
| Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
| Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
| Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
| * Supplements | |||
References
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