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Medicine

マウスにおける全身および肝血行動態パラメータの監視

doi: 10.3791/51955 Published: October 4, 2014

Summary

このフィルムは、マウスにおける全身および肝臓の血行動態を取得する方法を示します。全体の監視は重要なパラメータは、全身血圧、中心静脈圧、総肝動脈流量、および門脈の圧力、ならびにマウスにおけるポータル流量の取得を含む。

Abstract

実験的研究のマウスモデルを使用することは肝生理学および病態生理学的障害の研究のために莫大な重要なものである。しかし、マウスの小さなサイズのために、マウスに適した術中監視手順の技術的な詳細はほとんど記載されなかった。以前私達はラットの血行動態パラメータを取得するために監視手順を報告している。今、私たちは、ラットより10倍小さい種を、マウスにおける全身および肝臓の血行動態パラメータを取得するための手順を適合される。この映画は、動物の計装だけでなく、マウスでの全身および肝臓の血行動態を評価するために必要なデータ取得処理を示しています。体温、呼吸数および心拍数などのバイタルパラメータは、手順全体を通して記録した。全身の血行動態パラメータは、頸動脈圧(CAP)および中心静脈圧(CVP)で構成されています。肝灌流パラメータは、ポータルのVを含むアイン圧力(PVP)、ポータル流量ならびに肝動脈(表1)の流量。正常値を記録する計測機器とデータ取得は、1.5時間以内に完了した。全身および肝臓の血行動態パラメータは、この手順の間、正常範囲内であった。

この手順では、困難なく実現可能である。我々はすでにだけでなく、70%部分肝切除中および肝葉クランプ実験で、正常なマウスでは肝血行動態を評価するために、この手順を適用している。切除回(n = 20)、切除(6.87±2.39 CMH 2 O)前よりも有意に高かったCMH 2 O(P <0.05)11.41±2.94であった後にPVPを意味する。肝葉クランプ実験の結果は、この監視手順は、機密と門脈圧とポータル流量の小さな変化を検出するのに適していることが示された。結論として、この手順は、経験豊富なマイクロ外科医の手の中に信頼性があるが、EXPに制限する必要がありますマウスは絶対的に必要とされているeriments。

Introduction

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このビデオの全体的な目標は、全身および肝臓の血行動態パラメータを取得するためのリアルタイム監視手順を実証することであった。この手順を開発するための理論的根拠は、全身および肝臓の血行動態パラメータを取得する必要とするマウスでの実験的介入のための大きな価値である。手順は、ナイーブ動物に、そのような部分肝切除などの与えられた肝胆実験的外科的介入、門脈結紮と肝移植の間または後に適用することができる。

げっ歯類における肝血行動態データの取得は、提案された侵襲的な処置を必要とします。肝灌流は非侵襲的に得ることができない。しかし、全身血圧を取得するための選択肢がある。このような尾カフ技法8として監視技術は、ラットとマウスの両方で血圧を取得するために利用されている。尾カフ技術はconsciで適用することができるOUの動物。血圧を測定する場合、動物は特定の不快な位置に配置して固定する必要がある。テールカフデバイスのマニュアルでは、製造業者は、マウスが神経質になって、尾部に循環を減少させる可能性があると強調してもよいと述べている。そのような状況下では、尾部で取得された末梢血圧は、中心血圧よりもはるかに低くてもよい。

完全な監視手順は、データ取得のための一連のセンサを使用して統合されたマルチチャネルモニタを用いて行った。血圧は、顕微鏡下で注意深く顕微解剖し、露光後のそれぞれの血管にカテーテルを挿入した。流量は、各容器の周囲に遷音速流プローブを配置することによって測定した。

すでにSINGLに匹敵する生理学的な血行動態データを総合的に直列に生じたラットでは、同様の術中監視手順を報告した他のグループ7から通知の電子データ。そこで私たちは、マウス、ラットよりも小さい10倍種にそれを適応させるための良い基盤を表現するには、次の手順を検討した。ラットの手順との重要な違いは、血圧データの代わりに、流体ベースのカテーテルシステムを取得するためのMillarカテーテルの使用である。フローデータは、遷音速流プローブを、対応するラットの血管よりもわずかはるかに小さいものと取得した。

による動物の小さなサイズのために、マウスの計測は、技術的に難しいが、実行可能である。インスツルメンテーションが完了すると、事前定義された設定ファイルを使用することができるので、データ取得および一次寿命データ解析は、簡単である。設定ファイルは、一連の実験の初めに一度定義されると、すべてのその後の実験のために保存して使用することができる有する。

今まで私たちは、急性実験で肝血行動態の影響を評価するには、この手順を適用した。私たちは、CAを測定し前と直後に70%部分肝切除(PH)後、および/デクランプ実験をクランプ中のPとPVP。私たちは、肝臓質量の完全90%に相当質量中央の短い(5分)、クランプと左側葉に続く肝臓の20%を代表する右葉の肝十二指腸靭帯をクランプ。デクランは中央値と左側葉を解放に続いて右葉からクランプを解除する作業を始めています。最大クランプ時間は10分未満であった。

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Protocol

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住宅·実施し、すべての手順は、ドイツの動物保護法制に従った。

1。センサーキャリブレーション(校正用センサメーカーの指示に従ってください)

1.1)ミラーカテーテル校正。 30分前にバランスをとる(ゼロ)とキャリブレーション用滅菌水または生理食塩水でカテーテルの先端を事前に浸します。

  1. ブリッジ·アンプのmillar1チャンネルにミラーセンサーを接続し、水柱にミラーセンサーチップを挿入します。
  2. 0 CMH 2 Oに水柱値を設定データ解析ソフトウェアのウィンドウでは、ブリッジは、それを増幅し、ゼロを選択します。ベースライン値0 CMH 2 Oを設定することができる。
  3. 20 CMH 2 Oに水柱値を設定データ解析ソフトウェアのウィンドウの進捗を実行し、停止します。増幅するブリッジの窓に「単位」を選択し、それに応じて0〜20 ​​CMH 2 Oのベースラインを設定。 <CMHへの「ユニット」を調整サブ> 2 O
  4. 同じように、CAPを測定するためのmillar2のキャリブレーション(2ベースライン90,110 CMH 2 Oを設定します)。

1.2)血流プローブ較正

  1. 脱イオン水にプローブを入れてください。遷音速流量プローブシステムとプローブを接続します。
  2. データ解析ソフトウェア]ウィンドウで、フロープローブをゼロに増幅する入力を選択します。単位を調整します。
  3. 信号を収集するために「テストチャンネル」のボタンを押します。信号が3-4の棒を持っている場合は、信号が良好であることを意味します。良好な信号が取得された場合には、手順を継続することができる。
  4. 値がキャリブレーションされているか否かを見るために「ゼロチャンネル」にあるボタンとスケールチャネルを押します。
  5. 後で測定のための「測定チャネル」のボタンを押します。

2外科的処置のためのマウスを準備

  1. 誘導チャンバ内にマウスを置き、2%イソフルランでマウスを麻酔し、0.3ml /分の酸素。マウスの足指ピンチ引っ込め反射が存在しない場合に動作を行うことができる。
  2. 左首と腹部を含む外科領域の毛皮を剃る。
  3. 動作テーブルの上でマウスを置き、テープを使用して固定します。動作期間中の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
  4. 首のオペレーションフィールドの最適な露光のために首の下にガーゼクッションを配置します。
  5. 演算フィールドを消毒し、唯一のオープン手術野を残して、マウスをカバーするために滅菌ガーゼを置きます。

3バイタルパラメータ測定

  1. マウスの足に皮下心電図の針を挿入します。
  2. マウスの背中の下で呼吸センサーを配置します。
  3. マウスの直腸内に温度プローブを配置します。
  4. レコード温度、ECGおよびデータ解析ソフトウェアでのマウスの呼吸数。

Sに対する4。ネック運用ystemic心臓血管モニタリング

4.1)船舶郭清

  1. 首の真ん中のライン、鎖骨の中間点、下顎の角度を特定します。
  2. 中央の線の左側に0.5センチメートルで鎖骨の中間点に、下顎の角度から2センチメートル縦切開を加えます。
  3. 顎下腺を解剖、それを裏返しし、生理食塩水に浸したガーゼでそれをカバーしています。
  4. 頸静脈を特定し、それを分析し、それ以降の連結および固定のために静脈の下で3 6-0絹縫合糸を配置します。
  5. 二腹筋の肩甲舌骨と後の腹の優れた腹から分離、胸鎖乳突筋を特定し、頸動脈を簡単に露出するためのリトラクターでそれを引き出します。
  6. 頸動脈を解剖し、後で連結および固定のために動脈の下に3 6-0絹縫合糸を配置します。

4.2)頸動脈の血流測定

  1. 遷音速を配置、頸動脈を中心に探る安定し、それを維持し、超音波ゲルまた​​は生理食塩水を使用して連絡先を最適化します。
  2. データ分析ソフトウェアを用いて遷音速装置の小さな画面上に示されるように、頸動脈のレコード血流速度
  3. 測定が完了した後にプローブを削除

4.3)頸動脈動脈圧測定(CAP)

  1. 頸動脈の遠位端部を連結し、その近位端部をクランプする。
  2. 頸動脈の周囲2の固定縫合糸を配置します。滞在縫合のために10-0プロレンを使用してください。
  3. 血管の前壁に小切開を加えます。
  4. ミラーカテーテルを挿入し、事前に配置された縫合糸で固定します。
  5. データ解析ソフトウェアで、CAPを記録します。

4.4)頚静脈血流測定を

  1. 頸静脈を持ち上げ、流量を測定するために、遷音速流量プローブを配置します。
  2. データ分析ソフトウェア内の流量を記録する。

4.5)中心静脈圧測定(CVP)

  1. 頸静脈の近位端をクランプと遠位端とを連結する。
  2. 血管の前壁にmicroscissorsを使って小さな切開をカット。
  3. 液体で満たされたカテーテルを挿入し、前に置か縫合線で固定します。
  4. データ解析ソフトウェアでCVPを記録します。

肝血行動態の取得のために5。開腹手術

5.1)船舶識別

  1. 腹部に横切開を加えます。
  2. 左側に腸をEventerateとウェットガーゼでカバーしています。
  3. 下大静脈、門脈、肝動脈と固有肝動脈を識別します。
  4. 全体監視手順の間、5分毎に腹部や腸の表面にいくつかの温かい生理食塩水をドロップします。

5.2)門脈血流量の測定を

  1. 門脈を解剖。
  2. フロープローブを配置するとき、容器の持ち上げを容易にするために、門脈の下に6-0絹を置きます。
  3. 門脈の周り遷音速流量プローブを配置し、その血流量を測定します。
  4. 門脈の血流量を記録します。

一般的な肝動脈の流れの5.3)測定

  1. 慎重に総肝動脈を解剖。
  2. 容器の持ち上げを容易にするために、容器の周りに1 6-0絹縫合糸を配置します。
  3. 動脈周囲のフロープローブを配置します。
  4. その血流を測定し、データを取得する。

門脈圧力の5.4)測定(PVP)

  1. ストレート門脈に排出する、いくつかの側枝と腸間膜静脈、のいずれかのブランチを選択してください。
  2. 選択した腸間膜静脈の遠位端部を連結する。ライゲーションは、腸管に近いことを確認してください。その小さな枝を結紮
  3. 2 Fを配置静脈の周りに6-0プロレンを使用して縫合糸をixing。この手順の重要な点は、静脈を結紮する際腸間膜動脈に触れないようにすることです。
  4. 門脈の近位端を固定します。
  5. 10-0プロレンを使用して2ステー縫合糸を配置します。ステー縫合糸が細い腸間膜静脈の血管壁を貫通必要があるため、一部の出血が発生します。
  6. 45度の角度で斜めにmicroscissorを使用して静脈に小さな切開を行います。
  7. 門脈に腸間膜静脈ミラーカテーテルを挿入し、それを修正
  8. 門脈圧を記録します。手順の最後に、麻酔下で放血によってマウスを生け贄に捧げる。

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Representative Results

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このような呼吸数及び心拍数のようなマウスのバイタルパラメータは明らかにラットにおけるよりもはるかに高い。平均全身血圧および頚静脈圧は、ラット値に類似しており、ヒトのデータにでも同様である。

肝血行動態データは明らかに異なっている。私たちは、8匹のマウスから正常値を得た。正常マウスにおける門脈血流が1.6〜2.3ミリリットル/分の範囲であった。総肝動脈内の流れは、0.10〜0.35 ml /分の範囲であった。正常な動物での門脈圧が8.09±2.47の平均値CMH 2 O(表1)、O CMH 2 4.4から11.2の広い範囲であった。正常な動物の小グループの平均値を比較するときに、この広い範囲は小さいが有意でない差異をもたらし得る。

私たちは、特にポータル圧力にかなりの個体間の違いを観察しているので、私たちは、小さな内の個人差が、この技術を用いて検出することができるかどうかを試験しNIQUE。部分肝切除と肝葉クランプ/デクラン:私たちは、2つの異なる実験の設定では、この手順を評価した。ポータルの圧力の前と直後に、同じ動物における70%部分肝切除(N = 20)(= P <0.001)O CMH 2 6.87±2.39と11.41±2.94から2倍に増加した( 図1)。ヒト7に、他の種5,12で観察され、これらの結果は、同様の範囲であった。

切除前の通常門脈圧と門脈圧は、二つの異なるグループ(通常の監視パラメータのグループから1つ、70%PHグループから他)から得た。 CMH 2 2.47±8.09(私たちの実験で観察されたように、正常マウスでは門脈圧(4〜11 CMH 2 O)の広い範囲に、動物の小グループの平均値は、多少異なる場合がありますため、O CMH 2.39±6.87対2 O)。データを分析する場合しかし、私たちはSTATISがなかったことを発見これら二つのグループ(P = 0.237)との間の的に有意差が。

クランプ/非クランプ実験手順は、ポータル圧力のさらに小さな変更を取得するのに十分な感度であることを実証するように設計されました。肝臓質量の20%を代表する右葉の締付けは、約17%の増加をもたらした。中央値と左側葉の更なるクランプは、出発門脈圧と比較して、少なくとも2〜3の折り目の増加を引き起こした。肝臓の70%の締め付けをもたらす右葉からクランプ解除時ポータル圧力は、開始圧力に次第に戻される。中央値と左側葉( 図2および表2)を供給する左門脈からクランプを削除するときに圧力が開始レベルに戻った。偽手術群のMAPは、腹部を開いた後1時間以内に安定していた。同等の時点で得られた対照群のマウスのMAP、クランプ実験のように、実験群のMAPと比較して有意差がなかった。両方の実験の結果は、20%未満の小さな個体内の変更は、この手順を用いて検出することができたことを明らかにした。

重度の出血や渋滞などの代表的な合併症が手術中に発生する可能性があります。重度の失血が重要なMAPの減少だけでなく、PVPを引き起こすので、この合併症によるマウスの結果は、排除すべきである。肝葉クランプ実験を行う際に静脈鬱血および血栓症を避けるために、クランプの前に小用量のヘパリン(500 U / kg)を手術中に注入することを示唆している。総肝動脈は、血管を持ち上げプローブを配置する等の取り扱いの際に過渡的血管痙攣を受けることができる。これは、肝臓の過渡短い虚血を引き起こす可能性があります。一般的には、けいれんは数分以内に自然に解決されることがあります。 CHA短い血管攣縮は深刻な問題となっていません肝臓虚血再灌流障害に着目した場合、動物の生活にはなく、実験結果に干渉する場合があります。

結論として、この手順は、困難なく実現可能である。それも、経験豊富なマイクロ外科医のためのいくつかの訓練を必要とします。により前と介入後の異なる動物で得られた圧力データの高個体間変動の比較に決定的な結果につながらないことがあります。そこで私たちは、同じ動物内介入前と後のデータを取得することにより、急性実験で肝血行動態の短期調節を研究するには、この手順をお勧めします。

パラメータ自身のデータが得られ報告されたパラメータ
バイタルパラメータ心拍数(n = 8)の 418±55 BPM 389(353から566)BPM 1
162±11 BPM 254±28 BPM 2
温度(n = 8)の 33.56±0.54°C 36.1から36.6℃で11
全身血圧(CAP)(n = 8)の 130.54±20.47 CMH 2 O
(= 96.02±15.06 mmHg)で
94±15 mmHgの9
中心静脈圧(CVP)(n = 2)の 8.90±3.25 CMH 2 O 5.9±2.0 CMH 2 O 11
肝血行動態門脈フロー(n = 6)の 2.03±0.24ミリリットル/分 3.0(2.5から3.1)ml /分1
3.3ミリリットル/分1
総肝動脈流(n = 6)の 0.20±0.09 ml /分 FOUはありません ND
PVP(n = 8)の 8.09±2.47 CMH 2 O(= 5.95±1.82mmHg) 5.3±1.4センチメートルの生理食塩水3
8.7±2.1 mmHgで4
4mmHg 6

表この監視手順を用いて取得したマウスの1ノーマル全身および肝臓の血行動態パラメータCAP:頸動脈動脈圧; MAP:平均動脈圧; CVP:中心静脈圧; PVP:門脈圧。

図1
図1。以降、70%PH前にPVP。門脈圧前後の70%部分肝切除(N = 20)は、6.87±2.39および11.41±2.94 CMH 2 Oであったwww.jove.com/files/ftp_upload/51955/51955fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

パラメータ(cmH2Oの) 開腹後、 肝臓の20%をクランプした後(RL) (RL + ML + LLL)は、肝臓の90%をクランプした後、 肝臓の70%をクランプした後、(ML + LLL) 最後に、(すべてのクランプを解除する)
PVP - expのグループクランプ(n = 10)に 9.59±4.00 10.45±3.89 25.78±8.99 16.91±9.86 11.14±4.48
平均CAP - expのグループクランプ(n = 10)に 121.50±18.67 95.89±32.76 74.41±35.35 93.88±42.96 89.44±44.20
平均CAP - シャム群(n = 3) 123.33±12.42 121.0±5.57 124.00±8。66 127.33±7.23 123.00±8.89

表2血行動態応答クランプと異なる肝葉のクランプ解除後に(n = 10)にRL:右葉、ML:(右中葉と左中葉含む)中葉、LLL:左側葉。

図2
クランプと異なる肝葉のクランプ解除後に、図2血行動態応答(動物ID:CHI-108)A.。 PVPは、右のミラーカテーテルを挿入した後にCMH 2 O 8.8であったPVPは、20%の肝葉をクランプした後、10.8 CMH 2 OBPVPは、90%の肝葉をクランプした後、17.5 CMH 2 Oに上昇した。右葉のクランプを解除する際C. PVPは10.3 CMH 2 Oに減少した。 D.PVPはCMH 2 8.7に戻ったこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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肝血行動態のモニタリングは、肝臓学及び肝胆道外科における重要な研究ツールである。肝血行動態データの取得は、循環系に肝胆手続きの効果を特徴づけるために役立ちます。血管作用薬を評価する研究では、必要に応じて肝血行動態データの取得はまた、 例えば、門脈圧とポータルの流れに影響を与える薬剤の効果を研究するために必要とされる。

小さなサイズにもかかわらず、全身性の重要なパラメータ、および肝臓の血行動態は、マウスにおいてモニターすることができる。次のようにプロトコル内の重要なステップであった:第一に、それは循環器機能障害につながる可能性が低体温症を避けるために、全体の手順の間、温暖化パッドの上に動物を配置することが重要です。マウスの血管壁は非常に壊れやすいと薄いため第二に、それは、マウスの血管を切開する際に非常に慎重であることが重要です。それは、目の上のいくつかの脂肪組織をつかんによって血管壁を固定するのが最善と思われる代わりに、血管壁自体をつかん者の電子面。第三に、腸間膜静脈の周りに固定縫合糸を配置するときに動脈供給を損なわないための腸間膜動脈を誤って結紮を回避することが重要です。

しかし、侵襲的な指導技術はいくつかの制限があります。 最初のものは、それ自体で、その侵襲性である。この監視手法は、外科的介入を必要とする侵襲的な方法である。したがって、監視手順自体は動物のための副作用を引き起こすことがある。したがって、私たちは唯一ではなく、生存実験で、正常な動物で急性実験で血行動態パラメータを取得するには、この手順を使用していました。次のステップでは、生存実験において、この手法を評価する。この手順の第2の制限は、それが実質的な顕微手術の経験を必要とすることである。マウスでの血行動態モニタリングは、特に訓練を受けたmicrosurgeonsが行ってください。最も困難なパーこの静脈は非常に脆弱であるため、この監視手順のtは、小さな腸間膜静脈内ミラーカテーテルの挿入である。私たちの手では、約10のトレーニング操作は前に、技術的には、この手順を習得する経験豊富なマイクロ手術の専門医のために必要とされた。経験が正常ラットまたはマウスでは50以上の血管吻合(頸動脈、頸静脈)を実行したと定義した。 第三の制限は、この方法で得られたポータル圧力は正常動物のための生理的な範囲を下回る可能性があることである。腸間膜静脈ライゲーションおよびカテーテルの挿入は、推定10%門脈に排出する血液の総体積を減少させることができる。しかし、この生理学的範囲は、現在利用可能な装置を用いて取得することができない。同様に、PVPでの麻酔自体の効果は13を排除することはできない。すべての動物が同じ介入に供されるので、潜在的なエラーが系統誤差となる。そのため、DATAの解釈には注意が動物との間の絶対差に必ずしも動物内での相対的な変化に焦点を当てていないと実行する必要があります。

しかし、げっ歯類における侵襲血行動態モニタリングにはほとんど選択肢があります。非侵襲的なモニタリングは、全身血圧の取得に制限されている。門脈圧またはポータル·フローは、マウスにおいて非侵襲的に決定することができない。遠隔監視は、全身血圧の取得に制限されている。報告は、他の血行動態パラメータの遠隔取得に関する見つかりませんでした。

このフル術中監視手順は、包括的に、肝臓の灌流の調節、肝再生および肝胆道手術のような肝臓の生理学的プロセスを理解するために必要とされる。リアルタイムで、手術実験動物のデータを監視および収集する機能は、このように肝ジ研究における著しい進歩を表すsea​​seと門脈圧亢進。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

Acknowledgments

この研究は、「仮想肝ネットワーク」の資金教育研究ドイツ連邦Ministery(BMBF)によってサポートされていました。私はビデオを生成すると音声を記録するためのアニメーションとイザベル素早く方向を変えるの作成に彼らの助けのためのイエナ大学病院のメディアセンターからフランクシューベルトとルネグンペルトに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PowerLab 16/30  ADInstruments PL3516
Quad Bridge Amp ADInstruments FE224 Bridge amplifier 
Animal Bio Amp ADInstruments FE136
Needle Electrodes for FE136 (3 pk) ADInstruments MLA1213
Perivascular Flowmeter Module Transonic TS420
Flowprobe MA0.5PSB/MA1PSB Transonic MA0.5PSB/MA1PSB
SPR-1000 Mouse Pressure Catheter Millar instruments 841-0001
fluid filled catheter  Terumo SR+DU2619PX 26G, 0.64×19mm
micro scissors F·S·L No. 14058-09
micro serrefine F·S·L No.18055-05
Micro clamps applicator F·S·L No. 18057-14
Straight micro forceps F·S·L No. 00632-11
Curved micro forceps F·S·L No. 00649-11
needle-holder F·S·L No. 12061-01
6-0 silk ethicon
6-0 prolene ethicon
7-0 prolene ethicon
10-0 prolene ethicon
Tail cut-off device  Kent Scientific www.kentscientific.com
LabChart7 ADInstruments data  analysis software 

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References

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マウスにおける全身および肝血行動態パラメータの監視
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Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice. J. Vis. Exp. (92), e51955, doi:10.3791/51955 (2014).More

Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice. J. Vis. Exp. (92), e51955, doi:10.3791/51955 (2014).

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