Introduction
مستقبلات الغلوتامات توسط غالبية انتقال متشابك مثير في نقاط الاشتباك العصبي الجهاز العصبي المركزي. الأنواع الفرعية الرئيسية اثنين من مستقبلات الغلوتامات ionotropic المحلية على رأس العمود الفقري للغشاء بعد المشبكي هي N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA) وα-أمينو 3 هيدروكسي-5-methylisoxazole-4-proprionic حمض (أمبا) مستقبلات. في إمكانات غشاء يستريح، مستقبلات أمبا تحمل معظم التيار بعد المشبكي أثناء انتقال متشابك. في قرن آمون، ومستقبلات NMDA يلعب دورا رئيسيا في إحداث تغييرات في عدد مستقبلات أمبا في الغشاء بعد المشبكي: من خلال العمل ك "كاشف صدفة" 1 لبدء تغييرات في قوة متشابك 1، يشارك مستقبلات NMDA في آليات متشابك التي يعتقد أنها تدعم التعلم والذاكرة عند مستوى التحت خلوية. ردا على الاستقطاب من عصبون بعد المشبكي بالتوازي مع إطلاق الارسال قبل المشبكي، يدخل الكالسيوم عبر NMDAمستقبلات لبدء أمبا مستقبلات الإدراج أو إزالة 2. هذه الديناميات مستقبلات تكمن وراء المشبك اللدونة: زيادة في قوة متشابك هي على المدى الطويل التقوية 2،3 (LTP)، في حين أن الانخفاض في قوة متشابك طويل الأجل الاكتئاب 4 (LTD). لذا يعتقد حركة مستقبلات أمبا ليكون مسؤولا عن اللدونة متشابك التعبير، في حين يعتقد مستقبلات NMDA للسيطرة على تحريض لها.
تحديد الآليات الدقيقة الكامنة وراء انتقال متشابك واللدونة يتطلب دراسة المجموعات الصغيرة من نقاط الاشتباك العصبي، من الناحية المثالية نقاط الاشتباك العصبي واحدة. في حين أن بعض نقاط الاشتباك العصبي هي مناسبة للغاية للدراسة في هذا المستوى، على سبيل المثال، كاليكس من عقد 5، للسكان الأكثر متشابك هذا أمر صعب للغاية نظرا لطبيعة الصغيرة ومنتشر من الاتصالات متشابك. وقد وضعت اثنين من التقنيات الرئيسية لدراسة الكهربية اتصالات متشابك واحدة: الأول هو الحد الأدنى من التحفيز، وهرالبريد يفترض الألياف قبل المشبكي واحد حفز خارج الخلية. يتم إقران التقنية الثانية التسجيلات، حيث يتم تنفيذ اثنين في وقت واحد التسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. والميزة الرئيسية لأدنى التحفيز هو أنه سريع وبسيط نسبيا لأداء، التي تنطوي على وضع لتحفيز الكهربائي خارج الخلية في الجهاز محور عصبي أثناء تسجيل في وقت واحد من عصبون بعد المشبكي. الشاغل الرئيسي عند استخدام هذه التقنية هو أن التحفيز موثوق بها من خلية واحدة نادرا ما يمكن ضمان المحاكمة بعد المحاكمة.
على مدى السنوات الخمس عشرة الماضية ولقد استخدمت بشكل روتيني تقرن تسجيلات خلية كاملة من اثنين من الخلايا العصبية الهرمية مرتبطة synaptically 6-17. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن واحدا فقط عصبون قبل المشبكي يتم تحفيز باستمرار وبشكل موثوق. كما يسمح ليس فقط توصيف الكهربية ولكن أيضا التلاعب الدوائية للعصبون قبل المشبكي 6،18 </ سوب>. ومع ذلك، فإن احتمال اتصال متشابك بين الخلايا العصبية منخفضة، مما يجعل أزواج متصلة الصعب الحصول على 19. استخدام عضوي النمط الثقافات شريحة الدماغ تلتف هذه العقبة واتصال متشابك يمكن إعادة إنشاء في المختبر، وعلاوة على ذلك طبيعة الربط الناتجة مماثلة لتلك التي في أنسجة المخ الأم 20. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات عضوي النمط تعبر LTP، LTD 7-10،12-15،21 وأشكال إضافية من اللدونة متشابك على المدى القصير بما في ذلك تسهيل إقران النبض (PPF)، والاكتئاب (PPD) 6،22،23، وتمكين آليات اللدونة ل دراستها في أزواج من الخلايا العصبية. نحن هنا وصف منهجية مفصلة المشاركة في تحقيق التسجيلات المقترنة في هذا النظام بنجاح في المختبر. يمكن بسهولة أن تتكيف هذه المعلومات إلى أنظمة تجريبية أخرى، بما في ذلك شرائح الحادة ومناطق أخرى من الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان أخلاقيات الحيوان:
البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطة تتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان التي وضعتها جامعة أوكلاند وجامعة ستانفورد. الموت الرحيم كانت الفئران الوليدة P7 بواسطة قطع الرأس السريع. ثم يتم إجراء تشريح الحصين على الفور كما هو موضح أدناه.
1. الحصين عضوي النمط من الثقافة شريحة
- إعداد
- إعداد تشريح متوسط (تستخدم فقط لتشريح الدماغ). الجمع بين 200 مل متوسط الحد الأدنى الضروري، 2 مل من محلول البنسلين الستربتوميسين (10،000 وحدة كل منها، في 0.85٪ كلوريد الصوديوم)، 5 مل HEPES حل العازلة، 2 مل 1 M تريس حل سهم (7.2 درجة الحموضة)، وتصفية تعقيم مع 0.22 ميكرون فلتر . إجراء تشريح الحصين في الجليد الباردة المتوسطة تشريح.
- تبريد المتوسطة تشريح. وضع وسائل الإعلام تشريح في الثلاجة حوالي 1 ساعة قبل البدء في تشريح حتى السائل هو بارد جدا. لا تسمح كر الجليد كبيرystals لتشكيل. تخزين على الجليد حتى المطلوبة.
- إعداد مستنبت (التي تستخدم لكل شيء ما عدا تشريح الحصين). الجمع بين 100 مل متوسط الحد الأدنى الضروري، (تركيز 1X، السائل) ث / أملاح هانك، ث / L-الجلوتامين، 2 مل من محلول البنسلين الستربتوميسين (السائل، 10،000 وحدة كل منها، في 0.85٪ كلوريد الصوديوم)، 2.5 مل HEPES 1 M عازلة الحل، 50 مل محلول ملح هانك المتوازن، 50 مل مصل الحصان (المعرفة والحرارة المعطل)، ومرشح تعقيم مع 0.22 ميكرون التصفية.
- إعداد أطباق الثقافة. وضع 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة في صحن الثقافة 35 مم، وإضافة إلى إدراج غشاء كل طبق. وضع ما يصل الى سبعة من هذه الأطباق إلى واحدة 150 مم طبق بتري (المشار إليه فيما بعد باسم 'لوحة'). وضع لوحة في حاضنة CO 2 لمدة ساعة على الأقل قبل أن يبدأ تشريح بحيث مستنبت في أطباق يبلغ درجة حرارة مناسبة ودرجة الحموضة.
- تشريح الحصين من الفئران الجراء بعد الولادة في يوم واحد 7 (P7)
- قبل تعقيم جميع الأدوات تشريح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل الإجراء.
- بعد قطع الرأس السريع، وإزالة المخ والمكان إلى المتوسطة المبردة في طبق واحد، ثم إزالته إلى قطعة من ورق الترشيح مبلل للتشريح. ندف القشرة بعيدا عن الدماغ المتوسط باستخدام ملاعق البلاستيك المغلفة السلس حادة مصغرة، وفضح الحصين. قطع القبو، ومن ثم العمل بلطف ملعقة تحت الحصين على الوجه بها (الشكل 1A).
ملاحظة: الناجحة الثقافات شريحة يمكن إعدادها باستخدام الحيوانات يصل إلى P10. - تقليم الحصين معزولة بعيدا عن بقية الدماغ. نقل الحصين في طبق جديد يحتوي على وسائل الاعلام تشريح المبردة باستخدام الفرشاة ناعمة مبللة (على سبيل المثال، الأبيض السمور رقم 4).
- تنظيف السفلي (أي الجانب تملق) من الحصين من الضفيرة المشيمية خلال تشريح، وجعل هذه، مثل الأنسجة الاسفنجية meninge صعوبة في فصل الحصينشرائح من بعضها البعض في وقت لاحق.
ملاحظة: اترك هذه الأنسجة في مكان إذا لا يمكن مثار بلطف بعيدا. - إجراء تشريح كامل في أسرع وقت ممكن دون الإضرار الحصين.
ملاحظة: تشريح دقيق هو أكثر أهمية من واحد سريع، طالما المبردة الظروف التجريبية. شريحة الحصين من الفئران ثلاثة في وقت واحد. لا تتأثر صحة شريحة طالما أن الوقت الإجمالي من البداية وحتى عندما تذهب شرائح مطلي في الحاضنة تحت 30 دقيقة.
- تشريح
- شريحة الحصين بالعرض إلى 400 ميكرومتر عبر المقاطع باستخدام تقطيع النسيج اليدوي. الطريقة التي يتم من خلالها إجراء تشريح ليس مهما، ما دام أنها ليست ضارة بشكل مفرط إلى الأنسجة وتنتج شرائح من سمك يتماشى مع العمارة الصفحي مرئية بسهولة (أي ينظر القرن عمون بسهولة ليتم الحفاظ عليها في الأنسجة).
- تكمن الحصين على مرحلة النسيجالمروحية على رأس سمك الثلاثي رقم 2 من ورق الترشيح. وشرائح الحصين تماما دون إزالة أي شرائح بشكل فردي (أي ترك الحصين كامل على مسرح المروحية حتى بذلت جميع القطع، وليس مثل رغيف الخبز شرائح في هذه المرحلة، الشكل 1B).
- نقل الحصين في تشريح المتوسطة باستخدام الفرشاة الناعمة وضعت بجانب بعضها الحصين (أبيض السمور 2 #). دفع بلطف كل الحصين إلى الجانب لكسر التصاق بين الحصين ورقة الترشيح الأساسية. لفة فرشاة تحت كل الحصين لاستلامه قبالة المرحلة. وضع كافة الحصين في نفس طبق بيتري 35 ملم من المبرد المتوسطة تشريح. فصل الحصين إلى شرائح الفردية عن طريق التحريض الطبق يدويا بالتناوب في اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة الاقتراحات.
- تفقد شرائح تحت المجهر تشريح وتجاهل أي التي تضررت، صغيرة، أو التي لا تمتلك خلية واضحة للعيانطبقات الجسم.
ملاحظة: وسوف يكون هذا هو الحال في كثير من الأحيان أن لا يتم فصل جميع شرائح بنجاح من أشقائهم بهذه الطريقة. في هذه الحالة، فإنها يمكن فصلها عن طريق تحويلها على حافة والحث لهم نصائح من ملقط غرامة. ثم يتم نقل شرائح "جيدة" إلى طبق بتري نظيف آخر يحتوي المبرد المتوسطة تشريح باستخدام قطع ومصقول النار ماصة باستير (أرقام 1C-E).
- التخزين
- وضع شرائح الفردية على إدراج مرشح الغشاء. باستخدام ماصة باستور قطع والنار مصقول لإعطاء تتحمل أكبر، بشكل فردي نقل شرائح إلى إدراج الثقافة.
ملاحظة: حجم تجويف إنشاؤها عند قطع وتلميع ماصة النار هو المهم. صغيرة جدا وسوف لا تترك شرائح بسهولة ماصة للغشاء. يوضع السائل كبير جدا والزائد على سطح الغشاء مع شريحة. أفضل قطر تتحمل عادة حوالي نصف بقطرالعطر للبرميل ماصة. عندما قطع، وهذا القطر ويمكن اختيار طريق قطع في المكان المناسب على تفتق من ماصة. - نقل شريحة
- ملء مع ماصة المتوسطة أولا، ثم تمتص شريحة واحدة مع القوات شفط صغيرة. هذا يحافظ على شريحة قرب افتتاح ماصة ويمنع الكثير من طرد المتوسط في إدراج لوضع شريحة.
- تطبيق ضغط طفيف على لمبة لتشكيل قطرات صغيرة معلقة، والسماح للشريحة ليستقر في تلك القطيرات، ومن ثم لمس أن قطرة للغشاء، والسماح للشريحة "سقوط" على الغشاء. عموما يتم وضع ثلاث شرائح على كل إدراج الغشاء.
ملاحظة: إذا كان قطرة السائل كبيرة جدا، قطرات من ثلاث شرائح تميل إلى دمج على سطح الغشاء، وسوف يجتمع كل شرائح بالتالي إلى وسط الغشاء، مما يجعل الأمر أكثر صعوبة للفصل بينهما لتسجيل الكهربية في وقت لاحق.
- ازالتها السوائلآل
- نضح أي وسيط الزائدة من الجزء العلوي من لوحة إدراج الثقافة لجميع شرائح في ذلك لوحة (3 شرائح في إدراج = 21 شرائح لكل لوحة)، بحيث لا يتم مغمورة في شرائح أو تحيط به مجموعة من تشريح المتوسطة.
- أداء هذا مع تقطيعه، ولكن مصقول النار ماصة باستير. السماح للشريحة ليستقر وتلتزم الغشاء لمدة دقيقة قبل pipetting ل. والحرص على عدم تمتص شريحة تصل إلى ماصة. تنفيذ إزالة السوائل للإدراج التي ومطلي أولا، لإتاحة الوقت الكافي للشرائح ليستقر.
- شريحة التخزين
- مخزن الثقافات شريحة في 5.0٪ CO 2 الحاضنة عند 37 درجة مئوية. نلاحظ الترتيب النهائي للثقافات في الشكل 1E. شرائح الفردية الراحة بناء على إدراج لوحة الثقافة التي لديها غشاء مسامي لأسفل، وهذا يناسب إدراج داخل طبق بتري مليئة كمية صغيرة من المتوسطة. هذا يعني، لا مغمورة شرائح في ليالمتوسط أبعد، لكن الوصول إليها إلا عبر الغشاء في الجزء السفلي من لوحة الثقافة إدراج.
- اختياريا، وإزالة شرائح يجوز للدراسة إما عن طريق إزالة لوحة الثقافة إدراج أو عن طريق الاستغناء عن قسم من إدراج غشاء تحتوي على شريحة.
- وضع شرائح الفردية على إدراج مرشح الغشاء. باستخدام ماصة باستور قطع والنار مصقول لإعطاء تتحمل أكبر، بشكل فردي نقل شرائح إلى إدراج الثقافة.
- صيانة
- تبادل المتوسطة في أطباق بتري في اليوم التالي مما يجعل الثقافات. نقل لوحة الثقافة تضاف إلى طبق بتري جديدة تحتوي على 1 مل من مستنبت الطازجة التي يتم معايرتها في الحاضنة لمدة ساعة على الأقل قبل نقلها.
- تغيير متوسطة مرة أخرى بنفس الطريقة في اليوم الثالث بعد إجراء الثقافات. في اليوم الثالث، ونقل الثقافات إلى حاضنة وضعت في 34 درجة مئوية. تغيير متوسطة مرتين أسبوعيا (كل 3-4 أيام).
- التعرف على ثقافات صحية. حدد ثقافات صحية لتقرن تسجيلات خلية كاملة.
ملاحظة: ثقافات صحية لها حافة واضحة المعالم وطبقة الخلايا الهرمية محددة بوضوح. الثقافات الطرافةيتم رفض ح الظلام (نخرية المرجح) المناطق الحالية أو ظهور الرغوة مع الحدود بالارض. توظيف هذه المعايير، عادة ثلثي الثقافات شريحة هي بما فيه الكفاية صحية للتسجيل. - الاستفادة من هذه الثقافات داخل نافذة صغيرة نسبيا من الزمن. لا تستخدم الأنسجة التي تكون تربيتها لمدة أكثر من أسبوعين منذ تبدأ الخلايا العصبية لعرضه سلوك صرعي قليلا التي تزداد سوءا ببطء مع مرور الوقت. ولا يعرف الحد الأعلى المحدد من بقاء الخلايا العصبية ولكن من الممكن لتسجيل من أداء وظيفته الخلايا الهرمية في وقت متأخر من 16 أسابيع في الثقافة.
2. المقترنة تسجيلات خلية كاملة
- ACSF والحلول بين الخلايا
- إعداد الحل الكهربائي قبل المشبكي عن طريق خلط (مم) 120 غلوكونات البوتاسيوم، 40 HEPES، 5 MgCl 2، 2 NaATP، و 0.3 NaGTP (الرقم الهيدروجيني 7.2 مع KOH. الأسمولية: 290 الميلي أسمول). بينما يستخدم المحلول الكهربائي لنفس الخلايا العصبية بعد المشبكي، غلوكونات السيزيوم (120 ملي) عادة ما تستخدم كملح رئيسيا في القطب بعد المشبكي، بالإضافة إلى 5 ملي QX314.
ملاحظة: وهذا يمكن مستقر لقط الجهد في الامكانيات الايجابية لتسجيل بعد المشبكي بوساطة NMDAR التيارات 8-10،13. كما يمنع فرط الاستثارية التي يسببها البوتاسيوم من الخلايا العصبية قبل المشبكي من حل داخلي تتدفق من القطب تسجيل بعد المشبكي قبل اتخاذ ختم جيجا أوم. - إعداد الحل الكهربائي بعد المشبكي تأليف (مم) 120 السيزيوم غلوكونات، 40 HEPES، 5 MgCl 2، 5 QX314، 2 NaATP، و 0.3 NaGTP (الرقم الهيدروجيني 7.2 مع CsOH، الأسمولية: 290 الميلي أسمول). سحب الميكروية الزجاج في 5-10 MΩ المقاومة وملء مع تصفيتها حل داخلي.
- تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) تأليف (مم) 119 كلوريد الصوديوم، و 2.4 بوكل، MgSO 4 1.3، 2.4 CaCl 2، 1 نا 2 هبو 4، 26.2 NaHCO 3، 11 الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.4، مشبعة 95٪ O 2، 5 ٪ CO 2. ملاحظة: إذا ص AMPAR بوساطةتحتاج إلى esponses يكون قد تم حظره لفحص NMDAR EPSCs، وتشمل 10 ميكرومتر أو CNQX NBQX في ACSF.
- إعداد الحل الكهربائي قبل المشبكي عن طريق خلط (مم) 120 غلوكونات البوتاسيوم، 40 HEPES، 5 MgCl 2، 2 NaATP، و 0.3 NaGTP (الرقم الهيدروجيني 7.2 مع KOH. الأسمولية: 290 الميلي أسمول). بينما يستخدم المحلول الكهربائي لنفس الخلايا العصبية بعد المشبكي، غلوكونات السيزيوم (120 ملي) عادة ما تستخدم كملح رئيسيا في القطب بعد المشبكي، بالإضافة إلى 5 ملي QX314.
- الحصول الموثوقة الجامع تسجيلات خلية
- لدراسة انتقال متشابك بين الخلايا العصبية الفردية، تعيين عصبون واحد كما عصبون قبل المشبكي وعقد في المشبك الحالي للحث على إمكانات العمل وبدء انتقال متشابك.
- تسمية الخلايا العصبية الثانية، حيث أن الخلايا العصبية بعد المشبكي، والاحتفاظ بها في المشبك الحالي أو الجهد اعتمادا على المعلومات المطلوبة من قبل الباحث. الحصول على فحص مفصل لتيارات الجلوتامين، مع EPSCs AMPAR بوساطة فحص في -65 بالسيارات وEPSCs بوساطة NMDAR فحصها في +30 بالسيارات 6-16 من خلال عقد عصبون بعد المشبكي في المشبك الجهد
- إنشاء تسجيل المقترنة. لإنشاء تسجيل تقرن، وتسجيل كامل الخلية قبل المشبكي دائما الحصول أولا، تمكين متعددة الخلايا العصبية بعد المشبكي متتابعة التي يمكن الحصول عليها حتى واحد هو أن synaptically كنكتيتم الحصول د. إذا إجراء التجارب اللدونة متشابك، فمن الأهمية بمكان خصوصا للحصول على الخلايا العصبية قبل المشبكي أول ما تحريض LTP في عصبون بعد المشبكي يجب أن تبدأ في غضون 10 دقيقة من الحصول على تسجيلات خلية كاملة لمنع تبييض عوامل هيولي اللازمة لLTP 8،19.
- تجنب فقدان الخلايا الناجم عن الحركة. ثمة تحد رئيسي عند تنفيذ تقرن تسجيلات خلية كاملة وتجنب الاهتزاز والاضطراب الناجم عن حركة أول تسجيل خلية كاملة في حين الحصول على تسجيل الثاني.
- الحصول على تسجيل أول خلية كاملة ثم نقل المجهر عدسة 10-200 ميكرون في محور س بحيث يقع تسجيل أنشئت على حافة المنطقة المرئية على الشاشة (الشكل 2A).
- رفع عدسة المجهر ~ 5-10 ملم مع ضمان أن ACSF لا تزال تحتفظ اتصال مع العدسة. جبل القطب الثاني وتوجيه في الغضروف المفصلي السائل (الشكل 2B
- نقل الكهربائي في الطائرة س ص حتى يتم مباشرة تحت مسار الضوء من خلال عدسة ولكن لا يزال أعلى بكثير من القطب تسجيل المعمول بها. مرة واحدة القطب مرئيا تحت المجهر، وضمان غيض هو على حافة بكثير من الشاشة بعيدا عن القطب الأول.
- تحرك القطب الثاني لأسفل في تسلسل مع التركيز المجهر حتى كل من الأقطاب الكهربائية هي في نفس المستوى البؤري. من المهم أن مستوى ضغط إيجابي قوي بما فيه الكفاية لتجنب انسداد طرف ولكن ليست قوية جدا وذلك لتعطيل تسجيل أول خلية كاملة. وهذا يترجم إلى ضغط إيجابي يحفز حركة الخلايا العصبية في 2-3 من القطب عندما تدخل أول شريحة.
- تحديد موقع الشريك بعد المشبكي في طائرة التنسيق مماثلة إلى أول تسجيل قبل المشبكي (الشكل 2C). تسجيل عموما الحصول على إقران التسجيلات بين الخلايا العصبية الهرمية CA3 الخلية بأكملها الثانية من 0-200 ملم الخلايا العصبية للص الأولتسجيل مفيدة (أرقام 2C، D).
ملاحظة: انتقال متشابك بين أزواج العصبية مستقرة على مدى فترات زمنية تصل إلى 3-4 ساعة عند استخدام هذه كلها تقنيات التسجيل الخلية القياسية.
- اللدونة متشابك: مرة واحدة عند الحصول على اتصال ناجح synaptically بين زوج الخلايا الهرمية (أرقام 3A، B)، ودراسة خصائص انتقال متشابك واللدونة.
- LTP الاستقراء.
- حمل LTP قبل الاقتران إمكانات العمل قبل المشبكي (1 هرتز) مع الاستقطاب بعد المشبكي إلى -10 إلى 0 فولت لمدة 1 دقيقة (الشكل 3C) 7-9،12-14. بدء الاقتران في غضون 10 دقيقة من كسر في أن الخلايا العصبية بعد المشبكي.
ملاحظة: LTP يمكن أيضا أن يتسبب مع كل من الخلايا العصبية التي عقدت في المشبك الحالي من قبل الاقتران إمكانات العمل قبل المشبكي وبعد المشبكي في 1 هرتز لمدة 1 دقيقة، مع إمكانات العمل بعد المشبكي استخلاصها 10 ميللي ثانية بعد حقن التيار في الخلايا العصبية قبل المشبكي 8
- حمل LTP قبل الاقتران إمكانات العمل قبل المشبكي (1 هرتز) مع الاستقطاب بعد المشبكي إلى -10 إلى 0 فولت لمدة 1 دقيقة (الشكل 3C) 7-9،12-14. بدء الاقتران في غضون 10 دقيقة من كسر في أن الخلايا العصبية بعد المشبكي.
- وعلاوة على ذلك لحث LTD بواسطة التحفيز التردد المنخفض (LFS) في 1 هرتز جنبا إلى جنب مع الاستقطاب طفيف للعصبون بعد المشبكي إلى -55 بالسيارات لمدة 5-10 دقائق (الشكل 3C) 9.
- LTP الاستقراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اتصال متشابك هو واضح من خلال تحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكي لإطلاق إمكانات العمل عن طريق تمرير نبض الحالي إزالة إستقطاب (عادة 20-50 السلطة الفلسطينية لمدة 20 ميللي ثانية) عبر القطب تسجيل. ثم يتم فحص التتبع الحالي بعد المشبكي عن وجود EPSC الأحادي المشبك أثار في القصير (<5 ميللي ثانية) والإختفاء متناسقة بعد ذروة إمكانات العمل قبل المشبكي (الشكل 3A). في معظم التجارب يتم اختبار الخلايا العصبية بعد المشبكي متعددة قبل أن تتمكن من الحصول على زوج المتصلة synaptically. عموما، ~ 1/3 من خلايا CA3 قبل المشبكي تقترن monosynaptically إلى الخلية بعد المشبكية CA3 من الاتصالات المشبكية النشطة (الشكل 3A)، وترتبط حوالي 20٪ من الخلايا العصبية CA3 من الاتصالات المشبكية جميع الصامتة 6،8.
سعة الأساسية أمبا مستقبلات بوساطة تيارات متغيرة من المحاكمة أن يحاكم خلال تسجيل إرفاقها، وأيضا بين باي مستقلةالتسجيلات الحمراء (الشكل 3B) 6،8. وتراوحت متوسط AMPAR EPSC السعة من <10 السلطة الفلسطينية> 800 السلطة الفلسطينية، وعلى الأرجح تنشأ عن الاختلافات في عدد من نقاط الاشتباك العصبي وظيفية بين التسجيلات المقترنة. كما لوحظت معدلات الفشل إلى تتفاوت تفاوتا كبيرا بين التسجيلات يقترن 6،7، تتراوح بين 100٪ AMPAR EPSC معدلات الفشل في نقاط الاشتباك العصبي الصامتة، إلى معدلات فشل 0-95٪ في أزواج متصلة بواسطة نقاط الاشتباك العصبي نشطة 6،7. ضمن التسجيلات يقترن الفردية، وقعت حالات الفشل متشابك، وخاصة في التسجيلات مع سعة أصغر AMPAR EPSC. التغير في AMPAR EPSC السعة هو واضح من المحاكمة للمحاكمة في البيانات الخام (الشكل 3B) هو الأرجح بسبب التقلبات في عدد كمي صدر من المحاكمة إلى المحاكمة، كما يحدث في نقاط الاشتباك العصبي الأخرى 6.
كما توفر المزدوجة تسجيلات خلية كاملة الوصول المباشر إلى كل من قبل والسيتوبلازم العصبية بعد المشبكي، مما manipulat الدوائيةأيون إما / كلا الخلايا قبل المشبكي وبعد المشبكي عبر الأقطاب تسجيل 6. عادة، التلاعب الدوائية قبل المشبكي هي سريعة جدا (في غضون 10 دقيقة). لا يقتصر هذا على الجزيئات الصغيرة (على سبيل المثال، BAPTA)، وdextrans fluorescently المسمى يمكن الوصول إلى محطات قبل المشبكي ≤200 ميكرون بعيدا عن القطب تسجيل. ولتحليل مماثلة لتلك التي أجريت في المشبك الحبار العملاق 25 يمكن أن تمتد إلى دراسات حويصلة متشابك الماكينات الإفراج في شريحة الحصين. لم يتم تحديد موقف من نقاط الاشتباك العصبي محددة تقاس التسجيلات المقترنة في عملية التسجيل. ولذلك فإن الأقرب مقابل المواقع البعيدة من نقاط الاشتباك العصبي لا يمكن تقييمه كما بسهولة كما التحفيز المحلي مع أقطاب تحفيز الخلية أو تطبيق الغلوتامات البؤري. ومع ذلك، صبغ ملء كل عصبون خلال تسجيل تقرن يمكن تمكين إعادة البناء الصرفي العرش محور عصبي متشابك والمواقع المحتملة وبفعل LTP و LTD موثوق في نقاط الاشتباك العصبي CA3-CA3 في هذا النظام ثقافة (الشكل 3C)، وكلاهما أشكال اللدونة تستمر لمدة تسجيلات خلية كاملة (أكثر من 2 ساعة). النماذج LTP و LTD الحث المستخدمة مماثلة لتلك التي تؤدى في شرائح الحادة وLTP و LTD المعرض خصائص NMDAR الاعتماد، ترابطيات والاستقلال المسار، وبالتالي فإن هذا النظام مزيج من الثقافة وتوفر التسجيلات يقترن نظام نموذجا قيما لدراسة متشابك اللدونة 7. وكثيرا ما لوحظ الأحداث المثبطة عديدة التشابكات في تسجيلات تقرن بين أزواج خلية CA3 هرمي الشكل (3D). نحن لا دواء منع هذا تثبيط GABAergic وهذا ينتج فرط النشاط إرباك. ولكن نظرا لالكمون أطول من هذه الأحداث المثبطة عديدة التشابكات، وعموما لا تمنع قياس excitato أحادي المشبكراي الحالي. إذا لوحظت أحداث عديدة التشابكات المثبطة للتدخل في التيار الأحادي المشبك، والتعتيم على ذروة التيار الأحادي المشبك، تحتاج هذه الأزواج إلى أن تستبعد من التحليل. كما لوحظ اتصالات عديدة التشابكات مثير أحيانا، ولكن هم بشكل ملحوظ أقل شيوعا وكذلك يتم استبعادها من التحليل. نادرا ما، يتم الحصول على تيار متشابك المثبطة الأحادي المشبك بسبب عصبون قبل المشبكي كونه عصبون المثبطة. يتم تعريف هذا بسهولة بسبب عدم وجود أماكن الإقامة عمل اطلاق محتمل ردا على أطول (1 ثانية) حقن الحالي. هذا غير ممكن في الخلايا العصبية بعد المشبكي الذي يستند غلوكونات-السيزيوم الحل الداخلي. لكن، وكما يتم تحديد الخلايا العصبية مسبق بصريا إلى التسجيل، في تجربتنا حدث هذا <1٪ من الوقت. يتم تحديد Interneurons ضمن شرائح الحصين عضوي النمط بسهولة بصريا من قبل خلايا الجسم غير هرمي، وخاصة في الطبقة المشععة وoriens. ولهذا العلاقات العامةكما يتيح eparation تسجيلات مثير عصبون والتيارات المثبطة. ومع ذلك، فإن القليل جدا هو المعروف عن شبكات المثبطة في شرائح عضوي النمط، وما إذا كانت المحافظة على الربط مماثلة لتلك التي في الدماغ ليست واضحة. 
الرقم 1. إعداد عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين. (A) وقرن آمون، في الموقع، التي حددها خط منقط. لإزالة الحصين، وقطعت الاتصالات إلى القبو والحصين توالت بلطف من الدماغ. يتم وضع (B) الحصين في مرحلة تقطيع اللحم فوق ورق الترشيح. يتم نقل (C) شرائح الحصين عبر اسعة تتحمل من ماصة باستور لمنع الضرر. (D) أمثلة على "الجيدة" مقابل شرائح 'السيئة'.(E) كارتون من إعداد شريحة على الأغشية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2. الحصول على إقران تسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية قرن آمون CA3. صور متتابعة لتحقيق تسجيل تقرن، والتي تبين القطب الأمثل وتحديد المواقع الخلايا العصبية. (A) بعد الحصول على أول خلية كاملة تسجيل المجهر يتم نقل 10-200 ملم في X- محور بحيث يقع تسجيل المنشأة (السهم) على حافة المنطقة المرئية على الشاشة. شريط النطاق: 25 ميكرومتر (B) لتمكين لغرفة القطب الثاني، ثم يتم رفع عدسة المجهر ~ 5-10 ملم، وضمان أن ACSF لا تزال تحتفظ اتصال معالعدسة. لضمان القطب الثاني لا عثرة تسجيل القطب الآخر، يتم نقل القطب الثاني في محور س حتى يتم مباشرة تحت مسار الضوء من خلال عدسة ولكن لا يزال أعلى بكثير من القطب التسجيل المعمول بها. (C) تأسست تقرن عرض تسجيل كل من الأقطاب الكهربائية (السهام) في نفس المستوى البؤري. شريط النطاق: 25 ميكرومتر (D) المقترنة تسجيل من الخلايا العصبية المجاورة CA3 في الحيوانات المعدلة وراثيا، والتي تبين الخلايا العصبية EGFP إيجابي على RHS. شريط النطاق: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 3. انتقال متشابك واللدونة بين CA3-CA3 أزواج الخلايا الهرمية. (A) مثال صإعادة وآثار بعد المشبكي من تسجيل تقرن بين اثنين CA3 الخلايا العصبية الهرمية. في استجابة لنبض الحالي 20 ثانية للحث على العمل قبل المشبكي اطلاق المحتملين، وبعد المشبكي AMPAR بوساطة الحالية (المسجلة في -65 بالسيارات) يحدث في رد مباشر على إمكانات العمل (B) اليسار: إن اتساع EPSCs AMPAR بوساطة تختلف ليس فقط بين التسجيلات مقترن، ولكن أيضا من المحاكمة إلى المحاكمة خلال تسجيل المقترنة. تمثل كل محاكمة اتساع EPSC قياسها 0.1 هرتز. في هذا المثال، AMPAR EPSC السعة يتقلب من 5 السلطة الفلسطينية> 60 السلطة الفلسطينية. اليمين: سعة NMDAR EPSC قياس في +40 بالسيارات بحضور 10 ميكرومتر CNQX. سعة NMDAR EPSC وعادة ما تكون أصغر بكثير في السعة التي AMPAR EPSCs، ولكن لا تزال تظهر تباين كبير. NMDAR EPSC السعة عادة المتوسطات بين 10-20 السلطة الفلسطينية في التسجيلات تقرن بين الخلايا الهرمية CA3، مما يجعل الفشل التعرف بسهولة (C) اليسار: CA3 الهرمي أزواج خلية التعبير عن LTP الذي لا يزال قائما لطول التسجيل المقترنة. LTP يتضح بسهولة من زيادة في السعة من AMPAR EPSCs. محاكمة لمحاكمة تقلب كبير في السعة AMPAR EPSC يبقى بعد تحريض LTP. الحق: التعبير عن الاكتئاب الطويل الأمد (LTD) بين الخلايا العصبية الهرمية CA3. لاحظ انخفاضا في متوسط اتساع AMPAR EPSC ويصاحب ذلك انخفاض في المحاكمة لتقلب السعة المحاكمة. (D) مثال التيارات المثبطة عديدة التشابكات بعد المشبكي، والتي تحدث في زمن أطول مقارنة أحادي المشبك AMPAR EPSC. عندما الخلايا العصبية بعد المشبكي هي الجهد فرضت في -65 بالسيارات، والتيارات عديدة التشابكات واضحة باعتبارها الذروة الثانية في كمون> 5 ميللي ثانية بعد ذروة إمكانات العمل قبل المشبكي. عقد عصبون بعد المشبكي في -30 بالسيارات يؤكد أن التيار هو متعدد المشابك المثبطة بسبب عكس الاتجاه الحالي.es.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الجدول 1. المشاكل المحتملة التي تنشأ في تسجيلات تقرن وإعداد الثقافات شريحة عضوي النمط. تسرد هذه المشاكل المحتملة الشائعة التي تحدث مع إرفاقها تسجيلات خلية كاملة في الثقافات شريحة عضوي النمط. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا ننصح أيضا ما هو مطلوب وقتا كبيرا للإنفاق بالسيارة "الإعداد الكهربية للتسجيلات المقترنة، كما ترتبط معظم مشاكل لاضطرابات الحركة التي يمكن بسهولة تصور وتصحيحه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وصفناها متطلبات إنشاء ناجحة تسجيلات خلية كاملة مقترنة عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين. ويمكن أيضا أن التسجيلات تقرن أن يؤديها في الاستعدادات متعددة، بما في ذلك شرائح الحادة ونظم الاستزراع فصل 26،27. في حين أن التركيز كان هنا على تحريض أشكال أطول من اللدونة متشابك (أي LTP و LTD)، فمن المهم التأكيد على أن التسجيلات خلية كاملة مقترنة عضوي النمط، شريحة الحادة وفصلها وقد وفرت الاستعدادات خلية نظرة ثاقبة حجم كمي، قصيرة اللدونة الاجل، وظيفة قبل المشبكي، وكذلك LTP و LTD 2،4،8،26،27.
والميزة الرئيسية لنظام شريحة عضوي النمط هو زيادة الاتصال بين الخلايا العصبية. اتصال متشابك في إعداد شريحة الحاد هو انخفاض بسبب فك وصلات محور عصبي أثناء إعداد شريحة. في تجربتنا، وتقرن التسجيلات من synaptically كنكتكانت الخلايا العصبية د CA3 في شرائح حادة محتملة في ~ فقط 5٪ من التسجيلات التي تم الحصول عليها تقرن. هذا هو، وكان 95٪ من التسجيلات تقرن غير مترابطة. بديل هو استخدام فصلها الابتدائي الثقافات الحصين حيث اتصال متشابك أعلى بكثير 26. ومع ذلك، مع الاستعدادات مثقف فصلها تأتي أسئلة بخصوص هوية الخلايا العصبية وما إذا خصائصها مشابهة لتلك من نقاط الاشتباك العصبي ناضجة في أنسجة الأم. استخدام عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين جزئيا إلى التقليل من هذه المخاوف لأن فرعية العصبية يمكن بسهولة عن طريق تحديد، والحفاظ على مورفولوجيا الخلايا والاتصال التي هي مماثلة لأنسجة المخ الأم 20. لكن، وكما تتم المحافظة على شرائح في المختبر لأكثر من أسبوع واحد، فمن المهم أن نلاحظ أن نمو محور عصبي كبير يحدث خلال هذا الوقت. الزيادة الناتجة في الاتصال هو مفيد إلى حد كبير في أداء التسجيلات أن تقرن دراسة وظيفة متشابك واللدونة، ولكن ينبغي لهتجدر الإشارة إلى أن الدراسات فحص الاتصال بالشبكة قد لا تكون مناسبة لهذا الإعداد.
في حين أجريت غالبية دينا تسجيلات تقرن على CA3-CA3 أزواج الخلايا الهرمية، هذه التقنية يمكن تكييفه بسهولة لCA3، CA1 التلفيف المسنن و-CA3 تقرن التسجيلات. حدوث اتصال متشابك بين التلفيف المسنن والخلايا العصبية الهرمية CA3 في هذا النظام هو أقل من ذلك بكثير. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن اتصالات مثير الأحادي المشبك بين CA3 و CA1 في هذا النظام إلى أن تصل إلى 76٪ 28.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم تنفيذ تقرن تسجيلات خلية كاملة بشكل روتيني في الأنسجة الماوس قرن آمون، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا (الشكل 2D) 29-31. هذه التقنية يمكن زيادة تخصيبه لتسجيل انتقال متشابك واللدونة بين الخلايا العصبية مع التعبير الجيني الفسيفساء 30. وضع العلامات GFP البرية من نوع الخلايا العصبية تمكن استهدفت إقران تسجيلات خلية كاملة في الخلايا العصبية سو المعروف الوراثي. وقد حددت هذه التجارب تغييرات في اتصال متشابك بين الخلايا العصبية الفردية، بما في ذلك hyperconnectivity أو غير المتماثلة وظيفة قبل المشبكي 30،31 التي قد تسهم في العجز السلوكية التي لوحظت في هذه الحيوانات.
باختصار، مقترنة تسجيلات خلية كاملة تزيد من القدرة على تفسير الخصائص الكهربية متشابك وتحديد آليات التحت خلوية الخلايا العصبية التي تستخدم لتغيير قوة متشابك. باستخدام هذه التقنية سمحت تنبؤات النماذج قبل وبعد المشبكي من اللدونة متشابك لفحصها مباشرة. بالإضافة إلى ذلك، كما تم وصف النمط الظاهري من نقاط الاشتباك العصبي الصامتة، والأدوار المحددة للمنطقة نشطة والبروتينات مديرية الأمن العام في هذا الإعداد 6-16. فقد مكن أيضا اكتشاف أن وجود نقاط الاشتباك العصبي في دول متميزة محددة electrophysiologically، وأنه خلال نقاط الاشتباك العصبي اللدونة متشابك تتحرك بين هذه الدول 9،17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
