Introduction
글루타메이트 수용체는 중추 신경계의 시냅스에서 흥분성 시냅스 전달의 대부분을 중재. 시냅스 후 막의 척추 헤드에서 번역 이온 성 글루타메이트 수용체의 두 가지 서브 타입은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)과 α-아미노 -3 - 히드 록시-5 proprionic-4-메틸 아이 산 (AMPA) 수용체이다. 막 전위를 휴식에서 AMPA 수용체는 시냅스 전달하는 동안 시냅스 전류의 대부분을 수행한다. 해마에서, NMDA 수용체가 시냅스 막에서 AMPA 수용체의 수의 변화를 유발에 중요한 역할을한다 : "일치 검출기"로 작용함으로써 하나는 시냅스 강도 하나의 변경을 시작하는, NMDA 수용체는 시냅스 메커니즘에 참여 즉 세포 내 수준에서 학습과 기억을 뒷받침하는 것으로 생각된다. 시냅스 송신기 릴리스에 평행 시냅스 신경 세포의 탈분극에 응답하여, 칼슘 NMDA 통해 입사수용체가 AMPA 수용체의 삽입 또는 제거 2를 시작합니다. 이러한 수용체는 시냅스 역학 소성을 이루는 시냅스 강도의 감소가 장기 우울증 4 (LTD) 동안 시냅스 강도의 증가는 장기 증강 2,3 (LTP)이다. NMDA 수용체는 그것의 제어를 유도하는 것으로 생각되는 반면 따라서 AMPA 수용체 이동은 시냅스 가소성 발현 책임 생각된다.
시냅스 전송 및 소성의 기초가되는 정확한 메커니즘을 결정하는 것은 이상적으로 시냅스의 작은 인구, 하나의 시냅스를 공부해야합니다. 일부 시냅스는 매우 인해 시냅스 연결의 작은 확산 특성이 매우 어렵습니다 대부분의 시냅스 집단이 수준, 예를 들어, 다섯 개최의 꽃받침,에서 연구에 적합하는 동안. 두 주요한 기술은 전기 생리학 단일 시냅스 연결을 검사하기 위해 개발되었다 : 제 최소 자극이며, 어디 있나한 시냅스 섬유 추정된다 전자는 세포 외 자극. 두 번째 기술은 시냅스 연결 뉴런에서 두 개의 동시 전체 셀 녹음이 수행 기록을, 짝. 최소한의 자극의 주요 장점은 동시에 시냅스 후 뉴런에서 촬영하면서 축삭 기관으로 세포 외 자극 전극의 배치를 포함하는, 수행하도록 신속하고 비교적 간단하다는 것이다. 이 기술을 이용하여 주요 관심사는 단일 셀의 신뢰성 자극 거의 시험 후 시험을 보장 할 수 있다는 것이다.
지난 15 년 동안 우리는 정기적으로이 시냅스 연결 피라미드 뉴런 6-17에서 전체 셀 녹음을 쌍으로 사용하고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단지 하나의 시냅스 전 뉴런이 일관되고 신뢰성있게 자극한다는 것이다. 또한 전기 생리 학적 특성뿐만 아니라, 시냅스 전 뉴런 6,18 <약리학 조작뿐만 아니라 허용/ SUP>. 그러나, 뉴런 사이의 시냅스 연결의 확률은 19 구에 접속 쌍 어렵게 낮다. 의 Organotypic 뇌 슬라이스 배양의 사용은 시냅스 연결 등이 장애물이 시험 관내에서 다시 설정할 수 있고, 더구나 그 결과 연결이 자연 네이티브 뇌 조직 (20)과 유사하다 우회. 또한,의 Organotypic 문화에 가소성 메커니즘을 가능하게 LTP, LTD 7-10,12-15,21 페어링 된 펄스 촉진 (PPF)과 우울증 (PPD) 6,22,23을 포함한 단기 시냅스 가소성을 추가로 표현 뉴런 쌍으로 연구 될 수있다. 여기에서 우리는 성공적으로 시험 관내 시스템에서 한 쌍의 기록을 달성에 관련된 자세한 방법을 설명합니다. 이 정보는 용이 급성 뇌 조각 및 다른 영역을 포함하는 다른 실험 시스템에 적용 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 윤리 정책 :
이 논문에서 설명하는 프로토콜은 오클랜드와 스탠포드 대학의 대학에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따르십시오. P7 쥐 새끼는 빠른 잘린 안락사되었다. 해마 해부는 즉시 아래에 설명 된대로 수행됩니다.
1의 Organotypic 해마 슬라이스 문화
- 준비
- (뇌를 해부에만 사용) 해부 매체를 준비합니다. , 5 ㎖의 HEPES 완충 용액, 2 ㎖의 1 M 트리스 주식 솔루션 (산도 7.2) (0.85 % NaCl을 각각 10,000 대) 200 ㎖의 최소 필수 중간, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션을 결합하고, 필터는 0.22 μm의 필터 소독 . 얼음처럼 차가운 해부 매체에서 해마 절제술을 수행하십시오.
- 해부 매체를 쿨. 약 1 시간 전에 액체가 매우 추운 때까지 절개를 시작하기에 냉동실에서 해부 미디어를 넣습니다. 큰 얼음 CR을 허용하지 마십시오ystals을 형성한다. 필요한 때까지 얼음에 보관하십시오.
- (해마의 해부를 제외한 모든 사용) 문화 매체를 준비합니다. / L-글루타민, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 와트, 행크의 염 / w 100 ㎖의 최소 필수 중간, (1 배 농도, 액체) 겸용 (0.85 % 액체, 각각 10,000 대, 염화나트륨), 2.5 ml의 HEPES 한 M 버퍼 솔루션, 50 ML 행크의 균형 소금 솔루션, 50 ㎖의 말 세럼 (정의, 열 불 활성화) 및 필터는 0.22 μm의 필터 소독.
- 문화 요리를 준비합니다. 35mm 배양 접시 당 배양액 1 ㎖를 배치하고, 각 요리에 막 삽입을 추가합니다. 한 150mm 페트리 접시에 이러한 요리의 일곱까지 착용 할 것 ( '판'이라고 함). 요리 배양 배지는 적절한 온도와 pH가 달성되도록 절개가 시작되기 전에 적어도 한 시간 동안 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 출생 후 7 일에서 쥐 새끼들까지 잔치에서 해마의 해부 (P7)
- 절차 전에 자외선 아래의 모든 해부 도구를 사전 소독.
- 급속한 잘린 후 접시에 냉장 한 매체 중에 뇌와 장소를 제거하고 해부 용 가습 필터 종이 조각을 제거. 해마를 노출, 무딘 부드러운 플라스틱으로 코팅 된 미니 주걱을 사용하여 멀리 중뇌에서 피질을 애무 해줘. 원개를 절단 한 다음 조심스럽게 (그림 1A)를 밖으로 플립 해마 아래에 주걱을 작동합니다.
노트 : 슬라이스 배양 P10까지 동물을 사용하여 제조 될 수있다. - 멀리 뇌의 나머지 부분에서 분리 된 해마를 낸다. 적신 부드러운 붓을 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 새로운 접시에 해마로 이동 (예를 들어, 흰색 검은 담비 # 4).
- 이러한 스폰지, meninge 형상 조직이 어려운 해마를 분리 할 수 있도록 같이, 박리시 맥락총의 해마의 하부 (즉, 평탄한면) 청소나중에 서로 조각.
참고 : 그들이 부드럽게 떨어져 조롱 할 수없는 경우 대신이 조직을 둡니다. - 해마를 손상시키지 않고 가능한 한 빨리 전체 절개를 수행한다.
참고 :주의 해부 한 실험 조건이 냉각 될 때, 빠른 일보다 더 중요하다. 동시에 세 쥐의 해마를 썬다. 도금 조각이 인큐베이터에 갈 때 슬라이스 건강이에 한 시작부터 총 시간 등의 영향을받지 않습니다 30 분을 받고있다.
- 슬라이스
- 가로 수동 조직 슬라이서를 사용하여 400 μm의 크로스 섹션으로 해마를 썬다. 슬라이싱이 수행 된 방법은 조직에 과도하게 손상되지 않고 (암몬의 혼이 쉽게 조직에 보존 할 볼 수 있습니다 즉) 쉽게 볼 수 층류 아키텍처와 일치하는 두께의 조각을 생산 너무 오래 같이 중요하지 않습니다.
- 조직의 무대에서 해마를 거짓말2 여과지 트리플 두께의 위에 초퍼. 해마는 (오히려이 시점에서 슬라이스 빵 덩어리처럼, 그림 1B 모든 인하되었습니다 때까지 전체 해마가 헬기의 무대에 남아 즉) 개별적으로 모든 조각을 제거하지 않고 완전히 분리된다.
- 각 해마 옆에 누워 부드러운 붓 (2 흰색 검은 담비 #)를 사용하여 해부 매체로 해마를 전송합니다. 부드럽게 해마와 기본 필터 종이 사이의 접착력을 깰 측면에 각 해마를 밀어 넣습니다. 무대에서 내려 데리러 각 해마 아래 브러시를 굴립니다. 냉장 해부 매체의 동일한 35mm 페트리 접시에 모든 해마를 놓습니다. 수동으로 시계 방향과 반 시계 방향으로 운동을 교대로 요리를 교반하여 개별 조각으로 해마를 분리합니다.
- 해부 현미경 슬라이스를 검사하고 명확하게 보이는 셀을 소유하지 않는 작은 손상, 또는 어떤되는 모든 폐기몸 층.
참고 : 종종 모든 조각이 성공적으로이 방법으로 자신의 형제 분리되어 있지 경우가 될 것입니다. 이 경우, 그들은 가장자리에 돌려서 미세 핀셋의 선단 그들을 괴롭히는 의해 분리 될 수있다. "좋은"슬라이스가 다음 차단 및 화재 연마 파스퇴르 피펫 (그림 1C-E)를 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 또 다른 깨끗한 페트리 접시로 전송됩니다.
- 저장
- 멤브레인 필터 인서트에 개별 조각을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 차단 및 화재, 더 큰 구멍을 줄 개별적으로 문화 삽입에 조각을 전송하는 연마.
참고 : 절단 및 화재 연마 피펫이 중요한 때 생성 된 구멍의 크기입니다. 너무 작은 조각은 쉽게 막에 대한 피펫을 떠나지 않을 것입니다. 너무나 큰 과잉 유체는 슬라이스와 함께 공막의 표면 상에 배치된다. 최적 내경은 전형적으로는 약 절반이다 DIAM피펫의 배럴의 eter. 절단 할 때에는,이 직경은 피펫의 테이퍼에 적절한 장소에서 절단함으로써 선택 될 수있다. - 슬라이스 전송
- 첫째 매체와 피펫을 입력 한 다음 작은 흡입 힘을 가진 한 조각을 빨아. 이 피펫의 개통 근처에 슬라이스를 유지하고 슬라이스를 배치 할 삽입에 너무 많은 매체 추방을 방지 할 수 있습니다.
- 작은 매달려 방울을 형성하는 전구에 약간의 힘을 주어 슬라이스가 물방울에 정착 한 다음 막에 그 방울을 터치 멤브레인에 슬라이스 "가을"을 할 수 있습니다. 일반적으로 3 조각은 각각의 막 삽입에 배치됩니다.
NOTE : 유체 액적가 너무 큰 경우, 세 조각에서 물방울 막 표면에 병합하는 경향이 있고, 슬라이스 따라서 모든 더 어렵게 이후 전기 생리 녹화 그들을 분리 할 수있게, 멤브레인의 중앙에 수집된다.
- 유체 Remov알
- 슬라이스에 침지 또는 해부 매체의 수영장으로 둘러싸여되지 않도록, 그 판의 모든 조각 (삽입 당 3 조각 = 플레이트 당 21 조각)의 배양 용기 삽입의 상단에서 초과 매체를 대기음.
- 이 포경 함께 수행하지만, 화재 연마 파스퇴르 피펫. 슬라이스가 정착 피펫 팅 전에 분 동안 막에 부착 할 수 있습니다. 최대 피펫으로 슬라이스를 흡입하지 않도록주의하십시오. 슬라이스가 정착하기에 충분한 시간을 허용하기 위해, 제 도금 인서트 유체 제거를 수행한다.
- 슬라이스 저장
- 37 ° C에서 5.0 % CO 2 인큐베이터에 보관 슬라이스 문화. 그림 1E의 문화의 최종 배열을 관찰한다. 개별 조각은 밑바닥 공막가 배양 용기 삽입시 휴식,이 인서트는 매체의 소량 충전 페트리 접시 안에 맞는; 이것에 의해, 슬라이스 나에 몰입되지 않습니다dium는 있지만 배양 플레이트 인서트의 하단 멤브레인을 통해 액세스 할 수 있습니다.
- 임의로, 배양 접시를 삽입하거나 제거하여 슬라이스를 포함하는 인서트 막의 단면을 잘라내어 수도 연구 중 슬라이스를 제거한다.
- 멤브레인 필터 인서트에 개별 조각을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 차단 및 화재, 더 큰 구멍을 줄 개별적으로 문화 삽입에 조각을 전송하는 연마.
- 유지 보수
- 문화를 한 후 일 배양 접시에서 매체를 교환한다. 전송하기 전에 적어도 한 시간 동안 배양기에서 평형화 신선한 배지 1 ㎖를 함유하는 새로운 배양 접시에 배양 플레이트 인서트를 전송합니다.
- 문화를 한 후 셋째 날에 동일한 방식으로 다시 매체를 변경합니다. 셋째 날, 34 ° C로 설정 인큐베이터에 문화를 전송합니다. 두 번 각 주 (모든 3-4일을) 매체를 변경합니다.
- 건강한 문화를 식별합니다. 한 쌍의 전체 세포 레코딩을위한 건강한 문화를 선택합니다.
참고 : 건강한 문화가 잘 정의 된 가장자리와 명확하게 정의 된 피라미드 세포 층이있다. 문화 재치시간의 어두운 (가능성이 괴사) 지역 현재 또는 병합 된 테두리가있는 액포 외관은 거부됩니다. 이러한 기준 채택, 슬라이스 문화의 일반적으로 3 분의 2는 충분히 기록 건강. - 시간의 매우 작은 창 내에서 이러한 문화를 활용합니다. 신경 세포가 서서히 시간을 악화 약간 간질 동작을 표시하기 시작 이후 2 주 이상 배양 사용되지 조직을 수행합니다. 신경 세포의 생존의 정확한 상한은 알려져 있지 않습니다하지만 문화 피라미드 세포에게 늦게 16 개 주 기능에서 기록 할 수있다.
2 쌍으로 전체 셀 녹음
- ACSF 및 세포 내 솔루션
- 120 글루 콘산 칼륨, 40 HEPES, 5 MgCl2를, 2 NaATP, 0.3 NaGTP (; 290 mOsm 삼투압 KOH으로 pH 7.2) (단위 : mm) 혼합하여 시냅스 전극 솔루션을 준비합니다. 같은 전극 용액이 시냅스 후 뉴런, 세슘 글루코 네이트에 사용되는 동안 (120 mM의) 일반적으로 주요 시냅스 전극에 소금 플러스 5 밀리미터 QX314로 사용됩니다.
참고 :이 시냅스 NMDAR - 중재 전류 8-10,13를 기록하는 양의 전위에서 안정 전압 클램핑을 할 수 있습니다. 또한 기가 옴 밀봉이되기 전에 시냅스 기록 전극에서 흐르는 내부 솔루션에 의해 시냅스 전 신경 세포의 칼륨에 의한 hyperexcitability을 방지 할 수 있습니다. - (mm 단위) 구성 시냅스 전극 액 120 세슘 글루코 네이트, 40 HEPES, 5를 MgCl 2, 5 QX314,이 NaATP하고, (; 290 mOsm 삼투압 CsOH를하여 pH 7.2) 0.3 NaGTP를 준비합니다. 5 ~ 10 MΩ 저항에 유리 미세 전극을 당겨 여과 내부 솔루션을 입력합니다.
- 인공 뇌척수액 (ACSF) 119 염화나트륨, 2.4의 KCl (mm 단위) 구성을 준비 황산 1.3, 2.4 염화칼슘이, 하나 나 2 HPO 4, 26.2 탄산 수소 나트륨, 95 % O 2, 5로 포화 된 11 포도당, 산도 7.4, %의 CO 2. 주 : R을 AMPAR 매개하는 경우esponses는 NMDAR EPSCs의 검사를 위해 차단해야하는 ACSF에 10 μM CNQX 또는 NBQX을 포함한다.
- 120 글루 콘산 칼륨, 40 HEPES, 5 MgCl2를, 2 NaATP, 0.3 NaGTP (; 290 mOsm 삼투압 KOH으로 pH 7.2) (단위 : mm) 혼합하여 시냅스 전극 솔루션을 준비합니다. 같은 전극 용액이 시냅스 후 뉴런, 세슘 글루코 네이트에 사용되는 동안 (120 mM의) 일반적으로 주요 시냅스 전극에 소금 플러스 5 밀리미터 QX314로 사용됩니다.
- 페어 전체 셀 녹음을 구합니다
- 이 개별 뉴런 사이의 시냅스 전달을 조사하기 위해, 시냅스 신경 세포로 하나의 신경 세포를 지정하고 활동 전위를 유도하고 시냅스 전달을 시작하기 위해 현재의 클램프를 누르고 있습니다.
- 시냅스 후 뉴런과 같은 뉴런 제를 지정하고, 연구자에 의해 요구되는 정보에 따라 전류 또는 전압 클램프에 고정. 전압 클램프에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 MV 6-16 30에서 조사 -65 MV에서 조사 AMPAR - 매개 EPSCs과 NMDAR - 중재 EPSCs와 글루타메이트 전류의 자세한 검사를 받기
- 페어링 기록을 설정합니다. 페어링 녹화를 설정하기 위해, 시냅스 전 세포 기록 반드시 여러 순차 시냅스 후 뉴런있게 제 얻어지는 접속 하는 시냅스 하나까지 획득 될D가 얻어진다. 시냅스 가소성 실험을 수행하는 경우, LTP 8,19 필요한 세포질 인자의 유실을 방지하기 전 세포 기록을 얻는 10 분 이내에 시작되어야 시냅스 후 뉴런에서 LTP의 유도로 제 시냅스 전 신경 세포를 얻는 것이 특히 중요하다.
- 운동에 의한 세포의 손실을 피하십시오. 페어링 전 세포 기록을 행하는 주요 과제는 진동과 제 2 기록을 얻는 반면 제 전 세포 기록 움직임 - 유도 방해를 회피한다.
- 제 전 세포 기록을 구하여 설정된 기록이 모니터 (도 2a)에 표시되는 영역의 가장자리에 위치되도록 한 다음 X-축에서 10 내지 200 μm의 현미경 렌즈를 이동.
- ACSF 여전히 렌즈와의 접촉을 유지하는 보장 ~ 5-10밀리미터을 현미경의 렌즈를 올립니다. 제 2 전극을 마운트하고 (유체 메 니스 커스 (meniscus)에 그림 2B 안내
- 이 렌즈를 통해 빛의 경로 바로 아래에 여전히 크게 기존의 기록 전극 위에까지 xy 평면에 전극을 이동합니다. 전극은 현미경으로 볼 일단 팁이 떨어져 제 1 전극으로부터 멀리 모니터의 가장자리에 확인.
- 양 전극이 같은 초점면에 때까지 현미경의 초점을 순서대로 제 2 전극을 아래로 이동합니다. 그것은 제 전 세포 기록을 중단하도록 정압의 레벨이 너무 강해 팁 막힘을 방지하기에 충분히 강하지 만없는 것이 중요하다. 이것은 먼저 슬라이스 들어가면 전극으로부터 2-3에서 운동 신경원을 유도 정압으로 변환.
- 첫번째 시냅스 기록 (그림 2C)와 비슷한 초점면에서 시냅스 파트너를 찾습니다. 녹화는 일반적으로 첫 번째 연구의 0-200mm 신경 세포에서 CA3 피라미드 뉴런 초 전 세포 사이의 녹음을 쌍의 취득ecording (그림 2C, D).
주 : 신경 쌍 사이 시냅스 전달 최대 3-4 시간의 시간 기간에 걸쳐 안정 이러한 표준 전체 셀에 기록하는 기술을 사용하는 경우.
- 시냅스 일단 성공적 시냅스 연결 피라미드 세포 쌍 취득시 (도 3a를, B), 시냅스 전달과 가소성의 특성을 조사한다.
- LTP 유도.
- 1 분 0 MV (그림 3C) 7-9,12-14에 -10 시냅스 탈분극과 시냅스 활동 전위 (1 ~ 200Hz)를 페어링하여 LTP를 유도한다. 브레이크에서 시냅스 후 뉴런의 10 분 이내에 페어링을 시작합니다.
참고 : LTP는 시냅스 활동 전위로, 1 분 동안 1 Hz에서 시냅스와 시냅스 활동 전위를 페어링하여 현재 클램프에서 열린 두 신경 세포로 유도 할 수는 시냅스 전 신경 세포의 팔에 전류를 주입 다음 10 밀리 초를 유도
- 1 분 0 MV (그림 3C) 7-9,12-14에 -10 시냅스 탈분극과 시냅스 활동 전위 (1 ~ 200Hz)를 페어링하여 LTP를 유도한다. 브레이크에서 시냅스 후 뉴런의 10 분 이내에 페어링을 시작합니다.
- 또한 5 ~ 10 분 (그림 3C) 9 -55 MV에 시냅스 후 뉴런의 약간의 탈분극과 함께 1 Hz에서 저주파 자극 (LFS)에 의해 LTD를 유도한다.
- LTP 유도.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
시냅스 연결이 기록 전극을 통해 탈분극 전류 펄스 (20 밀리 초에 대한 일반적으로 20 ~ 50 씩) 전달하여 활동 전위를 발생하는 시냅스 전 신경 세포를 자극하여 분명하다. 시냅스 현재 추적은 시냅스 활동 전위 (그림 3A)의 피크 후 짧은 (<5 밀리 초)과 일치하는 대기 시간에 유발 monosynaptic EPSC의 존재를 검사합니다. 시냅스 연결 쌍 수득되기 전에 대부분의 실험에서 여러 시냅스 후 뉴런 시험된다. 전반적으로, 연접 CA3 세포 ~ 1 / 3의 활성은 시냅스 연결 monosynaptically (도 3a)에 의해 시냅스 CA3 셀에 결합되고, CA3 뉴런의 약 20 %는 모두 유성 6,8 시냅스 연결에 의해 연결된다.
기준선 AMPA 수용체 매개되는 전류의 진폭은 독립적 인 파이 사이도 페어링 내에 기록 재판 재판에서 변수이고,빨간색 레코딩 (그림 3B) 6,8. 평균 AMPAR EPSC 진폭은 800 pA의 <10 pA의>에서 원거리, 그리고 가능성이 짝을 녹음 사이의 기능적인 시냅스의 수의 차이에서 발생한다. 실패 속도는 활성 시냅스 6,7로 연결 쌍에 0-95% 실패율에 침묵 시냅스에서 백퍼센트 AMPAR EPSC 실패율에 이르기까지, 쌍 녹음 6,7 사이에 상당히 다를 것으로 관찰되었다. 개별 쌍 녹음 내에서 시냅스 실패는 특히 작은 AMPAR EPSC 진폭과 녹음에 발생했습니다. 다른 시냅스 6에서 발생하는 AMPAR EPSC 진폭의 변화는, 재판에서 인해 재판에 재판에서 배출 계량 적 수의 변동에 (그림 3B)의 가능성이 원시 데이터에서 재판에 분명하다.
듀얼 전 세포 기록도 약리 manipulat 있도록, 사전 및 시냅스 후 뉴런 세포질에 직접 액세스 할기록 전극 (6)을 통해 하나 / 시냅스 및 시냅스 후 세포 모두의 이온. 일반적으로 시냅스 약리 조작은 (10 분 이내) 매우 빠른입니다. 이 같은 형광 표지 덱스 트란은 기록 전극으로부터 떨어져 ≤200 μM 시냅스 단자에 접근 할 수, 작은 분자 (예를 들어, BAPTA)에 한정되지 않는다. 따라서 오징어 거 시냅스 25에서 수행 된 것과 유사한 분석은 해마 슬라이스 시냅스 소포 방출 기계의 연구로 확장 될 수있다. 페어링 녹음 측정 특정 시냅스의 위치는 기록 과정에서 식별되지 않는다. 따라서 시냅스의 말단 사이트에 비해 근위부는 세포 외 자극 전극 또는 초점 글루타메이트 응용 프로그램과 지역의 자극뿐만 쉽게 평가 할 수 없습니다. 그러나, 쌍을 촬영하는 동안 각 신경 세포의 염료 충전은 축삭 아버 잠재적 인 시냅스 사이트의 형태 학적 재구성을 활성화 할 수 있습니다 LTP와 LTD는 신뢰성이 배양 시스템 (그림 3C)에서 CA3-CA3 시냅스에 유도하고, (시간이 이상) 전체 셀 녹음 기간 동안 소성의 두 형태의 마지막있다. 이용 LTP와 LTD 유도 패러다임 급성 슬라이스와 LTP와 LTD 전시 NMDAR 의존성, 연관성 및 경로의 독립, 문화 시스템의 따라서이 조합의 특성을 수행 것과 동일하다 페어링 된 기록은 시냅스를 검사 할 수있는 가치있는 모델 시스템을 제공 소성 7. Polysynaptic 억제 이벤트가 자주 CA3 피라미드 세포 쌍 (그림 3D) 사이의 쌍 녹화에서 관찰된다. 이것은 매우 파괴적인 과잉 생산으로 우리는 약리학이 GABA 성 억제를 차단하지 않습니다. 그러나, 이들 polysynaptic 억제 이벤트 긴 지연으로 인해, 이들은 일반적으로 monosynaptic excitato의 측정을 방해하지 않는다스피 전류. polysynaptic 억제 이벤트 monosynaptic 전류의 피크를 가리는, monosynaptic 전류를 방해하는 것으로 관찰 된 경우,이 쌍은 분석에서 제외 될 필요가있다. Polysynaptic 흥분성 연결이 때때로 관찰하지만, 훨씬 적은 일반적이고 또한 분석에서 제외된다. 드물게 monosynaptic 억제 시냅스 전류는 시냅스 전 뉴런에 억제 interneuron 것으로 인해 얻을 수 없습니다. 이것은 쉽게 이상 (1 초) 전류 주입에 응답하여 활동 전위 발사의 숙박 시설의 부족에 의해 식별됩니다. 이것은 내부 용액 세슘 글루코 기반하는 시냅스 후 뉴런에서 가능하지 않다. 신경이 기록에 시각적으로 이전 식별 그러나, 우리의 경험에서이 <시간의 1 %를 발생합니다. 의 Organotypic 해마 조각 내에서의 interneurons 쉽게 특히 지층 radiatum 및 oriens에, 자신의 비 피라미드 세포 기관에 의해 시각적으로 식별됩니다. 따라서이 홍보eparation는 interneuron의 흥분성과 억제 전류의 녹음을 할 수 있습니다. 그러나, 매우 조금의 Organotypic 슬라이스의 억제에 대해 알려진 네트워크이며, 그들은 뇌 유사한 연결을 유지할 것인지 명확하지 않다. 
해마의 Organotypic 슬라이스 문화의 그림 1 준비. (A)의 점선으로 윤곽 시츄 해마. 해마를 제거하려면 원개에 연결이 단절되고 해마 부드럽게 뇌 밖으로 굴렀다. (B) 해마가 여과지 위에 슬라이서의 무대에 위치한다. (C) 해마 조각은 넓은를 통해 전송됩니다 손상을 방지하기 위해 파스퇴르 피펫의 구멍. '좋은'대 '나쁜'조각 (D) 예.(E) 만화 막에 조각 설치의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2는 해마 CA3 뉴런에서 전체 셀 녹음을 짝을 얻었다. 최적의 전극과의 연결 위치를 보여주는 한 쌍의 기록을 달성 순차 이미지를. (A) 현미경을 기록하는 최초의 전 세포를 얻은 후 x 축에 10-2백mm를 이동 축이되도록 설정된 기록 (화살표)가 모니터에 표시되는 영역의 가장자리에 위치한다. 스케일 바 :. 25 μm의 (B) 제 2 전극을위한 공간을 사용하려면, 현미경의 렌즈는 ACSF 여전히 접촉을 유지 보장, ~ 5~10mm를 발생렌즈. 이 렌즈를 통해 광 경로 바로 아래이지만 여전히 크게 설정된 기록 전극 위에까지 다른 기록 전극 범프하지 않는 제 2 전극을 보장하기 위해, 제 2 전극은 X 축으로 이동한다. (C) 설립 페어링 기록 보여주는 같은 초점면에서 양 전극 (화살표). 스케일 바 :. 우에서 EGFP-긍정적 인 뉴런을 나타내는 형질 전환 동물에 인접한 CA3 뉴런에서 25 μm의 (D) 한 쌍이 기록. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
CA3-CA3 피라미드 세포 들간의 그림 3 시냅스 전송 및 소성. (A) 페이지의 예이 CA3 피라미드 신경 세포간에 설정된 녹화에서 재 및 시냅스 흔적. 20 초 전류 펄스에 대한 응답으로 시냅스 활동 전위 발사를 유도하기 위해, 시냅스 AMPAR - 중재 전류 (-65 MV에 기록) 활동 전위에 직접 응답으로 발생 (B) 왼쪽 :. AMPAR - 매개 EPSCs의 진폭 변화 뿐만 아니라 쌍 간의 기록뿐만 아니라, 재판에 재판 페어링 기록 내에서. 각 시험은 0.1 Hz에서 측정 EPSC의 진폭을 나타냅니다. 이 예에서 AMPAR EPSC 진폭은> 60 pA의 5 pA의에서 변동. 오른쪽 : NMDAR EPSC 진폭은 10 μM CNQX의 존재에 40 MV에서 측정. NMDAR EPSC 진폭은 일반적으로 AMPAR EPSCs하지만 여전히 상당한 변동성을 보여 것을 진폭이 상당히 작다. CA3 피라미드 세포 사이의 쌍 녹화에서 10 ~ 20 pA의 사이에 일반적으로 평균 NMDAR EPSC 진폭, 오류가 쉽게 식별하고 (C) 왼쪽 :. CA3 피라미드 세포 쌍 한 쌍의 기록 기간 동안 지속 LTP를 표현한다. LTP는 AMPAR EPSCs의 진폭의 증가에 의해 용이하게 명백하다. AMPAR EPSC 진폭 중요한 재판에 재판 변화는 LTP의 유도 후 남아있다. 오른쪽 : CA3 피라미드 신경 세포 사이의 장기적인 우울증 (주)의 발현. AMPAR EPSC의 평균 진폭 및 시험 진폭 변동 재판에 동반 감소의 감소를 유의하십시오. monosynaptic AMPAR EPSC에 비해 더 긴 대기 시간에 발생하는 시냅스 polysynaptic 억제 전류의 (D) 예. 시냅스 후 뉴런 -65 MV에 클램프 전압이되면, 전류는 polysynaptic 시냅스 활동 전위의 피크 이후> 5 밀리의 지연 시간에 2 피크로서 볼 수있다. -30 MV에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 polysynaptic 현재 인해 현재 방향의 반전에 억제하는 것을 확인합니다.es.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
표 짝을 기록하고 Organotypic 슬라이스 문화의 준비에 발생하는 1 잠재적 인 문제. 이 Organotypic 슬라이스 문화의 짝을 전체 셀 녹음으로 발생하는 일반적인 잠재적 인 문제를 나열합니다. 또한, 우리는 또한 대부분의 문제는 쉽게 시각화 및 수리 할 수있는 운동 중단과 관련된으로 상당한 시간이 쌍으로 녹음을위한 전기 생리학 설정을 '운전'소비 될 필요가 있다고 조언한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에서 우리는 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 성공적으로 짝을 전체 셀 녹음을 확립하기위한 요구 사항을 설명했다. 짝 녹음은 급성 슬라이스와 해리 문화 시스템 (26, 27)를 포함하여 여러 준비, 수행 될 수있다. 초점은 여기에서 시냅스 가소성 (즉 LTP와 LTD)의 이상 형태의 유도에 왔지만, 짧게는의 Organotypic, 급성 슬라이스에서 해당 쌍 전 세포 녹음을 강조하는 것이 중요하다 세포 제제는 계량 적 크기로 중요한 통찰력을 제공 한 해리 -TERM 가소성, 연접 기능뿐만 아니라 LTP 2,4,8,26,27 및 LTD.
슬라이스의 Organotypic 시스템의 주요 장점은 뉴런 간의 연결이 증가된다. 급성 슬라이스 준비 시냅스 연결로 인해 슬라이스 준비하는 동안 축삭 연결의 절단으로 낮다. 우리의 경험에 의하면, 시냅스의 접속 하에서 녹음을 쌍급성 조각에서 개발 CA3 뉴런을 얻을 쌍 녹음 만 ~ 5 %에서 가능 하였다. 즉, 쌍으로 녹화의 95 %이었다되지 않은 것이다. 대안은 시냅스 연결이 26 상당히 높은 곳에 차 해마 문화를 해리 사용하는 것입니다. 그러나 해리 배양 준비를 신경 세포의 정체성에 대한 질문을 와서 그 속성이 기본 조직에서 성숙한 시냅스와 유사 여부. 신경 아형에 의해 용이하게 식별 할 수 있으므로의 Organotypic 해마 슬라이스 배양의 사용은 부분적으로는 이러한 문제를 개선한다, 그리고 세포들은 원시 뇌 조직 (20)과 유사한 형태와의 연결을 유지한다. 슬라이스는 하나 이상의 주 동안 시험 관내에서 유지하지만, 그것은 상당한 축삭 성장은이 기간 동안 발생하는 것을 주목하는 것이 중요하다. 연결의 증가는 결과적 그러나 그것은해야 시냅스 기능과 소성을 검사 한 쌍의 녹음을 수행하기에 크게 도움이됩니다네트워크 연결을 조사 연구는 이러한 준비에 적합하지 않을 수 있음을 유의해야.
우리 페어링 레코딩 대부분 CA3-CA3 피라미드 셀 쌍에 실시되었다 동안, 이러한 기술은 용이하게 기록을 페어링 CA1-CA3 및 치아 이랑 (dentate gyrus)-CA3에 적응 될 수있다. 이 시스템에서 치아 이랑 (dentate gyrus)과 CA3 피라미드 신경 세포 사이의 시냅스 연결의 발생률은 상당히 낮다. 그러나,이 시스템의 CA1과 CA3 사이 monosynaptic 흥분성 연결은 76 % (28)만큼 높은 것으로보고되었다.
또한, 한 쌍의 전 세포 기록은 정기적으로 형질 전환 마우스 (그림 2D) 29 ~ 31를 포함하여 마우스 해마 조직에서 수행됩니다. 상기 기술은 모자이크 식 30 유전자와 뉴런 사이의 시냅스 전달과 가소성을 기록 정제 할 수있다. 야생형 뉴런의 GFP 라벨링 O 뉴런에서 전 세포 기록을 가능하게 타겟팅 된 페어F는 유전자형을 알고. 이러한 실험이 동물에서 관찰 된 행동 적자에 기여할 수 하이퍼 연결 또는 비대칭 시냅스 기능 (30, 31)를 포함하여 개별 뉴런 사이의 시냅스 연결에 변화를 확인했다.
요약하자면, 쌍을 이루는 전 세포 기록은 전기 생리 시냅스 특성을 해석하는 뉴런과 시냅스 강도를 변경할 채용 세포 내 메커니즘을 결정하는 능력을 증가시킨다. 이 기술을 사용하면 시냅스 가소성 및 시냅스 전 모델의 예측을 직접 테스트 할 수있다. 또한, 자동 시냅스 및 활성 영역과 PSD 단백질의 특정 역할의 표현형의이 제조 6-16에 기술되어있다. 또한 시냅스 구별 electrophysiologically 정의 상태에 존재하는 검색을 사용하고있다 시냅스의 시냅스가 이러한 상태 9,17 사이를 이동하는 동안 그.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
