在器官型海马脑片搭配全细胞记录

Introduction

谷氨酸受体介导的大部分兴奋性突触传递的中枢神经系统突触。的局部存在于突触后膜的棘头离子型谷氨酸受体2亚型主要是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA），α-氨基-3 - 羟基-5 - 甲基异恶唑-4 - 丙酸（AMPA）受体。在静息膜电位，AMPA受体进行最突触后电流的突触传递过程中。在海马中，NMDA受体在触发变化AMPA受体在突触后膜的数量关键作用：通过作为“符合探测器^”1来启动改变的突触强度^1，NMDA受体参与突触机制这被认为是巩固学习和记忆在亚细胞水平。响应于在与突触前递质释放平行突触后神经元的去极化，钙经由NMDA进入受体启动AMPA受体插入或除去^2。这些受体动力学背后突触可塑性：增加突触强度是长时程增强^{2,3（LTP），}而在突触强度的降低是长期抑郁^{4（LTD）。}因此，AMPA受体的运动被认为是负责突触可塑性的表达，而NMDA受体被认为是控制其诱导。

确定突触传递和可塑性背后的确切机制，需要研究突触小种群，最好的单突触。虽然有些突触非常适合于研究在这个水平上， 如对持有⁵的花萼，对于大多数突触的人口，这是非常困难的，因为突触连接的小型和分散性。两个主要的电生理技术，已经开发了检查单突触连接：首先是最小的刺激，wherê1突触前纤维推测刺激细胞外。第二种技术是成对的记录，其中，来自突触连接的神经元的两个同时全细胞记录的处理。最小的刺激的一个主要优点是，它是快速和相对简单的执行，涉及到细胞外的刺激电极放置到轴突道同时从突触后神经元的记录。使用这种技术时，主要关注的是一个单细胞的可靠的刺激很少能保证审讯后审。

在过去的十五年中，我们经常使用的两个突触连接的锥体神经元^6-17配对的全细胞记录。该技术的主要优点是，只有一个突触前神经元持续和可靠地刺激。它还允许不仅电特性，而且药理操纵突触前神经元^{6,18 <}中/ SUP>。然而，突触连接的神经元之间的概率是低的，使得连接对难以得到^19。使用器官型脑切片培养物绕过这个障碍如突触连接可以重新建立体外而且所得到的连接的性质是在天然脑组织²⁰的类似。此外，器官型培养物表达的LTP，LTD ^{7-10,12-15,21}和短期突触可塑性的另外的形式，包括双脉冲便利（PPF）和抑郁症^{（PPD）6,22,23，}使可塑性的机制来要研究对神经元。在这里，我们描述了参与成功地实现这个体外系统配对录音的详细方法。这个信息可以很容易地适用于其它的实验系统，包括急性切片和其他脑区域。

Protocol

动物伦理声明：

在这个手稿中描述的协议，遵循由奥克兰大学和斯坦福大学的大学建立了动物护理指引。 P7的幼鼠被迅速砍头处死。海马解剖，然后立即进行，如下所述。

1，海马器官切片文化

1. 准备
   1. 准备夹层中（仅用于解剖的大脑）。结合（在0.85％的NaCl 10,000单位的每一个，），将5ml的HEPES缓冲溶液，加入2ml的1M Tris溶液（pH 7.2）中200毫升最小必需培养基，加入2ml青霉素 - 链霉素溶液，并过滤消毒用0.22微米的过滤器。开展在冰冷的夹层中海马解剖。
   2. 冷却夹层介质。放置在冷冻机的清扫介质开始的夹层，直到液体是非常冷之前约1小时。不要让大冰CRystals形成。冰储存备用。
   3. 准备培养基（用于一切，除了海马解剖）。结合百毫升最小必需培养基（1X浓度，液）重量/ Hank氏盐，W / L-谷氨酰胺，2个ml的青霉素 - 链霉素溶液（液，10,000单位的每一个，在0.85％NaCl）中，2.5毫升HEPES 1M的缓冲溶液中加入50ml Hank氏平衡盐溶液，将50ml马血清（定义，热灭活的），并过滤除菌用0.22微米的过滤器。
   4. 准备培养皿。将1毫升每35毫米培养皿中的培养基，并添加一个膜插入到每道菜。把多达七个的这些菜入1个150毫米的培养皿（以下称为一个“板”）。将板在CO ₂培养箱中培养至少一个小时前开始清扫，这样的菜培养基达到适当的温度和pH值。
2. 海马从幼鼠在出生后第7天的夹层（P7）
   1. 预消毒紫外光下的所有清扫工具，在手术前。
   2. 快速断头后，取出大脑并放入冷冻介质在一个盘中，然后将其转移到一片湿润滤纸的清扫。用钝光滑的塑料涂层的微型小铲，露出挑逗海马皮层远离脑。切开穹窿，然后轻轻地锅铲海马下方翻转出来（ 图1A）。
      注：成功的切片培养可以使用动物多达10页准备。
   3. 修剪所述分离海马远离大脑的其余部分。转移到海马用湿润的软画笔含冷冻切除媒体一道新菜（ 如白色貂皮＃4）。
   4. 清洁脉络丛的解剖中，海马的下侧（ 即平坦的侧面），因为这些海绵，meninge状组织，使其难以分离海马彼此稍后切片。
      注：留在原地这些组织，如果他们不能轻轻逗了。
   5. 尽可能快地执行整个剥离而不损伤海马。
      注：小心剥离比快多了一个重要的，只要实验条件冷藏。切三只同时海马。切片健康不受影响，只要从开始的总时间，当镀片进入培养箱是下30分钟。
3. 切片
   1. 切片海马横向成使用手动组织切片机400微米的横截面。通过该切片中进行的方法并不重要，只要它是不是太有害的组织，并产生一致的厚度与容易看到层状结构的切片（ 即阿蒙的角是很容易看到，在组织被保留）。
   2. 躺下的海马组织上的阶段菜刀在＃2滤纸厚度三重顶。海马是完全切片而不个别地除去任何切片（ 即整个海马留在斩波器的阶段，直到所有的削减已经作出，而是像在这一点上切面包; 图1B）。
   3. 使用软画笔奠定相邻的海马（白色貂皮＃2）转移到海马夹层介质。轻轻地推每个海马到侧打破海马和底层的滤纸之间的粘附力。每卷海马下方刷把它捡起来扫尾阶段。将所有海马进入冷冻夹层介质相同35mm平皿。通过手动搅拌该盘以交替的顺时针方向和逆时针方向运动分离海马组织成单个的片。
   4. 检查切片解剖显微镜下，并丢弃任何的损坏，小，或不具备清晰可见单元格体层。
      注意：它常常是，并不是所有的条带被成功地从他们的兄弟姐妹以这种方式分离的情况。在这种情况下，它们可以通过把它们的边缘，并与细钳提示催促他们分开。 “好”的片，然后转移到含有冷冻夹层介质使用切断和火抛光的巴斯德吸液管（ 图1C-E）的另一个干净的培养皿。
4. 存储
   1. 将各个片上的膜过滤器插入。使用巴斯德吸管切断和火抛光，以得到一个较大的孔，单独的切片转移到培养插入。
      注：切割和火抛光的吸管是重要的，当创建的孔的大小。过小，因而切片不会轻易离开吸管的膜。过大，过量的液体被放置在膜的表面上沿着与片。最好孔直径通常大约一半的直径ETER移液器的枪管。当切割，该直径可以通过在移液管的锥形切割在适当的地方来选择。
   2. 切片转移
      1. 第一填充介质中的吸管，然后吸了吸小力单片。这样可以使切片的移液管的开口部附近，可以防止过多介质排出到插入放置的片。
      2. 适用于灯泡有轻微的压力，形成一个小吊滴，让片安定成液滴，然后轻触液滴膜，让片“落”到膜上。一般三片被放置到每个膜插入。
         注：如果在流体液滴过大，从三个切片的液滴趋向于对膜表面进行合并，并在片将因此所有收集到的膜的中央，使得它更难以给他们后来分离为电生理记录。
   3. 流体祛瘀人
      1. 吸出多余的培养基从培养板插入在该盘的所有的切片（每个刀片3片=每板21片）的顶部，以使片不浸入或通过夹层介质池所包围。
      2. 执行此是用未切割的，但火抛光的巴斯德吸液管。允许切片定居，并坚持以膜吸取前一分钟。小心不要吸片成吸管。进行流体去除该先镀的插入，以允许足够的时间片来解决。
   4. 切片存储
      1. 商店切片文化在5.0％CO ₂的培养箱中37℃。观察图1E文化的最终安排。各个切片搁置在培养板上的插入物具有一底部的多孔膜，并在培养皿填充有少量培养基内该插入配合;通过这种方式，该带被不沉浸在我dium，但仅通过该膜在培养板上的插入件的底部可以访问它。
      2. 可选地，通过去除培养板的插入或通过切割含有一个切片插入膜的部分取出切片可用于研究两种。
5. 保养
   1. 当天使文化后交换介质的培养皿。将培养板插入转移到含有1ml新鲜培养基是平衡的培养箱中至少在传输之前一小时的新培养皿。
   2. 使培养后的第三天再以相同的方式改变它的介质。到了第三天，文化转移到孵化器设定在34℃。每星期（每3-4天）改变介质的两倍。
   3. 识别健康的文化。选择健康的培养成对全细胞记录。
      注：健康文化有一个明确的优势和明确的锥体细胞层。文化智慧小时黑暗（可能坏死）区域存在或空泡外观扁平的边框将被拒绝。采用这些标准，通常有三分之二切片文化有足够的健康记录。
   4. 在规定时间内相当小窗口，利用这些文化。不要用过的纸巾是在两个多星期以来培养的神经元开始显示稍癫痫行为，慢慢地随着时间的推移恶化。没有已知的神经元存活的确切上限，但也可以从在培养正常锥体细胞迟16周记录。

2，配对全细胞记录

1. 学联和细胞内的解决方案
   1. 通过混合（以mM计）120葡糖酸钾，40 HEPES，5的MgCl _2，2 NaATP和0.3 NaGTP（;：290毫渗透摩尔渗透压pH为7.2，用KOH）制备突触前电极溶液。而同一电极的溶液用于突触后神经元，铯葡糖（120毫）通常被用作在突触后电极的主要的盐，加5毫QX314。
      注意：这使稳定的电压钳位在正电位记录突触后NMDA受体介导的电流^8-10,13。这也防止了突触前神经元的钾引起过度兴奋由突触后记录电极流过千兆欧密封是由之前的内部解决方案。
   2. 制备突触后电极溶液组成（以mM计）120葡糖酸铯，40 HEPES，5的MgCl _2，5 QX314，2 NaATP和0.3 NaGTP（pH值7.2用CsOH;渗透压：290毫渗透摩尔浓度）。拉玻璃微电极在5-10MΩ电阻和充满过滤后的内部解决方案。
   3. 制备人工脑脊液（ACSF）组成（以mM计）119氯化钠，氯化钾2.4，1.3 MgSO ₄干燥，2.4的CaCl _2，1的Na ₂ HPO _4，26.2的NaHCO _3，11葡萄糖，pH为7.4，用95％O _2，5饱和％的CO _2。注：如果AMPAR介导Řesponses需要被封锁检查NMDA受体EPSCS的，包括10微米CNQX或NBQX的学联。
2. 获得配对全细胞记录
   1. 为了检验两个独立的神经元之间的突触传递，指定一个神经元的突触前神经元，并持有电流钳诱发动作电位，并启动突触传递。
   2. 指定所述第二神经元，作为突触后神经元，并根据由所述研究者所需要的信息保持它在电流或电压钳。通过保持突触后神经元的电压钳位得到谷氨酸电流检测用在-65毫伏AMPAR介导EPSCS和NMDA受体介导的EPSCS在30 mV的检测^6-16详细检查
   3. 建立配对记录。要建立配对记录，突触前的全细胞记录总是第一个得到允许多个连续的突触后神经元，直到一个是突触connecte获得获得Ð。如果执行的突触可塑性的实验中，它是特别重要的，以先获得突触前神经元的诱导LTP的突触后神经元内必须获得全细胞记录，以防止所需的LTP ^8,19胞质因子的洗脱10分钟开始。
   4. 避免运动引起的细胞损失。执行成对全细胞记录时的一个主要挑战是避免振动和第一全细胞记录，而获得所述第二记录的运动引起的破坏。
      1. 获得第一全细胞记录，然后将显微镜透镜为10〜200μm，在x轴上，以使建立的记录位于该区域上的监视器（ 图2A）可见的边缘。
      2. 提高显微镜的镜头〜5-10毫米，同时确保学联仍然保持与镜片接触。安装在第二电极和引导到流体弯月面（ 图2B
      3. 移动电极的xy平面内，直到它是直接的光路下通过透镜，但仍显著大于建立的记录电极。一旦电极在显微镜下可见，确保尖端处于显示器远离所述第一电极的远边缘。
      4. 移动所述第二电极向下依次与显微镜聚焦到两个电极都在同一焦平面上。重要的是正压的水平是足够强，以避免尖堵塞，但不能太强烈以破坏所述第一全细胞记录。这转化为正压力诱导的运动在从电极2-3的神经元时，它首先进入切片。
      5. 定位在一个类似的焦平面突触后伙伴到第一突触前记录（ 图2C）。记录一般是获得来自第一R的0-200毫米的神经元配对CA3锥体神经元，第二全细胞记录之间ecording（ 图2C，D）。
         注：神经元对之间的突触传递是稳定在长达3-4个小时的时间内使用这些标准的全细胞记录技术时。
3. 突触可塑性：黄飞鸿获得成功的突触连接的锥体细胞对（ 图3A，B），研究突触传递和可塑性的特点。
   1. LTP的诱导。
      1. 诱导LTP通过配对突触前动作电位（1赫兹）与突触后去极化到-10到0毫伏，持续1分钟（ 图^{3C）7-9,12-14。}在磨合到突触后神经元的10分钟开始配对。
         注：LTP也可诱发与配对的突触前和突触后动作电位在1赫兹为1分钟，用突触后动作电位在电流钳保持两个神经元引起10毫秒以下注入的电流进入突触前神经元⁸
   2. 在1赫兹结合突触后神经元的轻微的去极化至-55毫伏5-10分钟（ 图^3C）9进一步诱导LTD由低频率刺激（LFS）。

Representative Results

突触连接是通过刺激突触前神经元被通过记录电极传递去极化电流脉冲（通常是20〜50 pA的20毫秒），以触发一个动作电位明显。突触后电流迹线，然后检查了突触EPSC的存在突触前动作电位（ 图3A）的峰值后诱发的短（<5毫秒）和一致的延迟。在大多数实验中多个突触后神经元进行测试可以得到突触连接的一对前。总体而言，突触前CA3细胞〜1/3的monosynaptically耦合到突触后CA3细胞通过激活突触连接（ 图3A），和CA3神经元的大约20％是由全无声突触连接^6,8相连。

基准AMPA受体介导的电流的幅值可变，从审判审判配对记录中，也独立派之间红色记录（ 图^3B）6,8。从平均AMPAR EPSC幅值范围<10 Pa至> 800 pA的，而且很可能源自于配对之间的录音功能的突触数量的差异。故障率也已经观察到配对录音^6,7之间显著有所不同，从100％AMPAR EPSC的失败率在沉默突触，以0-95％的失败率，通过积极的突触连接^6,7双。在个别配对录音，突触发生故障，尤其是在录音较小AMPAR EPSC幅度。在AMPAR EPSC幅值的变化是显而易见的，从审判审判中的原始数据（ 图3B），可能是因为从公布的审判审判量子数的波动，如发生在其他突触^6。

双通道全细胞记录也可以直接进入这两个前和突触后神经元的胞浆内，使药物manipulat离子或者/通过记录电极⁶突触前和突触后细胞的都有。通常，突触前药理操作是非常快速（10分钟内）。这不限于小分子（ 如 BAPTA），如荧光标记的葡聚糖可以从记录电极进入突触前末梢≤200微米远。因此，分析类似于在鱿鱼巨突触²⁵执行可以被扩展到突触小泡释放机械的海马切片的研究。在配对记录所测量的特定突触的位置都没有发现在记录过程。因此，近端与突触末梢部位不能那样容易评定为局部刺激与细胞外刺激电极或局灶性谷氨酸的应用。然而，配对录制过程中每个神经元的染料填充可以使轴突乔木和潜在的突触部位的形态重构

LTP和LTD可靠地诱导在CA3-CA3突触在此培养系统（ 图3C），并且这两种形式的可塑性最后为全细胞记录的持续时间（超过2小时）。使用的LTP和LTD诱导范式是相同的急性切片和LTP和LTD展品NMDA受体依赖，关联和通路的独立性，并培养体系，因此该组合的特性进行和配对记录提供了一个有价值的模型系统研究突触可塑性^7。

多突触抑制的事件经常观察CA3锥体细胞对（ 图3D）之间成对的记录。我们不药理学阻止此GABA能抑制，因为这会产生非常破坏性的过度活跃。然而，由于这些多突触抑制事件的较长的延迟，它们通常不能防止突触excitato的测量RY电流。如果多突触抑制的事件，观察到干扰的单突触电流，模糊了突触电流的峰值，这对需要被排除在分析之外。多突触兴奋性连接，有时也观察到，但是显著不太常见的和也被排除在分析。很少，由于突触前神经元被抑制interneuron获得单突触抑制性突触电流。这是很容易识别的缺乏的动作电位响应于较长（1秒）的电流注入的住宿。这是不可能的，其中内部溶液铯葡糖基突触后神经元。然而，由于神经元在视觉上记录之前确定的，在我们的经验发生这种情况<时1％。器官型海马切片内的interneurons很容易在视觉上确定了它们的非锥体细胞体，尤其是在辐射层和oriens。因此，这种公关eparation还使interneuron兴奋性和抑制电流的录音。然而，很少有人知道在器官切片抑制网络，以及他们是否保持连接在大脑相似，目前尚不清楚。

图1：准备海马脑片培养的。 （A）中的海马区， 原位 ，由虚线所概述。以除去海马，连接到穹窿被切断和海马轻轻地铺开脑（B）海马被定位在上的过滤纸顶部的限幅器的阶段（C）大鼠海马切片被经由广泛转移孔巴斯德吸管，以防损坏。的“好”与“坏”片（D）的例子。上隔膜片设置（E）的卡通。 请点击这里查看该图的放大版本。

图2获得配对的全细胞记录从海马CA3神经元。获得配对的记录，显示出最佳的电极和神经元定位的顺序图像：（A）获得第一全细胞记录的显微镜后移动10-200毫米在x轴，因此，所建立的记录（箭头）位于所述显示器上的可视区域的边缘。比例尺：25μm的（B）为使室的第二电极，所述显微镜头被再提出〜5-10毫米，确保ACSF仍保持接触镜头。以确保所述第二电极没有磕碰其它记录电极，所述第二电极被移动在x轴，直到它是直接的光路下通过透镜，但仍显著大于建立的记录电极（C）成立配对记录放映两个电极（箭头）在同一焦平面上。比例尺：25微米（四）配对相邻CA3区神经元的转基因动物，表现出对等式右边的绿色荧光蛋白阳性神经元记录。比例尺：20微米，请点击这里查看该图的放大版本。

CA3-CA3锥体细胞对之间如图3突触传递和可塑性。 （a）芘的例子从两个CA3锥体神经元之间的配对记录重新和突触后的痕迹。响应于20秒的电流脉冲来诱导突触前动作电位的突触后AMPAR介导的电流（记录在-65毫伏）发生在直接响应于动作电位（B）左：该AMPAR介导EPSCS的振幅变化不仅配对的录音间，而且从审判到试验配对的记录内。每个试验表示在0.1赫兹测得的EPSC的振幅。在这个例子中，AMPAR EPSC幅值从5 pA的波动到> 60 pA的。右：NMDA受体EPSC幅度在40毫伏在10微米CNQX存在测量。 NMDA受体EPSC幅度通常在幅度显著较小的AMPAR EPSCS，但仍显示显著变化。 NMDA受体EPSC幅度在CA3区锥体细胞之间的配对记录10-20 pA的典型之间的平均值，使得故障容易识别的（C）左：CA3区锥体细胞对表示LTP仍然存在对于配对记录的长度。 LTP是容易明显的增加AMPAR EPSCS的振幅。显著试验对试验变异性在AMPAR EPSC振幅保持LTP的诱导后。右：CA3区锥体神经元之间的长期抑制（LTD）的表达。请注意，在AMPAR教宣小组的平均振幅和审判审判幅度变化同时减少的减少。突触后多突触抑制的电流，相较于单突触AMPAR EPSC这发生在一个较长的潜伏期（d）实例。当突触后神经元的电压钳制在-65 mV时，多突触电流为第二峰值可见> 5毫秒的突触前动作电位的峰值后的等待时间。保持在-30毫伏突触后神经元的确认，多突触电流抑制由于电流方向的逆转。es.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

表中成对的录音和筹备器官切片文化而产生的一潜在的问题 。这列出了与配对的全细胞记录的器官切片文化所发生的常见潜在的问题。此外，我们也建议所需显著时间花在'驾驶'的电设置成对录音，因为大多数问题都涉及到，可以很容易地可视化和纠正动作中断。

Discussion

在这里，我们描述了在海马脑片培养建立成功配对的全细胞记录的要求。成对的记录，也可以在多个制剂中，包括急性切片和分离培养系统^26,27进行。虽然这里的重点一直是在较长形式的突触可塑性（即LTP和LTD）的诱导，它强调的是配对的全细胞记录的器官，急性切片是重要的，分离细胞的准备工作提供了重要的见解量子大小，短-term可塑性，突触功能，以及LTP和LTD ^{2,4,8,26,27。}

的器官切片系统的主要优点是神经元之间的增加的连通性。在急性切片准备突触连接是低因轴突连接片制备过程中的切断。根据我们的经验，配对录音从突触connecte急性切片ðCA3区神经元可能只有约5％得到配对的录音。也就是说，95％的配对录音的人无关。另一种方法是使用初级分离海马文化中突触连接是显著高于^26。然而，随着离解培养的制剂来对神经元的身份问题，并在它们的属性是否类似于在天然组织成熟的突触。使用器官型海马切片培养物的部分可改善这些问题，因为神经元亚型可以容易地通过识别，并将细胞保持形态和连接是类似于天然脑组织^20。然而，如切片在体外保持了超过一个星期值得注意的是，显著轴突生长在此期间发生是很重要的。由此带来的连通性是进行配对录音的研究突触功能和可塑性很大好处，但是它应该另外，研究探讨网络连接可能并不适合于这种制剂。

虽然我们大部分的配对录音已在CA3-CA3锥体细胞对进行的，这种技术可以很容易地适应CA3-CA1区和齿状回，CA3配对记录。在这个系统齿状回和CA3区锥体神经元之间的突触连接的发病率是相当低的。然而，在该系统CA3和CA1之间突触兴奋性的连接已经被报道高达76％的^28。

此外，成对的全细胞记录例行小鼠海马组织进行，包括转基因小鼠（ 图^{2D）29-31。}该技术还可以进一步细化，记录神经元之间的突触传递和可塑性与马赛克的基因表达^30。野生型神经元的绿色荧光蛋白标记使得能够在神经元中有针对性的配对全细胞记录Ø˚F称为基因型。这些实验确定了在单个神经元，包括超连接的或不对称的突触功能^30,31，可能有助于在这些动物中观察到的行为缺陷之间的突触连接的改变。

总之，成对全细胞记录增加来解释电突触性质，并确定该神经元的使用，以改变突触强度的亚细胞机制的能力。使用这种技术已经允许的突触可塑性的前和突触后的模型的预测可以直接测试。另外，沉默突触，而有源区和PSD蛋白的特定角色的表型也已在此准备^6-16描述。这也使在不同的电生理定义的状态存在突触的发现，并在突触可塑性的突触这些国家^9,17之间移动。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood