Introduction
Os receptores de glutamato mediar a maior parte da transmissão sináptica excitatória nas sinapses no sistema nervoso central. Os dois subtipos principais de receptores de glutamato ionotrópicos localizadas na cabeça da coluna de a membrana pós-sináptica, são N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-proprionic ácido (AMPA). No potenciais de membrana em repouso, os receptores de AMPA carregam a maior parte da corrente pós-sináptica durante a transmissão sináptica. No hipocampo, o receptor de NMDA desempenha um papel importante no desencadeamento de alteração no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica: actuando como um "detector de coincidência de" 1 para iniciar mudanças na força sináptica 1, o receptor de NMDA, participa nos mecanismos sinápticos que são pensados para apoiar a aprendizagem ea memória em um nível subcelular. Em resposta à despolarização do neurónio pós-sináptico em paralelo com a libertação do transmissor pré-sináptico, cálcio entra através do NMDAreceptor de dar início a inserção ou a remoção do receptor de AMPA 2. Esta dinâmica do receptor subjacentes plasticidade sinapse: um aumento na força sináptica é potenciação de longa duração 2,3 (LTP), enquanto que uma diminuição na força sináptica é a depressão a longo prazo de 4 (LTD). Portanto, o movimento do receptor de AMPA é pensado para ser responsável pela expressão da plasticidade sináptica, enquanto os receptores NMDA são pensados para controlar a sua indução.
Determinar os mecanismos precisos subjacentes transmissão sináptica e plasticidade requer estudando pequenas populações de sinapses, idealmente sinapses individuais. Enquanto algumas sinapses são altamente adequados para o estudo, a este nível, por exemplo, a Calyx de Held 5, para as populações mais sinápticas isso é extremamente difícil devido à natureza pequena e difusa das conexões sinápticas. Duas importantes técnicas de eletrofisiologia foram desenvolvidos para examinar as conexões sinápticas individuais: A primeira é a estimulação mínima, where uma fibra pré-sináptica é presumido estimulada extracelularmente. A segunda técnica é emparelhado gravações, onde duas gravações simultâneas de células inteiras de neurônios conectados synaptically é realizada. Uma grande vantagem da estimulação mínima é de que é relativamente rápido e simples de realizar, que envolve a colocação de um eléctrodo de estimulação extracelular no tracto axonal e ao mesmo tempo de gravação de um neurónio pós-sináptico. A principal preocupação quando se utiliza esta técnica é que a estimulação confiável de uma única célula raramente pode ser garantida julgamento após julgamento.
Nos últimos 15 anos temos utilizado rotineiramente emparelhado gravações de células inteiras a partir de dois neurônios piramidais synaptically conectados 6-17. A principal vantagem desta técnica é que apenas um neurónio pré-sináptico, é estimulado de forma consistente e fiável. Ele também permite que não só caracterização eletrofisiológica, mas também a manipulação farmacológica do neurônio pré-sináptico 6,18 </ Sup>. No entanto, a probabilidade de conectividade sináptica entre neurónios é baixa, tornando-os pares conectados difícil obter 19. O uso de culturas organotípicas de cérebro contorna este obstáculo como conectividade sináptica pode restabelecer in vitro e além disso, a natureza da ligação resultante é semelhante ao que no tecido cerebral 20 nativa. Além disso, as culturas organotypic expressar LTP, LTD 7-10,12-15,21 e outras formas de plasticidade sináptica de curto prazo, incluindo a facilitação emparelhado-pulso (PPF) e depressão (PPD) 6,22,23, permitindo que os mecanismos de plasticidade para ser estudada em pares de neurônios. Aqui nós descrevemos a metodologia detalhada envolvido em alcançar sucesso gravações emparelhados neste sistema in vitro. Esta informação pode ser facilmente adaptado a outros sistemas experimentais, incluindo fatias agudas e de outras regiões do cérebro.
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Protocol
Declaração de Ética Animal:
Os protocolos descritos neste manuscrito seguir as orientações de cuidados de animais estabelecidos pela The University of Auckland e da Universidade de Stanford. P7 crias de ratos foram sacrificados por decapitação rápida. Dissecação do hipocampo é então realizada tal como descrito imediatamente abaixo.
1. Organotípicas Hippocampal Fatia Cultura
- Preparação
- Prepare Médio dissecção (usado somente para dissecar o cérebro). Combinar 200 mL de Meio Essencial Mínimo, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 5 ml de solução tampão de HEPES, 2 ml de solução de 1 M de Tris (pH 7,2), e filtra-se esterilizar com filtro de 0,22 nm . Realizar dissecção do hipocampo em meio dissecção gelada.
- Arrefecer o meio de dissecção. Coloque a mídia dissecção no congelador cerca de 1 hora antes do início da dissecção até que o líquido é muito frio. Não permita que grande cr geloystals a se formar. Guarde em gelo até serem necessárias.
- Prepare meio de cultura (usado para tudo, exceto dissecação de hipocampo). Combinar 100 mL de Meio Essencial Mínimo (concentração 1x, líquido) w / sais de Hank, w / L-glutamina, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 2,5 mL de HEPES 1 M de tampão solução, 50 ml de solução salina equilibrada de Hank, 50 ml de soro de cavalo (definido, inactivado pelo calor), e filtro de esterilização com filtro de 0,22 um.
- Prepare as placas de cultura. Colocar 1 ml de meio de cultura por prato de cultura de 35 mm, e adicionar um inserto de membrana para cada prato. Coloque até sete desses pratos em um 150 milímetros placa de Petri (adiante designado por um "prato"). Colocar a placa num incubador de CO2 durante pelo menos uma hora antes de começar a dissecção de modo a que o meio de cultura nas placas alcança a temperatura apropriada e pH.
- Dissecção do hipocampo de filhotes de ratos no dia pós-natal 7 (P7)
- Pré-esterilizar todas as ferramentas de dissecção com luz UV antes do procedimento.
- Após a decapitação rápida, retire o cérebro e lugar em meio refrigerado em um prato, em seguida, removê-lo para um pedaço de papel de filtro umedecido para dissecação. Provoque o córtex longe do mesencéfalo usando contundentes espátulas plásticas lisas revestidas de miniatura, expondo o hipocampo. Corte o fundo de saco, e depois trabalhar suavemente a espátula por baixo do hipocampo para lançá-lo para fora (Figura 1A).
NOTA: Sucesso culturas fatia pode ser preparado usando animais até P10. - Aparar o hipocampo isolado do resto do cérebro. Transfira o hipocampo em um novo prato contendo mídia dissecção refrigerados usando um pincel macio umedecido (por exemplo, branco sable # 4).
- Limpar o lado de baixo (isto é, o lado mais liso) do hipocampo do plexo coróide durante a dissecção, uma vez que estes tecidos, meninge tipo esponjoso tornam difícil separar do hipocampoFatias de um outro mais tarde.
NOTA: Deixe esses tecidos no lugar, se eles não podem ser esmiuçadas fora suavemente. - Executa todo o esvaziamento tão rapidamente quanto possível, sem danificar o hipocampo.
NOTA: A dissecção cuidadosa é mais importante do que um rápido, desde que as condições experimentais são refrigerados. Corte o hipocampo de ratos três simultaneamente. A fatia de saúde não é afectada, enquanto que o tempo total desde o início quando as fatias plaqueadas entrar na incubadora é menos de 30 min.
- Cortando
- Corte os hipocampos transversalmente em 400 um secções transversais usando um cortador de tecido manual. O método através do qual a operação de corte é realizada não é importante, contanto que não é excessivamente prejudicial para o tecido e produz fatias de espessura consistente com uma arquitectura laminar prontamente disponíveis (isto é, corno de Ammon é facilmente visto ser preservada no tecido).
- Deite o hipocampo no palco do tecidotriturador no topo de uma espessura tripla de papel de filtro # 2. O hipocampo é cortado totalmente sem remover quaisquer fatias individualmente (ou seja, todo o hipocampo é deixado na cena do helicóptero até que todos foram feitos cortes, mas sim como pães cortados neste momento; Figura 1B).
- Transferir o hipocampo em meio de dissecção usando um pincel macio colocado ao lado de cada hipocampo (branco de marta # 2). Com cuidado, empurre cada hipocampo para o lado para quebrar a aderência entre o hipocampo eo papel de filtro subjacente. Role a escova debaixo de cada hipocampo para buscá-lo para fora do palco. Coloque todos os hipocampos no mesmo 35 milímetros placa de Petri de meio de dissecção gelada. Separe o hipocampo em fatias individuais agitando manualmente o prato em alternar movimentos no sentido horário e anti-horário.
- Inspecionar as fatias sob um microscópio de dissecação e descartar qualquer que estiverem danificados, pequeno, ou que não possuem células claramente visívelcamadas do corpo.
NOTA: É, muitas vezes, ser o caso de que nem todas as fatias são separados com sucesso a partir de seus irmãos desta maneira. Neste caso, eles podem ser separados por transformá-los na borda e estimulando-as com as pontas dos pinça fina. "Good" fatias são então transferidos para uma outra placa de Petri contendo meio de dissecção limpo gelada usando um cortadas e polidas ao fogo pipeta de Pasteur (Figuras 1C-E).
- Armazenamento
- Coloque as fatias individuais para as inserções de filtro de membrana. Com uma pipeta Pasteur cortado e polido fogo para dar um furo maior, transferir individualmente fatias para as inserções de cultura.
NOTA: O tamanho do orifício criado no corte e polimento da pipeta-fogo é importante. Muito pequena e as fatias não será fácil deixar a pipeta para a membrana. Fluido muito grande e em excesso é colocada sobre a superfície da membrana juntamente com a fatia. O melhor diâmetro do furo é tipicamente cerca de metade do diâmetroetro do cano da pipeta. Quando o corte, este diâmetro pode ser escolhido através do corte no local adequado sobre o cone da pipeta. - Fatia de Transferência
- Encha a pipeta com o meio em primeiro lugar, e em seguida, aspirar uma única fatia com forças de sucção pequenos. Isto mantém a fatia perto da abertura da pipeta e previne muita expulsão na forma de inserção para colocar a fatia.
- Aplique uma leve pressão sobre a lâmpada para formar uma pequena gota de suspensão, permitir que a fatia de resolver em que gota, e depois toque em que gotículas à membrana e que a fatia "queda" para a membrana. Geralmente três fatias são colocadas em cada pastilha de membrana.
NOTA: Se a gota de fluido é muito grande, as gotículas de as três fatias tendem a fundir sobre a superfície da membrana, e, assim, as fatias de recolher tudo para o centro da membrana, tornando-se mais difícil separá-los para a gravação electrofisiológico mais tarde.
- Remov Fluidal
- Aspirar todo o meio em excesso do topo da placa de inserção de cultura para todas as fatias em que o prato (3 fatias por pastilha = 21 fatias por placa), de modo que as fatias não são imersas em ou rodeado por um conjunto de meio de dissecção.
- Realizar isso é com um sem cortes, mas fogo-polido pipeta Pasteur. Permitir a fatia para se estabelecer e aderir à membrana por um minuto antes de pipetar. Tome cuidado para não sugar a fatia para dentro da pipeta. Realizar remoção de fluido para as inserções que são banhados em primeiro lugar, para que haja tempo suficiente para que as fatias de resolver.
- Fatia de armazenamento
- Culturas fatia da loja em um 5,0% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Observe o arranjo final das culturas na Figura 1E. As fatias individuais repousar sobre uma placa de cultura de inserção que tem uma membrana porosa de uma parte inferior, e esta inserção se encaixa dentro de um prato de Petri cheio com uma pequena quantidade de meio; por este meio, as fatias não está imerso no medio, mas têm acesso a ele somente através da membrana na parte inferior da placa de cultura de inserção.
- Opcionalmente, as fatias pode remover para estudo, quer por remoção da placa de cultura de inserção ou por corte de uma secção da membrana de inserção contendo uma fatia.
- Coloque as fatias individuais para as inserções de filtro de membrana. Com uma pipeta Pasteur cortado e polido fogo para dar um furo maior, transferir individualmente fatias para as inserções de cultura.
- Manutenção
- Trocar o meio em placas de Petri um dia depois fazendo culturas. Transferir a inserção da placa de cultura para uma nova placa de Petri contendo 1 ml de meio de cultura fresco que é equilibrada na incubadora durante pelo menos uma hora antes de serem transferidos.
- Alterar outra vez a forma da mesma maneira, no terceiro dia após a tomada de culturas. No terceiro dia, transferir as culturas para uma incubadora fixada em 34 ° C. Mudar o meio duas vezes por semana (a cada 3-4 dias).
- Identificar culturas saudáveis. Selecione culturas saudáveis para gravações de células inteiras emparelhados.
NOTA: As culturas saudáveis têm uma aresta bem definida e uma camada de células piramidais claramente definida. Culturas sagacidadeh áreas escuras (provavelmente necrótica) presente ou um aspecto vacuolizado com bordas achatadas são rejeitados. Empregando estes critérios, normalmente de dois terços das culturas fatia são suficientemente saudável para a gravação. - Utilize estas culturas dentro de uma relativamente pequena janela de tempo. Do não tecidos usados que são cultivadas durante mais de duas semanas desde os neurónios começam a exibir um comportamento ligeiramente epileptiforme que agrava lentamente com o tempo. O limite superior exacto de sobrevivência neuronal não é conhecido, mas é possível gravar a partir das células piramidais tão tarde como 16 semanas em cultura.
2. emparelhados Recordings células inteiras
- ACSF e Soluções intracelulares
- Preparar a solução de pré-sináptica por eléctrodo de mistura (em mM) 120 de gluconato de potássio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com KOH; osmolaridade: 290 mOsm). Embora a mesma solução de eléctrodo é usado para os neurónios pós-sinápticos, o gluconato de césio (120 mM) É normalmente utilizado como o principal sal no eléctrodo de pós-sináptico, mais mM QX314 5.
NOTA: Isto permite fixação de tensão estável em potenciais positivos para gravar correntes mediadas por NMDAR pós-sinápticos 8-10,13. Também previne a hiper-excitabilidade induzida por potássio do neurónio pré-sináptico da solução interna que flui a partir do eléctrodo de registo antes da pós-sináptica de um selo giga ohm é feita. - Preparar a solução de pós-sináptico compor eléctrodo (em mM) 120 de gluconato de césio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com CsOH, osmolalidade: 290 mOsm). Puxe microeletrodos de vidro em 5-10 resistência mohms e encher com solução interna filtrada.
- Preparar fluido cerebroespinal artificial (ACSF) compondo (em mM) 119 de NaCl, 2,4 de KCl, 1,3 MgSO4, 2,4 CaCl2, 1 de Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO3, 11 de glucose, pH 7,4, saturado com 95% de O 2, 5 % de CO 2. NOTA: Se r AMPAR mediadaesponses precisa ser bloqueado para exame de NMDAR EPSCs, incluem 10 mM CNQX ou NBQX no ACSF.
- Preparar a solução de pré-sináptica por eléctrodo de mistura (em mM) 120 de gluconato de potássio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com KOH; osmolaridade: 290 mOsm). Embora a mesma solução de eléctrodo é usado para os neurónios pós-sinápticos, o gluconato de césio (120 mM) É normalmente utilizado como o principal sal no eléctrodo de pós-sináptico, mais mM QX314 5.
- Obter gravações de celulares emparelhados inteiras
- Para examinar a transmissão sináptica entre dois neurônios individuais, designar um neurônio como o neurônio pré-sináptico e segure pinça de corrente para induzir potenciais de ação e iniciar a transmissão sináptica.
- Designar o segundo neurônio, como o neurônio pós-sináptico, e mantê-lo na braçadeira de tensão ou corrente, dependendo das informações exigidas pelo pesquisador. Obter exame detalhado das correntes glutamatérgicos, com EPSCs AMPAR mediadas examinados a -65 mV e EPSCs mediada por NMDAR examinados em 30 mV 6-16, mantendo o neurônio pós-sináptico na braçadeira de tensão
- Estabelecer uma gravação emparelhado. Para estabelecer uma gravação emparelhado, a gravação de células inteiras pré-sináptico é sempre obtido pela primeira vez, permitindo que vários neurônios postsynaptic seqüenciais para ser obtida até aquele que é synaptically connected é obtido. Se se realizarem ensaios de plasticidade sináptica, é especialmente crítica para a obtenção do neurónio pré-sináptico primeira como a indução de LTP no neurónio pós-sináptico deve ser iniciada dentro de 10 min de obtenção de células inteiras das gravações para evitar lavagem de factores citoplásmicos necessários para LTP 8,19.
- Evitar a perda de células induzida pelo movimento. Um desafio importante quando se realiza gravações de células inteiras emparelhadas evitar vibrações e perturbações induzidas pelo movimento do primeiro registo de célula completa, enquanto a obtenção da segunda gravação.
- Obter o primeiro registo de célula completa e, em seguida, mover a lente do microscópio 10-200 uM no eixo-x de modo que a gravação é estabelecida localizado na borda da área visível no monitor (Figura 2A).
- Levante a lente do microscópio ~ 5-10 mm, assegurando que o ACSF ainda mantém contato com a lente. Monte o segundo eletrodo e orientar no menisco fluido (Figura 2B
- Mova o eletrodo no plano xy até que esteja diretamente sob o caminho da luz através da lente, mas ainda bem acima do eletrodo de registro estabelecido. Uma vez que o eléctrodo é visível ao microscópio, é assegurar a ponta na extremidade mais distante do monitor de distância a partir do primeiro eléctrodo.
- Movimentar o segundo eléctrodo para baixo em sequência com o foco microscópio até que ambos os eléctrodos estão no mesmo plano focal. É importante que o nível de pressão positiva é suficientemente forte para evitar a obstrução da ponta, mas não demasiado forte de modo a interromper a primeira gravação de células inteiras. Isso se traduz em pressão positiva induzir movimento em 2-3 neurônios do eletrodo quando se entra pela primeira vez da fatia.
- Localizar um parceiro de pós-sináptica num plano focal semelhante à primeira gravação pré-sináptico (Figura 2C). A gravação é geralmente obter gravações entre os neurônios piramidais do CA3 a segunda célula inteira emparelhado de um neurônio 0-200 mm da primeira recording (Figuras 2C e D).
NOTA: A transmissão sináptica entre pares neuronais são estáveis ao longo de períodos de até 3-4 horas quando se utiliza estas técnicas de gravação de células inteiras padrão.
- A plasticidade sináptica: Once Upon a obtenção de um par de células piramidais synaptically conectada sucesso (3A Figures, B), examinar as características da transmissão sináptica e plasticidade.
- A indução da LTP.
- Induzir LTP, emparelhando potenciais de ação pré-sinápticos (1 Hz) com a despolarização pós-sináptica de -10 a 0 mV por 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicie o emparelhamento dentro de 10 min de break-in para o neurônio pós-sináptico.
NOTA: LTP também pode ser induzida com ambos os neurônios, realizada em pinça de corrente através do emparelhamento potenciais de ação pré-sinápticos e pós-sinápticos a 1 Hz por 1 min, com potenciais de ação pós-sinápticos provocou 10 ms após a injecção de corrente para o neurônio pré-sináptico 8
- Induzir LTP, emparelhando potenciais de ação pré-sinápticos (1 Hz) com a despolarização pós-sináptica de -10 a 0 mV por 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicie o emparelhamento dentro de 10 min de break-in para o neurônio pós-sináptico.
- Além disso induzir LTD pela baixa freqüência de estimulação (LFS) a 1 Hz combinada com uma leve despolarização do neurônio pós-sináptico para -55 mV para 5-10 min (Figura 3C) 9.
- A indução da LTP.
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Representative Results
Conectividade Synaptic é evidente, estimulando o neurônio pré-sináptico para disparar um potencial de ação por meio de um pulso de corrente de despolarização (tipicamente 20-50 aa para 20 ms), através do eletrodo de registro. O rastreio da corrente pós-sináptica é, em seguida, examinadas para a presença de um EPSC monossináptico evocado no curta (<5 ms) e latências consistentes após o pico do potencial de acção pré-sináptico (Figura 3A). Na maioria das experiências múltiplas neurónios pós-sinápticos são testados antes de um par ligado-sináptica pode ser obtido. Em geral, a 1/3 de células CA3 pré-sinápticas são monosynaptically acoplado à célula pós-sináptica por CA3 conexões sinápticas activas (Figura 3A), e aproximadamente 20% dos neurónios de CA3 são ligadas por todos os silenciosos conexões sinápticas 6,8.
A amplitude de receptores AMPA correntes mediadas base é variável de julgamento a julgamento dentro de uma gravação emparelhado, e também entre pai independentegravações vermelhos (Figura 3B) 6,8. Média de amplitude AMPAR EPSC variaram de <10 pA a> 800 pA, e provavelmente resulta de diferenças no número de sinapses funcionais entre gravações emparelhados. As taxas de falhas também foram observados para variar significativamente entre as gravações emparelhados 6,7, variando de 100% AMPAR epsc taxas de insucesso em sinapses silenciosas, a 0-95% as taxas de falha em pares ligados por sinapses ativas 6,7. Dentro gravações pares individuais, falhas sinápticas ocorreu, especialmente em gravações com menores amplitudes AMPAR epsc. A variabilidade na amplitude AMPAR EPSC é evidente a partir de uma tentativa para outra nos dados brutos (Figura 3B) é provavelmente devido à flutuação no número quântico liberado do julgamento a julgamento, como ocorre em outras sinapses 6.
Gravações de células inteiras dupla também oferecem acesso direto tanto para o pré e pós-sináptica do citoplasma neuronal, possibilitando manipulat farmacológicoion de tanto / tanto as células pré-sinápticos e pós-sinápticos através dos eletrodos de registro 6. Tipicamente, as manipulações farmacológicas pré-sinápticas são muito rápidos (em 10 min). Este não está limitado a pequenas moléculas (por exemplo, BAPTA), como dextranos marcados com fluorescência possam ter acesso aos terminais pré-sinápticos ≤200 uM longe do eléctrodo de registo. Portanto, a análise semelhante à realizada na sinapse gigante lula 25 poderá ser ampliado para estudos de vesículas sinápticas máquinas liberação da fatia do hipocampo. A posição das sinapses específicos medidos nas gravações não emparelhados são identificadas no processo de gravação. Portanto, o proximal contra outra distal de sinapses não pode ser avaliada tão prontamente como estimulação local com eletrodos de estimulação extracelular ou aplicação glutamato focal. No entanto, o enchimento corante de cada neurônio durante a gravação emparelhado pode permitir a reconstrução morfológica de pavilhões axonal e sites sinápticas potenciais LTP e LTD são induzidas de forma fiável em sinapses CA3-CA3 neste sistema de cultura (Figura 3C), e ambas as formas de plasticidade última para a duração de gravação de células inteiras (mais de 2 horas). Os LTP e indução LTD paradigmas utilizados são idênticos aos realizados em fatias agudas e LTP e LTD apresentam as propriedades de NMDAR-dependência, associamento e independência percurso, e, por conseguinte, esta combinação do sistema de cultura e gravações emparelhados proporciona um sistema valioso modelo para examinar sináptica plasticidade 7. Eventos inibitórios polissinápticos são freqüentemente observadas em gravações emparelhados entre pares de células CA3 piramidal (Figura 3D). Nós não farmacologicamente bloquear esta inibição GABAérgica como isso produz hiperatividade altamente perturbador. No entanto, devido ao aumento da latência destes eventos inibitórios polissinápticos, eles geralmente não impedir a medição da excitato monossinápticoatual ry. Se se observaram eventos inibitórios polisinápticas para interferir com a corrente monossináptico, obscurecendo o pico da corrente de monossináptico, estes pares devem ser excluídos da análise. Conexões excitatórias polissinápticos também são observadas algumas vezes, mas são muito menos comuns e também são excluídos da análise. Raramente, uma corrente sináptica inibitória monossináptico é obtida devido ao neurônio pré-sináptico ser um interneuron inibitório. Isto é facilmente identificado pela falta de alojamento de potencial de ação em resposta a mais (1 seg) injecção de corrente. Isto não é possível em neurónios pós-sinápticos, no qual se baseia-gluconato de césio a solução interna. No entanto, como os neurónios são identificadas visualmente antes da gravação, na nossa experiência presente ocorre <1% do tempo. Interneurônios dentro de fatias de hipocampo organotípicas são prontamente identificados visualmente por seu corpo de células não-piramidal, especialmente no estrato radiante e oriens. Portanto, este preparation também permite gravações de excitatória interneuron e correntes inibitórias. No entanto, muito pouco é conhecido sobre as redes inibitórias em fatias organotypic, e se manter a conectividade semelhante ao que no cérebro não é clara. 
Figura 1: Preparação de culturas organotípicas do hipocampo. (A) O hipocampo, in situ, delineado pela linha a tracejado. Para remover o hipocampo, as ligações para o fundo de saco são cortadas e o hipocampo laminados suavemente para fora do cérebro. (B) Os hipocampos são posicionados sobre a fase do cortador na parte superior do papel de filtro. (C) fatias do hipocampo são transferidos através da vasta furo de uma pipeta Pasteur para evitar danos. (D) Os exemplos de "boas" versus fatias 'ruins'.(E) dos desenhos animados de configuração fatia nas membranas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2 Obtenção emparelhado gravações de células inteiras de neurônios CA3 do hipocampo. Imagens seqüenciais de alcançar uma gravação emparelhado, mostrando eletrodo ideal e posicionamento neuronal. (A) Após a obtenção da primeira célula toda a gravação do microscópio é movido 10-200 mm no x- eixo de modo que a gravação estabelecido (seta) está localizado na extremidade da área visível no monitor. Barra de escala:. De 25 um (B) Para permitir que o espaço para o segundo eléctrodo, a lente do microscópio é, então, levantada ~ 5-10 mm, assegurando que o ACSF ainda mantém contacto coma lente. Para garantir o segundo eléctrodo não colidir o outro eléctrodo de gravação, o segundo eléctrodo é movido no eixo-x, até que está directamente sob o percurso da luz através da lente, mas ainda significativamente acima do eléctrodo de registo estabelecido. (C) que mostra a gravação Estabelecida emparelhado ambos os eléctrodos (setas) no mesmo plano focal. Barra de escala:. De 25 um (D) a gravação em pares de neurônios CA3 adjacentes em um animal transgênico, mostrando os neurônios EGFP-positivo no RHS. Barra de escala:. 20 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3 A transmissão sináptica e plasticidade entre CA3-CA3 pares de células piramidais. (D) Exemplo da pre e traços pós-sinápticos de uma gravação emparelhado entre dois neurônios piramidais CA3. Em resposta a um pulso de corrente de 20 segundos para induzir pré-sináptico potencial de ação de tiro, o pós-sináptico AMPAR mediada atual (gravado em -65 mV) ocorre em resposta direta ao potencial de ação (B) À esquerda:. A amplitude de EPSCs AMPAR mediadas varia não só entre as gravações emparelhados, mas também do julgamento-a julgamento dentro de uma gravação emparelhado. Cada ensaio representa a amplitude do EPSC medido a 0,1 Hz. Neste exemplo, amplitude AMPAR EPSC varia de 5 pA a> 60 pA. Direita: amplitudes NMDAR epsc medido a 40 mV na presença de 10 mM CNQX. Amplitudes NMDAR epsc normalmente são significativamente menores em amplitude que Ampar EPSCs, mas ainda apresentam variabilidade significativa. NMDAR EPSC amplitude tipicamente médias entre 10-20 pA em gravações emparelhados entre as células piramidais do CA3, tornando falhas facilmente identificável (C) Esquerda:. CA3 pares de células piramidais expressar LTP que persiste durante a duração do registo emparelhado. A LTP é prontamente evidente através de um aumento na amplitude de AMPAR EPSCs. Variabilidade significativa tentativa de contra-relógio na amplitude AMPAR EPSC permanece após a indução da LTP. Direita: Expressão da depressão a longo prazo (LTD) entre os neurônios piramidais do CA3. Note-se a diminuição da amplitude média da AMPAR EPSC e concomitante diminuição na tentativa de variabilidade amplitude julgamento. (D) Exemplo de correntes inibitórias polissinápticos pós-sinápticos, que ocorrem em uma latência maior em comparação com o monossináptico AMPAR EPSC. Quando o neurónio pós-sináptico é voltagem fixada em -65 mV, as correntes polissinápticos são visíveis como um segundo pico a uma latência de> 5 ms após o pico do potencial de acção pré-sináptico. Segurando o neurônio pós-sináptico a -30 mV confirma que o atual polysynaptic é inibidora devido à inversão do sentido atual."target =" es.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Tabela 1 problemas potenciais que podem surgir gravações emparelhados e preparação de culturas fatia organotypic. Esta lista potenciais problemas comuns que ocorrem com as gravações de células inteiras emparelhados em culturas fatia organotypic. Além disso, nós também aconselham que é necessário um tempo significativo para ser gasto 'dirigir' a configuração de eletrofisiologia para gravações emparelhados, como a maioria dos problemas estão relacionados com as perturbações de movimento que podem ser facilmente visualizados e corrigidos.
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Discussion
Aqui nós descrevemos os requisitos para estabelecer gravações de células bem sucedidos emparelhados inteiras em culturas organotípicas do hipocampo. Gravações emparelhados também pode ser realizada em várias preparações, incluindo fatias agudas e sistemas de culturas dissociadas 26,27. Embora o foco aqui foi sobre a indução de mais formas de plasticidade sináptica (nomeadamente LTP e LTD), é importante ressaltar que as gravações de células inteiras emparelhados em organotípica, fatia aguda e dissociado preparações celulares têm fornecido informações importantes sobre o tamanho quântico, short plasticidade -termo, função pré-sináptico, bem como LTP e LTD 2,4,8,26,27.
A principal vantagem do sistema de fatia organotípica é a maior conectividade entre os neurónios. Conectividade sináptica na preparação fatia aguda é a baixa devido ao rompimento de conexões axonais durante a preparação fatia. Em nossa experiência, emparelhado gravações de synaptically connecteneurônios d CA3 em fatias aguda foram possíveis em apenas ~ 5% de gravações emparelhados obtidos. Isto é, 95% de gravações emparelhados foram desconectadas. Uma alternativa é a utilização de primário dissociada culturas do hipocampo, onde a conectividade sináptica é significativamente mais elevada 26. No entanto, com as preparações dissociadas cultivadas vir questões referentes identidade neurónio e se as suas propriedades são semelhantes às das sinapses maduros no tecido nativo. O uso de culturas organotípicas do hipocampo melhora parcialmente porque estas preocupações subtipos neuronais pode prontamente identificados por, e as células a manter a morfologia e conectividade que são semelhantes às do tecido nativo cérebro 20. No entanto, como as fatias são mantidas in vitro durante mais de uma semana, é importante notar que o crescimento axonal significativa ocorre durante este tempo. O consequente aumento da conectividade é muito benéfico para realizar gravações emparelhados que examinam a função sináptica e plasticidade, porém devenotar-se que os estudos que examinam a conectividade de rede pode não ser adequado para esta preparação.
Enquanto a maioria das nossas gravações emparelhados têm sido realizados sobre CA3-CA3 pares de células piramidais, esta técnica pode ser facilmente adaptado para CA3-CA1 e giro dentado-CA3 emparelhado gravações. A incidência da conectividade sináptica entre gyrus e neurónios piramidais CA3 dentados neste sistema é consideravelmente inferior. No entanto, as conexões entre excitatórios monosinápticos CA3 e CA1 neste sistema tem sido relatada como sendo tão elevada como 76% 28.
Além disso, as gravações de células inteiras emparelhados são rotineiramente realizados em tecido do hipocampo do rato, incluindo ratinhos transgénicos (Figura 2D), 29-31. A técnica pode ser refinada para gravar a transmissão sináptica e plasticidade entre os neurônios com a expressão do gene mosaico 30. Rotulagem GFP de tipo selvagem neurônios permite alvejado emparelhado gravações de células inteiras de neurônios of genótipo conhecido. Estes experimentos identificaram alterações na conectividade sináptica entre os neurônios individuais, incluindo hiperconectividade ou assimétrica função pré-sináptico 30,31 que pode contribuir para déficits comportamentais observadas nesses animais.
Em resumo, as gravações de células inteiras emparelhados aumentar a capacidade de interpretar as propriedades eletrofisiológicas sinápticas e para determinar os mecanismos subcelulares que os neurônios utilizam para alterar a força sináptica. Usando esta técnica permitiu que as previsões dos modelos pré e pós-sinápticos de plasticidade sináptica a ser diretamente testada. Além disso, o fenótipo de sinapses silenciosas, e as funções específicas de zona activa e proteínas PSD também têm sido descritos nesta preparação 6-16. Ele também permitiu a descoberta de que as sinapses existem em distintos estados electrofisiologicamente definidos, e que durante as sinapses de plasticidade sináptica se deslocar entre esses estados 9,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
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