Introduction
Glutamatreceptorer medierer størstedelen af excitatorisk synaptisk transmission i centralnervesystemet synapser. De to store undertyper af ionotrope glutamatreceptorer lokaliseret ved ryggen leder af den postsynaptiske membran, er N-methyl-D-aspartat (NMDA) og α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-proprionic acid (AMPA)-receptorer. Ved hvilende membranpotentialer, AMPA-receptorer bære det meste af den postsynaptiske strøm under synaptisk transmission. I hippocampus, NMDA-receptoren spiller en central rolle i udløsningen ændringer i antallet af AMPA-receptorer i den postsynaptiske membran: ved at fungere som en "tilfældighed detektor" 1 at indlede ændringer i synaptisk styrke 1 NMDA-receptoren deltager i synaptiske mekanismer der menes at understøtte indlæring og hukommelse på subcellulært niveau. Som reaktion på depolarisering af den postsynaptiske neuron parallelt med præsynaptiske transmitterfrigivelse, calcium trænger ind via NMDAreceptoren indlede AMPA-receptoren indsættelse eller fjernelse 2. Disse receptor dynamik ligger til grund synapse plasticitet: en stigning i synaptisk styrke er langsigtet potensering 2,3 (LTP), mens en formindskelse i synaptisk styrke er langvarig depression 4 (LTD). Derfor AMPA-receptoren bevægelse menes at være ansvarlig for synaptisk plasticitet ekspression, mens NMDA-receptorer menes at regulere dens induktion.
Fastlæggelse af de præcise mekanismer, der ligger synaptisk transmission og plasticitet kræver studere små populationer af synapser, helst enkelt synapser. Mens nogle synapser er meget velegnet til undersøgelse på dette niveau, fx blomsterbægeret af Held 5, for de fleste synaptiske befolkninger dette er yderst vanskelig på grund af den lille og diffus karakter synaptiske forbindelser. To store elektrofysiologi teknikker er blevet udviklet til at undersøge enkelt synaptiske forbindelser: Den første er minimal stimulation, Where en præsynaptisk fibre antages stimuleret ekstracellulært. Den anden teknik er parret optagelser, hvor to samtidige helcelleproteiner optagelser fra synaptisk forbundne neuroner udføres. En stor fordel ved minimal stimulation er, at den er hurtig og relativt enkel at udføre, der involverer placering af en ekstracellulær stimulerende elektrode i axonal tarmkanalen samtidig optagelse fra en postsynaptisk neuron. Den primære bekymring, når du bruger denne teknik er, at pålidelige stimulering af en enkelt celle sjældent kan garanteres retssag efter retssagen.
I løbet af de sidste femten år har vi rutinemæssigt anvendes parret hel-celle optagelser fra to synaptisk forbundet pyramideneuroner 6-17. Den største fordel ved denne teknik er, at kun én præsynaptiske neuron konsekvent og pålideligt stimuleres. Det giver også mulighed for ikke kun elektrofysiologisk karakterisering, men også farmakologisk manipulation af den præsynaptiske neuron 6,18 </ Sup>. Sandsynligheden af synaptisk forbindelse mellem neuroner er lav, hvilket gør forbundne par vanskeligt at opnå 19. Anvendelsen af organotypiske hjerne skivekulturer omgår denne hindring som synaptisk forbindelse kan genoprette in vitro og desuden af arten af den resulterende forbindelse er den samme som i nativ hjernevæv 20. Desuden organotypiske kulturer udtrykker LTP, LTD 7-10,12-15,21 og andre former for kortvarig synaptisk plasticitet, herunder parret-puls lettelse (PPF) og depression (PPD) 6,22,23, så plasticitetsmodeller mekanismer til studeres i par af neuroner. Her beskriver vi den detaljerede metodologi, der er involveret i en vellykket nå parrede optagelser i denne in vitro-system. Denne information kan let tilpasses til andre eksperimentelle systemer, herunder akutte skiver og andre hjerneregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreetiske Statement:
Beskrevet i dette manuskript protokoller følge de retningslinjer dyr pleje oprettet af University of Auckland og Stanford University. P7 rotteunger blev aflivet ved hurtig halshugning. Hippocampus dissektion derefter straks udføres som beskrevet nedenfor.
1. organotypiske hippocampus Slice kultur
- Forberedelse
- Forbered dissektion Medium (bruges kun til at dissekere hjernen). Kombiner 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml penicillin-streptomycin opløsning (10.000 enheder af hvert, i 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-buffer-opløsning, 2 ml 1 M Tris-stamopløsning (pH 7,2), og filteret steriliseres med 0,22 um filter . Udføre hippocampus dissektion i iskold dissektionsmedium.
- Afkøl dissektionsmedium. Placer dissektion medier i fryseren ca 1 time før påbegyndelse af dissektion indtil væsken er meget koldt. Lad ikke stor is isystals at danne. Opbevar på is, indtil de skal.
- Forbered dyrkningsmedium (bruges til alt undtagen dissektion af hippocampi). Kombiner 100 ml Minimum Essential Medium (1x koncentrering, flydende) m / Hanks salte, w / L-glutamin, 2 ml penicillin-streptomycin-opløsning (flydende, 10.000 enheder hver, i 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M buffer opløsning, 50 ml Hanks Balanced Salt Solution, 50 ml hesteserum (defineret, varmeinaktiveret), og filteret steriliseres med 0,22 um filter.
- Forbered dyrkningsskålene. Anbringes 1 ml dyrkningsmedier pr 35 mm dyrkningsskål og tilføje en membran indsats til hver skål. Sætte op til syv af disse retter i en 150 mm petriskål (herefter refereret til som en "plade"). Pladen anbringes i en CO2-inkubator i mindst en time før dissektion begynder således at dyrkningsmediet i skålene opnår den rette temperatur og pH.
- Dissektion af Hippocampi fra rotteunger på postnatal dag 7 (P7)
- Pre-sterilisere alle dissektion værktøjer under UV-lys før proceduren.
- Efter hurtig halshugning, fjerne hjernen og sted i afkølet medium i en skål, og derefter fjerne det til et stykke fugtet filtrerpapir til dissektion. Drille cortex væk fra midthjernen ved stump glatte plastbelægning miniature spatler, udsætter hippocampus. Skær fornix, og derefter arbejde forsigtigt spatel under hippocampus at vende den ud (figur 1A).
BEMÆRK: Vellykket skivekulturer kan fremstilles ved dyr op til P10. - Trim isolerede hippocampus væk fra resten af hjernen. Overfør hippocampi ind i en ny skål indeholdende kølet dissektion medier ved hjælp af en fugtig blød pensel (fx hvid zobel # 4).
- Rengør undersiden (dvs. fladere side) af hippocampus af plexus chorioideus under dissektion, da disse svampet, meninge-lignende væv gør det vanskeligt at adskille hippocampalskiver fra hinanden senere.
BEMÆRK: Lad disse væv på plads, hvis de ikke kan drillet væk forsigtigt. - Udfør hele dissektion så hurtigt som muligt uden at beskadige hippocampi.
BEMÆRK: En omhyggelig dissektion er vigtigere end en hurtig en, så længe de eksperimentelle betingelser nedkøles. Skær hippocampi fra tre rotter samtidig. Den skive sundhed påvirkes ikke, så længe som den totale tid fra start til, når de belagte skiver gå ind i inkubatoren i 30 min.
- Skiveskæring
- Skær hippocampi tværs i 400 um tværsnit ved hjælp af en manuel væv pålægsmaskine. Den metode, som udskæring udføres er ikke vigtigt, så længe det ikke er alt for skadelig for væv og producerer skiver af ensartet tykkelse med let synlig laminar arkitektur (dvs. Ammons Horn ses let at blive bevaret i væv).
- Lig hippocampi på scenen af vævetsnitter på toppen af en tredobbelt tykkelse # 2 filterpapir. Hippocampi er skåret helt uden at fjerne skiver individuelt (dvs. hele hippocampus er tilbage på scenen for chopper, indtil der er foretaget alle udskæringer, lidt ligesom brød af skiveskåret brød på dette punkt, figur 1B).
- Overfør hippocampi i dissektionsmedium med en blød pensel lagt ved siden af hver hippocampus (hvid zobel 2 #). Skub forsigtigt hver hippocampus til siden for at bryde vedhæftningen mellem hippocampus og den underliggende filtrerpapir. Rul penslen under hver hippocampus til at samle den op fra scenen. Anbring alle Hippocampi i den samme 35 mm petriskål kølet dissektionsmedium. Adskil hippocampi i individuelle skiver ved manuelt at ryste fadet i vekslende med og mod uret bevægelser.
- Efterse skiverne under et dissektionsmikroskop og kassere enhver, der er beskadiget, små, eller som ikke besidder klart synligt cellekrop lag.
BEMÆRK: Det vil ofte være tilfældet, at ikke alle skiverne med held adskilt fra deres søskende på denne måde. I dette tilfælde, kan de adskilles ved at dreje dem på kanten og puffede dem med spidsen af fine tænger. "Good" skiver overføres derefter til en anden ren petriskål indeholdende kølet dissektionsmedium hjælp af en afskåret og flammepoleret Pasteur-pipette (figur 1C-E).
- Opbevaring
- Placer de enkelte skiver på membranfiltret skær. Ved hjælp af en Pasteur-pipette afskåret og flammepoleret at give en større boring, individuelt overføre skiver til kultur skær.
BEMÆRK: Størrelsen af boringen skabes, når opskæring og brand-polering pipetten er vigtig. For lille og skiverne vil ikke let forlade pipette til membranen. For stor og overskydende væske er placeret på overfladen af membranen sammen med skive. Den bedste boringsdiameter er typisk omkring halvdelen af diaeter af cylinderen af pipetten. Når der skæres, kan denne diameter vælges ved at skære på det rette sted på tilspidsning af pipetten. - Slice Transfer
- Fyld pipetten med medium, og derefter suge en enkelt skive med små sugekræfter. Dette holder skive nær åbningen af pipetten og forhindrer for meget medium udvisning i indsatsen for at placere skive.
- Påfør et let tryk på pæren til at danne en lille hængende dråbe, tillader skive at bosætte sig i denne dråbe, og tryk derefter på, at dråben til membranen, og lad den skive "falder" på membranen. Generelt tre skiver er placeret på hver membran indsatsen.
BEMÆRK: Hvis væsken dråben er for stor, dråberne fra de tre skiver har tendens til at fusionere på membranoverfladen, og skiverne vil således alle samles til midten af membranen, hvilket gør det mere vanskeligt at adskille dem for elektrofysiologiske optagelse senere.
- Fluid aftal
- Aspirer eventuelt overskydende medium fra toppen af dyrkningspladen indsatsen for alle skiver i denne plade (3 skiver per skær = 21 skiver pr plade), således at skiverne ikke er nedsænket i eller omgivet af en pulje af dissektionsmedium.
- Udfør denne er med en uklippet, men brand-poleret Pasteur-pipette. Lad skive at bosætte sig og holde sig til membran til et minut før pipettering. Pas på ikke at suge skive op i pipetten. Foretag fjernelse væske til indsatserne, der er belagt dels at give tilstrækkelig tid til skiverne at bilægge.
- Slice Opbevaring
- Store skivekulturer i en 5,0% CO2-inkubator ved 37 ° C. Observer endelige arrangement af kulturerne i figur 1E. De enkelte skiver hvile på en dyrkningsplade indsats, som har en porøs membran til en bund, og denne indsats passer inde i en petriskål fyldt med en lille mængde af mediet; på denne måde, er skiverne ikke nedsænket i migdium, men har adgang til kun gennem membranen på bunden af dyrkningspladen indsatsen.
- Eventuelt fjerne skiverne kan for at studere, enten ved at fjerne dyrkningspladen indsatsen eller ved at skære en del af indsatsen membran indeholdende en skive.
- Placer de enkelte skiver på membranfiltret skær. Ved hjælp af en Pasteur-pipette afskåret og flammepoleret at give en større boring, individuelt overføre skiver til kultur skær.
- Vedligeholdelse
- Udskift medium i petriskåle dagen efter at kulturer. Overfør dyrkningspladen indsatsen til en ny petriskål indeholdende 1 ml frisk dyrkningsmedium, der er ækvilibreret i inkubatoren i mindst en time før overførsel.
- Skift mediet igen på samme måde på den tredje dag efter at kulturer. På den tredje dag, overføres kulturerne til en inkubator indstillet ved 34 ° C. Skift mediet to gange hver uge (hver 3-4 dage).
- Identificer sunde kulturer. Vælg sunde kulturer til parrede helcelle optagelser.
BEMÆRK: Sunde kulturer har en veldefineret kant og en klart defineret pyramideformet cellelag. Kulturer with mørke (sandsynligvis nekrotisk) områder til stede eller en vakuoliserede udseende med flade grænser afvises. Anvender disse kriterier, som regel to tredjedele af skivekulturer er tilstrækkeligt sundt for optagelse. - Udnyt disse kulturer inden for en forholdsvis lille vindue af tid. Må ikke anvendes væv, der dyrkes i mere end to uger siden neuroner begynder at vise lidt epileptiforme adfærd, der langsomt forværres med tiden. Den nøjagtige øvre grænse for neuronal overlevelse er ikke kendt, men det er muligt at optage fungere pyramideformede celler så sent som 16 uger i kultur.
2. Forbundne helcelle Optagelser
- ACSF og Intracellulære Løsninger
- Forbered præsynaptisk elektrode ved at blande (i mM) 120 kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCI2, 2 NaATP og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Selv om samme elektrode opløsning anvendes til postsynaptiske neuroner, cæsium gluconat (120 mM) Anvendes typisk som den største salt i den postsynaptiske elektrode, plus 5 mM QX314.
BEMÆRK: Dette giver stabil spænding fastspænding på positive potentialer for at optage postsynaptiske NMDAR-medierede strømme 8-10,13. Det forhindrer også kalium-induceret overpirreligt den præsynaptiske neuron af den interne løsning flyder fra den postsynaptiske optagelse elektrode før en giga ohm tætning er lavet. - Forbered postsynaptisk elektrode løsning komponere (i mm) 120 cæsium gluconat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 NaATP og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med CsOH, osmolaritet: 290 mOsm). Træk glasmikroelektroder 5-10 MOhm modstand og fyld med filtreret intern løsning.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) komponere (i mM) 119 NaCI, 2,4 KCI, 1,3 MgSO4, 2,4 CaCI 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO3, 11 glucose, pH 7,4, mættet med 95% O2, 5 % CO2. BEMÆRK: Hvis Ampar-medieret responses skal blokeres for behandlingen af NMDAR EPSCs, omfatter 10 uM CNQX eller NBQX i ACSF.
- Forbered præsynaptisk elektrode ved at blande (i mM) 120 kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCI2, 2 NaATP og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Selv om samme elektrode opløsning anvendes til postsynaptiske neuroner, cæsium gluconat (120 mM) Anvendes typisk som den største salt i den postsynaptiske elektrode, plus 5 mM QX314.
- Opnå Parret Helcelle Optagelser
- For at undersøge synaptisk transmission mellem to individuelle neuroner, udpege en neuron som den præsynaptiske neuron og hold i strømtang at fremkalde virkningspotentialer og iværksætte synaptisk transmission.
- Udpeg den anden neuron, som den postsynaptiske neuron, og hold den i strøm eller spænding klemme afhængigt af oplysninger, der kræves af forskeren. Indhente detaljerede gennemgang af de glutamaterge strømme, med undersøgte ved -65 mV Ampar medierede EPSCs og NMDAR-medieret EPSCs undersøgt på +30 mV 6-16 ved at holde den postsynaptiske neuron i spænding klemme
- Etablere en parret optagelse. At etablere en parret optagelse, den præsynaptiske hele celle optagelse altid er fremstillet først, så flere sekventielle postsynaptiske neuroner, der skal indhentes, før en, der er synaptisk connected er opnået. Hvis der udføres synaptisk plasticitet eksperimenter, er det især vigtigt at opnå den præsynaptiske neuron først som induktionen af LTP i den postsynaptiske neuron skal påbegyndes inden for 10 min for at opnå de helcelle optagelser for at forhindre udvaskning af cytoplasmatiske faktorer, der kræves for LTP 8,19.
- Undgå bevægelse-induceret celle tab. En stor udfordring, når du udfører parrede helcelleproteiner optagelser er at undgå vibrationer og bevægelse fremkaldt afbrydelse af første hele celle optagelse samtidig opnå den anden optagelse.
- Anskaf den første hele celle optagelse og derefter flytte mikroskop linse 10-200 um i x-aksen, således at den etablerede optagelse ligger på kanten af det synlige område på skærmen (figur 2A).
- Hæv linse mikroskop ~ 5-10 mm samtidig sikre, at ACSF stadig fastholder kontakt med objektivet. Monter den anden elektrode og vejledning i væsken menisk (figur 2B
- Flyt elektroden i xy planet, indtil det er direkte under lysbanen gennem objektivet, men stadig betydeligt over den etablerede optagelse elektrode. Når elektroden er synlig under mikroskop sikre spidsen er ved den yderste kant af skærmen væk fra den første elektrode.
- Flyt den anden elektrode ned i sekvens med mikroskop fokus, indtil begge elektroder er i samme fokusplan. Det er vigtigt, at størrelsen af positivt tryk er stærk nok til at undgå spids blokering, men ikke for stærkt, så at forstyrre den første helcelle optagelse. Dette svarer til det positive tryk inducerende bevægelse i 2-3 neuroner fra elektroden, når det først kommer ind i skive.
- Find en postsynaptiske partner i en lignende fokalplan til den første præsynaptiske optagelse (Figur 2C). Optagelsen får generelt parret optagelser mellem CA3 pyramideneuroner den anden hele celle fra en 0-200 mm neuron af den første ROptagelse (figur 2C og D).
BEMÆRK: Synaptic transmission mellem neuronale par er stabile over tidsperioder på op til 3-4 timer, når du bruger disse standard hele celle optagelse teknikker.
- Synaptisk plasticitet: Once Upon opnå en succesfuld synaptisk forbundet pyramideformet celle par (figur 3A, B), undersøge karakteristika synaptisk transmission og plasticitet.
- LTP-induktion.
- Fremkald LTP ved parring præsynaptiske virkningspotentialer (1 Hz) med postsynaptiske depolarisering til -10 til 0 mV i 1 min (figur 3C) 7-9,12-14. Påbegynd parring inden for 10 min af indbrud til den postsynaptiske neuron.
BEMÆRK: LTP kan også induceres med både neuroner afholdt i strømtang ved parring præsynaptiske og postsynaptiske virkningspotentialer ved 1 Hz i 1 min, med postsynaptiske virkningspotentialer fremkaldte 10 msek efter injektion af strøm i den præsynaptiske neuron 8
- Fremkald LTP ved parring præsynaptiske virkningspotentialer (1 Hz) med postsynaptiske depolarisering til -10 til 0 mV i 1 min (figur 3C) 7-9,12-14. Påbegynd parring inden for 10 min af indbrud til den postsynaptiske neuron.
- Yderligere inducerer LTD af lavfrekvent stimulation (LFS) ved 1 Hz kombineret med en svag depolarisering af den postsynaptiske neuron til -55 mV i 5-10 minutter (figur 3C) 9.
- LTP-induktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synaptic tilslutningsmuligheder er tydeligt ved at stimulere den præsynaptiske neuron at fyre en handling potentiale ved at passere en depolariserende strøm puls (typisk 20-50 Pa for 20 ms) via optagelse elektrode. Den postsynaptiske aktuelle spor undersøges derefter for tilstedeværelse af en monosynaptisk EPSC fremkaldt ved kort (<5 ms) og konsekvente latenstider efter toppen af præsynaptisk virkningspotentiale (figur 3A). I de fleste eksperimenter flere postsynaptiske neuroner testes, før en synaptisk forbundet par kan opnås. Samlet set ~ 1/3 af præsynaptiske CA3 celler monosynaptically koblet til den postsynaptiske CA3 cellen ved aktive synaptiske forbindelser (figur 3A), og omkring 20% af CA3 neuroner er forbundet med alle tavse synaptiske forbindelser 6,8.
Amplituden af baseline AMPA receptor medierede strømme er variabel fra forsøg til forsøg inden for en parret optagelse, og også mellem uafhængige pairøde optagelser (figur 3b) 6,8. Gennemsnitlig Ampar EPSC amplitude varierede fra <10 Pa til> 800 pA, og sandsynligvis skyldes forskelle i antallet af funktionelle synapserne mellem parrede optagelser. Fejlrater er også blevet observeret til at variere betydeligt mellem parrede optagelser 6,7, der spænder fra 100% Ampar epsc fejlrater på tavse synapser, at 0-95% fejlrater parvis forbundet med aktive synapser 6,7. Inden for de enkelte parrede optagelser forekom synaptiske fejl, især i optagelser med mindre Ampar epsc amplituder. Variabiliteten i Ampar EPSC amplitude er tydeligt fra forsøg til forsøg i de rå data (figur 3B) skyldes sandsynligvis udsving i kvantalt tal frigivet fra forsøg til forsøg, som det sker på andre synapser 6.
Dual helcelleproteiner optagelser giver også direkte adgang til både før og den postsynaptiske neuronale cytoplasma, så farmakologisk manipulation enten / både præsynaptiske og postsynaptiske celler via registreringselektroderne 6. Typisk præsynaptiske farmakologiske manipulationer er meget hurtig (under 10 minutter). Dette er ikke begrænset til små molekyler (f.eks BAPTA), som fluorescensmærkede dextraner kan få adgang til præsynaptiske terminaler ≤200 um væk fra elektrode. Derfor analyse svarende til den, der udføres på blæksprutte gigant synapse 25 kunne udvides til studier af synaptisk vesikel frigivelse maskiner i hippocampus skive. Positionen af de specifikke synapser målt i de parrede optagelser ikke er identificeret i optagelsen. Derfor den proximale kontra distale lokaliteter af synapser kan ikke vurderes så let som lokal stimulering med ekstracellulære stimulerende elektroder eller fokal glutamat ansøgning. Farvestof fyldning af hver neuron i den parrede optagelsen, kan imidlertid gøre det muligt morfologisk rekonstruktion af axonale lysthuse og potentielle synaptiske sites LTP og LTD pålideligt induceret ved CA3-CA3 synapser i denne kultur (figur 3C), og begge former for plasticitet sidste for varigheden af helcelle optagelser (over 2 timer). LTP og LTD induktion paradigmer anvendes, er identiske med dem, der udføres i akutte skiver og LTP og LTD udviser egenskaber NMDAR-afhængighed, associativitet og gangsti uafhængighed, og derfor er denne kombination af kultur, og parrede optagelser giver en værdifuld model system til at undersøge synaptisk plasticitet 7. Polysynaptiske hæmmende begivenheder ofte observeret i parrede optagelser mellem CA3 pyramideformede celle par (figur 3D). Vi har ikke farmakologisk blokere denne GABAergic hæmning, da dette giver meget forstyrrende hyperaktivitet. Men på grund af den længere ventetid disse polysynaptiske inhibitoriske begivenheder, er de generelt ikke forhindre måling af monosynaptisk excitatory strøm. Hvis polysynaptiske hæmmende hændelser blev observeret at interferere med monosynaptiske strøm, tilslører toppen af monosynaptiske strøm, skal udelukkes fra analysen af disse par. Polysynaptiske excitatoriske forbindelser er også nogle gange observeres, men er betydeligt mindre udbredt, og også er udelukket fra analysen. Sjældent, opnås en monosynaptiske hæmmende synaptisk strøm på grund af den præsynaptiske neuron er en hæmmende interneuron. Det er let identificeres af manglen på indkvartering af virkningspotentiale fyring som reaktion på længere (1 sek) strøm injektion. Dette er ikke muligt i postsynaptiske neuroner, hvor det indre opløsning cæsium gluconat-baserede. Men som neuroner identificeres visuelt før optagelse, i vores erfaring dette sker <1% af tiden. Interneuroner i organotypiske hippocampus skiver let identificeres visuelt ved deres ikke-pyramideformet celle kroppen, især i stratum radiatum og Oriens. Derfor er denne PReparation også muligt optagelser af interneuron excitatoriske og hæmmende strømme. Meget lidt er dog kendt om de inhibitoriske netværk i organotypiske skiver, og om de opretholder tilslutning svarer til den i hjernen er ikke klart. 
Figur 1. Fremstilling af organotypiske hippocampus skive kulturer. (A) Hippocampus in situ skitseret af den stiplede linje. For at fjerne hippocampus, er forbindelser til fornix adskilt og hippocampus forsigtigt rullede ud af hjernen. (B) Hippocampi er placeret på den fase af pålægsmaskine oven på filtrerpapir. (C) hippocampusskiver overføres via den brede boring af en Pasteur-pipette til at forebygge skader. (D) Eksempler på "gode" versus "dårlige" skiver.(E) Cartoon skive setup på membraner. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2. Indhentning parret helcelleproteiner optagelser fra hippocampus CA3 neuroner. Sekventielle billeder af opnå en parret optagelse, der viser optimalt elektrode og neuronal positionering. (A) Efter opnåelse af den første hele celle optagelse mikroskopet flyttes 10-200 mm x- akse, således at den etablerede optagelse (pil) er placeret på kanten af det synlige område på skærmen. Målestokken:. 25 um (B) For at sikre plads til den anden elektrode, er linsen af mikroskopet derefter hævet ~ 5-10 mm, der sikrer, at den ACSF stadig fastholder kontakt medlinsen. For at sikre den anden elektrode ikke støde den anden optagelse elektrode er den anden elektrode flyttes i x-aksen, indtil det er direkte under lysbanen gennem objektivet, men stadig betydeligt over den etablerede optagelse elektrode. (C) Etablerede parret optagelse viser begge elektroder (pile) i samme fokale plan. Målestokken:. 25 um (D) Parret optagelse fra tilstødende CA3 neuroner i et transgent dyr, der viser EGFP-positive neuroner på RHS. Målestokken:. 20 um Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3. synaptisk transmission og plasticitet mellem CA3-CA3 pyramideformede celle par. (A) Eksempel pre- og postsynaptiske spor fra en parret optagelse mellem to CA3 pyramideformede neuroner. Som svar på en 20 sek strømpuls at fremkalde præsynaptiske handling potentiale fyring, den postsynaptiske Ampar-medieret strøm (optaget ved -65 mV) forekommer i direkte reaktion på handling potentiale (B) Venstre: varierer amplituden af Ampar medierede EPSCs. ikke kun mellem parrede optagelser, men også fra trial-til-rettergang inden en parret optagelse. Hvert forsøg repræsenterer amplituden af EPSC måles ved 0,1 Hz. I dette eksempel Ampar EPSC amplitude svinger fra 5 PA til> 60 pA. Højre: NMDAR epsc amplituder målt til +40 mV i nærvær af 10 uM CNQX. NMDAR epsc amplituder er typisk betydeligt mindre i amplitude at Ampar EPSCs, men stadig viser betydelig variation. NMDAR EPSC amplitude typisk gennemsnit mellem 10-20 pa i parrede optagelser mellem CA3 pyramideformede celler, hvilket gør fejl let identificerbare (C) Venstre:. CA3 pyramideformede celle par udtrykke LTP, som holder sig længden af den parrede optagelse. LTP er umiddelbart indlysende ved en stigning i amplituden af Ampar EPSCs. Betydelig trial-til-retssagen variabilitet i Ampar EPSC amplituden er tilbage efter induktionen af LTP. Til højre: Ekspression af langvarig depression (LTD) mellem CA3 pyramideformede neuroner. Bemærk fald i den gennemsnitlige amplitude af Ampar EPSC og ledsagende fald i forsøg til forsøg amplitude variation. (D) Eksempel på postsynaptiske polysynaptiske hæmmende strømninger, som forekommer på en længere ventetid i forhold til den monosynaptiske Ampar EPSC. Når den postsynaptiske neuron er spænding klemt ved -65 mV de polysynaptiske strømme er synlig som en anden top ved en latenstid på> 5 msek efter toppen af præsynaptisk virkningspotentiale. Hold den postsynaptiske neuron ved -30 mV bekræfter, at polysynaptiske strøm er hæmmende på grund af tilbageførsel af den nuværende retning.es.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. 
Tabel 1. Potentielle problemer i parrede optagelser og udarbejdelse af organotypiske skive kulturer. Her vises almindelige potentielle problemer, der opstår med parrede helcelleproteiner optagelser i organotypiske skive kulturer. Derudover har vi også rådgive, at en betydelig mængde tid er forpligtet til at blive brugt "køre" elektrofysiologi setup for parrede optagelser, da de fleste problemer er relateret til bevægelse forstyrrelser, der let kan visualiseres og udbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet kravene til oprettelse af vellykkede parrede helcelleproteiner optagelser i organotypiske hippocampus skivekulturer. Forbundne optagelser kan også udføres på flere præparater, herunder akutte skiver og dissocierede dyrkningssystemer 26,27. Mens fokus her har været på induktionen af længere former for synaptisk plasticitet (nemlig LTP og LTD), er det vigtigt at fremhæve, at parret helcelleproteiner optagelser i organotypisk, akut skive og dissocieret cellepræparater har givet vigtig indsigt i kvantalt størrelse, kort -term plasticitet, præsynaptiske funktion, samt LTP og LTD 2,4,8,26,27.
Den største fordel af organotypiske skive system er den stigende forbindelse mellem neuroner. Synaptic tilslutning i den akutte skive forberedelse er lav på grund af afbrydelse af axonale forbindelser under skive forberedelse. Det er vores erfaring, parret optagelser fra synaptisk connected CA3 neuroner i akutte skiver var muligt i kun ~ 5% af parrede optagelser opnået. Det er 95% af parrede optagelser var usammenhængende. Et alternativ er at bruge primær dissocierede hippocampus kulturer, hvor synaptiske tilslutning er betydeligt højere 26. Men med dissocierede dyrkede forberedelser kommer spørgsmål vedrørende neuron identitet og om deres egenskaber ligner dem af modne synapser i native væv. Brugen af organotypiske hippocampus skivekulturer delvist mildner disse bekymringer, fordi neuronale undertyper let ved kan identificeres, og cellerne opretholder morfologi og tilslutningsmuligheder, der ligner indfødte hjernevæv 20. Men som skiver opretholdes in vitro i løbet af en uge, er det vigtigt at bemærke, at en betydelig axon-vækst sker i løbet af denne tid. Den deraf følgende stigning i tilslutning er i høj grad til gavn for udførelse af parrede optagelser, der undersøger synaptisk funktion og plasticitet, men det børbemærkes, at som undersøger netværksforbindelse ikke kan være egnet til dette præparat.
Mens de fleste af vores parrede optagelser er blevet gennemført på CA3-CA3 pyramideformede celle par, kan denne teknik let tilpasses til CA3-CA1- og dentatgyrus-CA3 parret optagelser. Forekomsten af synaptisk forbindelse mellem gyrus dentatus og CA3 pyramidale neuroner i dette system er betydeligt lavere. Imidlertid har monosynaptisk excitatoriske forbindelser mellem CA3 og CA1 i dette system blevet rapporteret at være så høj som 76% 28.
Desuden er parret helcelle optagelser rutinemæssigt udføres i mus hippocampus væv, herunder transgene mus (figur 2D) 29-31. Teknikken kan forfines yderligere at optage synaptisk transmission og plasticitet mellem neuroner med mosaik genekspression 30. GFP mærkning af vildtype-neuroner muliggør målrettet parret helcelleproteiner optagelser i neuroner of kendt genotype. Disse eksperimenter har identificeret ændringer i synaptisk forbindelse mellem de enkelte neuroner, herunder hyperconnectivity eller asymmetrisk præsynaptiske funktion 30,31 der kan bidrage til adfærdsmæssige mangler observeret i disse dyr.
Sammenfattende parret hel celle optagelser øger evnen til at fortolke elektrofysiologiske synaptiske egenskaber, og at bestemme de subcellulære mekanismer, som neuroner anvender til at ændre synaptisk styrke. Med denne teknik har gjort det muligt forudsigelser før og postsynaptiske modeller af synaptisk plasticitet at være direkte testet. Desuden har fænotypen af tavse synapser og specifikke roller aktiv-zone og PSD proteiner også blevet beskrevet i dette præparat 6-16. Det har også gjort det muligt for opdagelsen af, at synapser findes i forskellige elektrofysiologisk definerede tilstande, og at der under synaptisk plasticitet synapser flytte mellem disse stater 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
