Introduction
Glutamat-receptorer medierar majoriteten av excitatorisk synaptisk transmission vid centrala nervsystemet synapser. De två viktiga subtyper av jonotropiska glutamatreceptorer lokaliserade i ryggrad huvudet av det postsynaptiska membranet är N-metyl-D-aspartat (NMDA) och α-amino-3-hydroxi-5-metylisoxazol-4-proprionsyra (AMPA) receptorer. Vid vila membranpotentialer, AMPA receptorer bär de flesta av de postsynaptiska ström under synaptisk transmission. I hippocampus spelar NMDA-receptorn en viktig roll för att utlösa förändringar i antalet AMPA-receptorer i postsynaptiska membranet: genom att agera som en "tillfällighet detektor" 1 för att initiera förändringar i synaptisk styrka 1, deltar NMDA-receptorn i synaptiska mekanismerna som är tänkt att stödja inlärning och minne på en subcellulär nivå. Som svar på depolarisering av den postsynaptiska neuron parallellt med frisläppandet presynaptisk sändare, går kalcium via NMDAreceptor att inleda AMPA receptor insättning eller borttagning 2. Dessa receptordynamik ligger bakom synaps plasticitet: en ökning av synaptisk styrka är långsiktig potentiering 2,3 (LTP), medan en minskning i synaptisk styrka är långvarig depression 4 (LTD). Därför AMPA-receptorrörelse tros vara ansvarig för synaptisk plasticitet uttryck, medan NMDA-receptorer tros reglera sin induktion.
Fastställande av exakta mekanismerna synaptisk transmission och plasticitet underliggande kräver att studera små populationer av synapser, helst enstaka synapser. Medan vissa synapser är mycket lämpad för studier på denna nivå, till exempel, den Calyx av Held 5, för de flesta synaptiska populationer detta är extremt svårt på grund av de små och diffusa karaktären av de synapsförbindelser. Två större elektrofysiologiska tekniker har utvecklats för att undersöka enskilda synapsförbindelser: Den första är minimal stimulans, where en presynaptisk fiber antas stimuleras extracellulärt. Den andra tekniken är parad inspelningar, där två samtidiga hela cell inspelningar från synaptically anslutna nervceller utförs. En stor fördel med minimal stimulering är att den är snabb och relativt enkla att utföra, som involverar placering av en extracellulär stimulerande elektrod i axonal tarmkanalen samtidigt inspelning från en postsynaptisk neuron. Det viktigaste när man använder denna teknik är att tillförlitlig stimulering av en enda cell sällan kan garanteras rättegång efter rättegång.
Under de senaste femton åren har vi rutinmässigt används parat hel-cell inspelningar från två synaptically anslutna pyramidala nervceller 6-17. Den stora fördelen med denna teknik är att endast ett presynaptiska neuronen är konsekvent och tillförlitligt sätt stimuleras. Det gör också inte bara elektrofysiologiska karakterisering utan även farmakologisk manipulation av presynaptiska neuron 6,18 </ Sup>. Emellertid är sannolikheten för synaptisk konnektivitet mellan neuroner låg, vilket gör anslutna parvis svårt att erhålla 19. Användningen av organotypiska hjärn slice kulturer kringgår detta hinder som synaptiska uppkoppling kan återupprätta in vitro och dessutom vilken typ av resulte anslutning liknar den i normal hjärnvävnad 20. Dessutom organotypiska kulturer uttrycker LTP, LTD 7-10,12-15,21 och ytterligare former av kortsiktiga synaptisk plasticitet inklusive parade puls underlättande (PPF) och depression (PPD) 6,22,23, vilket möjliggör plasticitet mekanismer för att studeras i par av neuroner. Här beskriver vi de specificerade metoder involverade i framgångsrikt uppnå parade inspelningar i detta in vitro-system. Denna information kan lätt anpassas till andra experimentella system, inklusive akut skivor och andra hjärnregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Ethics Uttalande:
Protokollen i detta manuskript följer riktlinjerna djurskötsel fastställda av The University of Auckland och Stanford University. P7 råttungar avlivades genom snabb halshuggning. Hippocampus dissektion därefter omedelbart utfördes såsom beskrivs nedan.
1 Organotypic hippocampus Slice Kultur
- Framställning
- Förbered dissektion Medium (används endast för att dissekera hjärnan). Kombinera 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml penicillin-streptomycin-lösning (10.000 enheter av varje, i 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-buffertlösning, 2 ml 1 M Tris-förrådslösning (pH 7,2) och filter sterilisera med 0,22 pm filter . Utför hippocampus dissektion i iskallt dissektion medium.
- Kyl dissektion medium. Placera dissektion medier i frysen ungefär 1 h före början dissektion tills vätskan är mycket kallt. Låt inte stora is spystals att bilda. Förvara på is fram till användning.
- Förbered odlingsmedium (används för allt utom dissektion av hippocampus). Kombinera 100 ml Minimum Essential Medium, (1x koncentrations, vätska) w / Hanks salter, w / L-glutamin, 2 ml penicillin-streptomycin-lösning (vätska, 10.000 enheter av varje, i 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES-1 M buffert lösning, 50 ml Hanks balanserade saltlösning, 50 ml hästserum (definierad, värmeinaktiverat), och filtrera sterilisera med 0,22 pm filter.
- Förbered odlingsskålarna. Placera 1 ml odlingsmedium per 35 mm odlingsskål, och lägg till en membraninsats till varje maträtt. Sätt upp till sju av dessa rätter i en 150 mm petriskål (nedan kallade en "platta"). Placera plattan i en CO2-inkubator i minst en timme före dissekering början så att odlingsmediet i rätter uppnår rätt temperatur och pH.
- Dissektion av hippocampus från råttungar på postnatal dag 7 (P7)
- Pre-sterilisera alla dissektion verktyg under UV-ljus innan förfarandet.
- Efter en snabb halshuggning, ta bort hjärnan och plats i kylt medium i en skål, och ta sedan bort den till en bit fuktat filterpapper för dissekering. Reta cortex från mellanhjärnan med trubbiga släta plastbelagda miniatyr spatlar, utsätta hippocampus. Skär fornix, och sedan försiktigt arbeta spateln under hippocampus för att vända den ut (Figur 1A).
OBS: Lyckad slice kulturer kan framställas med hjälp av djur upp till P10. - Trimma isolerade hippocampus bort från resten av hjärnan. Överför hippocampi i en ny skål med kyld dissektion media med en fuktad mjuk pensel (t.ex. vit sobel # 4).
- Rengör undersidan (dvs planare sidan) av hippocampus i choroid plexus under dissekering, eftersom dessa porösa, meninge liknande vävnader gör det svårt att separera hippocampusskivor från varandra senare.
OBS: Låt dessa vävnader på plats om de inte kan bli retad bort försiktigt. - Utför hela dissekering så snabbt som möjligt utan att skada hippocampi.
OBS: En noggrann dissektion är viktigare än en snabb en, så länge som de experimentella betingelserna kyls. Skiva hippocampi från tre råttor samtidigt. Segmentet hälsa påverkas inte så länge som den totala tiden från start till när pläterade skivor går in i inkubatorn är under 30 min.
- Skivning
- Skiva hippocampi tvären i 400 nm tvärsnitt med en manuell vävnad slicer. Den metod som skivning utförs är inte viktigt, så länge det inte är alltför skadligt för vävnader och producerar skivor av enhetlig tjocklek med väl synlig laminärt arkitektur (dvs Ammons horn är lätt ses som skall bevaras i vävnaden).
- Ligg hippocampi på scenen av vävnadenchopper på toppen av en trippeltjocklek av # 2 filterpapper. Den hippocampi skivade helt utan att ta bort några skivor individuellt (dvs. hela hippocampus är kvar på scenen av helikoptern tills alla nedskärningar har gjorts, ungefär som limpor skivat bröd på denna punkt, Figur 1B).
- Överför hippocampi i dissektion mediet med en mjuk pensel som bredvid varje hippocampus (vit sobel # 2). Tryck försiktigt varje hippocampus åt sidan för att bryta vidhäftningen mellan hippocampus och den underliggande filterpapper. Rulla borsten under varje hippocampus för att plocka upp den från scenen. Lägg alla hippocampi i samma 35 mm petriskål kyld dissektion medium. Separera hippocampi i enskilda skivor genom att manuellt röra om skålen i alternerande medurs och moturs rörelser.
- Inspektera skivor under ett dissektionsmikroskop och kasta något som är skadade, små, eller som inte har tydligt cellkroppsskikt.
OBS: Det är ofta så att inte alla skivor framgångsrikt separeras från sina syskon på detta sätt. I detta fall kan de separeras genom att vrida dem på kant och petade dem med tips av fin pincett. "Bra" skivor överförs sedan till en annan ren petriskål med kyld dissektion medium med användning av en avskurna och brand-polerat pasteurpipett (figur 1C-E).
- Förvaring
- Placera de enskilda skivor på membranet filterinsatser. Med hjälp av en pasteurpipett avskurna och brand poleras för att ge en större borrning, individuellt överföra skivor till kulturinsatser.
OBS: Storleken av hålet som skapas vid skärning och brand-polering pipetten är viktig. Alltför liten och skivorna kommer inte lätt att lämna pipetten för membranet. Alltför stora och överflödig vätska är placerad på ytan av membranet längs med segmentet. Det bästa håldiameter är typiskt ungefär halva diameter av tunnan av pipetten. Vid skärning kan detta diameter väljas genom att skära på rätt plats på avsmalningen av pipetten. - Skiva Transfer
- Fyll pipetten med medium först, och sedan suga upp en skiva med små sugkrafter. Detta håller slice nära öppningen av pipetten och förhindrar för mycket medel utvisning i insatsen för att placera segmentet.
- Applicera ett lätt tryck på lampan för att bilda en liten hängande droppe, låt slice att bosätta sig i den droppe, och sedan på att droppen till membranet och låta slice "faller" på membranet. Generellt tre skivor placeras på varje membraninsats.
OBS: Om vätskedroppen är för stor, dropparna från de tre skivor tenderar att gå samman på membranytan, och skivorna kommer därmed allt samlas till mitten av membranet, vilket gör det svårare att separera dem för elektrofysiologiska inspelning senare.
- Fluid Avtagbarfl
- Aspirera varje överskott medium från den övre delen av odlingsplatta insatsen för alla skivor i att plattan (3 skivor per skär = 21 skivor per platta), så att skivorna inte är nedsänkta i eller omgiven av en pool av dissektion medium.
- Utför detta är med en oklippt, men brand polerad pasteurpipett. Låt slice för att bosätta sig och hålla sig till membranet i en minut innan pipettering. Se till att inte suga bit upp i pipetten. Utför vätskeborttag för insatserna som är pläterade först, för att ge tillräcklig tid för skivor att lösa.
- Skiva Lagring
- Butiks slice kulturer i en 5,0% CO2-inkubator vid 37 ° C. Observera den slutliga placeringen av kulturerna i figur 1E. De enskilda skivorna vila på en odlingsplatta insatsen som har ett poröst membran för en botten, och denna insats passar inuti en petriskål fylld med en liten mängd medium; på detta sätt är de skivor som inte är nedsänkt i den meDIUM, men har tillgång till det endast genom membranet på botten av odlingsplattan insatsen.
- Eventuellt ta bort skivorna kan för studier antingen genom att ta bort odlingsplatta insatsen eller genom att skära ut en del av insatsmembran som innehåller en skiva.
- Placera de enskilda skivor på membranet filterinsatser. Med hjälp av en pasteurpipett avskurna och brand poleras för att ge en större borrning, individuellt överföra skivor till kulturinsatser.
- Underhåll
- Utbyt det medium i petriskålar på dagen efter att kulturerna. Överför odlingsplatta insatsen till en ny petriskål innehållande 1 ml färskt odlingsmedium som jämviktas i inkubatorn under minst en timme före överföring.
- Ändra mediet igen på samma sätt på den tredje dagen efter det att kulturer. På den tredje dagen, överföra kulturer att en inkubator inställd på 34 ° C. Ändra mediet två gånger i veckan (var 3-4 dagar).
- Identifiera friska kulturer. Välj friska kulturer för parade hela cellinspelningar.
NOTERA: Friska kulturer har en väldefinierad kant och ett tydligt definierat pyramidcellskiktet. Kulturer with mörker (sannolikt nekrotisk) områden närvarande eller ett vakuoliserade utseende med tillplattade kanter avvisas. Anställa dessa kriterier, vanligen två tredjedelar av slice kulturer är tillräckligt frisk för att spela in. - Utnyttja dessa kulturer inom en ganska litet fönster tid. Gör inte används vävnader som odlas i mer än två veckor sedan nervceller börjar visa något epileptiform beteende som långsamt förvärras med tiden. Den exakta övre gränsen för neuronal överlevnad är inte känt men det är möjligt att spela in från fungerande pyramidala celler så sent som 16 veckor i odling.
2. Kopplade helcells Record
- ACSF och Intracellulära Lösningar
- Bered presynaptiska elektrod lösning genom blandning av (i mM) 120 kaliumglukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP och 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Medan samma elektrod lösning används för postsynaptiska neuroner, cesium glukonat (120 mM) Används vanligtvis som den huvudsakliga saltet i den postsynaptiska elektrod plus 5 mM QX314.
OBS: Detta möjliggör stabil spänning fastspänning på positiva potentialer för att spela in postsynaptiska NMDAR medierade strömmar 8-10,13. Det hindrar också kalium-inducerad hyperexcitabilitet av det presynaptiska neuron av den interna lösningen strömmar från postsynaptiska inspelningen elektroden innan en giga ohm tätning görs. - Bered postsynaptisk elektrod lösning komponera (i mM) 120 cesium glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 NaATP och 0,3 NaGTP (pH 7,2 med CsOH; osmolaritet: 290 mOsm). Dra glasmikroelektroder vid 5-10 Mohm motstånd och fyll med filtrerad intern lösning.
- Förbered artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) komponera (i mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2.4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 glukos, pH 7,4, mättad med 95% O2, 5 % CO2. OBS: Om Ampar-medierad responses måste blockeras för undersökning av NMDAR EPSCs, omfattar 10 iM CNQX eller NBQX i ACSF.
- Bered presynaptiska elektrod lösning genom blandning av (i mM) 120 kaliumglukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP och 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Medan samma elektrod lösning används för postsynaptiska neuroner, cesium glukonat (120 mM) Används vanligtvis som den huvudsakliga saltet i den postsynaptiska elektrod plus 5 mM QX314.
- Erhåll Paired helcells Record
- För att undersöka synaptisk överföring mellan två enskilda nervceller, utse en neuron som den presynaptiska neuron och håll in strömtång för att framkalla aktionspotentialer och initiera synaptisk transmission.
- Utse den andra neuron, som den postsynaptiska neuron, och håll den i ström eller spänning klämma beroende på den information som forskaren. Skaffa detaljerad undersökning av de glutamaterga strömmar, med Ampar-medie EPSCs undersöktes vid -65 mV och NMDAR medierad EPSCs undersökts vid 30 mV 6-16 genom att hålla den postsynaptiska neuron i spänningsklämma
- Upprätta en parad inspelning. Att etablera en parad inspelning, är det presynaptiska hela cellen inspelning erhålls alltid först, vilket möjliggör multipla sekventiella postsynaptiska neuroner uppnås intill en som är synaptically connected erhålles. Om du utför synaptisk plasticitet experiment, är det särskilt viktigt att få den presynaptiska neuron först som induktion av LTP i postsynaptiska neuron måste påbörjas inom 10 min att få hela cellen inspelningar för att förhindra washout av cytoplasmiska faktorer som krävs för LTP 8,19.
- Undvik rörelse-inducerad cellförlust. En stor utmaning när du utför parade hela cell inspelningar är att undvika vibrationer och rörelse-inducerad störning av den första hela cellen inspelning samtidigt erhålla den andra inspelningen.
- Skaffa den första hela cellen inspelning och sedan flytta mikroskopet linsen 10-200 um i x-axeln så att den etablerade inspelningen ligger i utkanten av det område som syns på bildskärmen (Figur 2A).
- Höj lins mikroskopet ~ 5-10 mm samtidigt som den ACSF fortfarande håller kontakt med linsen. Montera den andra elektroden och för in den i vätskan menisken (Figur 2B
- Flytta elektroden i xy-planet tills det är direkt under ljusbanan genom objektivet men fortfarande betydligt över det etablerade inspelningen elektroden. När elektroden är synliga i mikroskop se spetsen är vid den bortre kanten på skärmen bort från den första elektroden.
- Flytta den andra elektroden i sekvens med mikroskopet fokus tills båda elektroderna är i samma fokalplan. Det är viktigt att nivån på positivt tryck är tillräckligt stark för att undvika spets blockering men inte alltför stark så att den stör den första hela cellen inspelning. Detta kan översättas till det positiva trycket framkallande rörelse i 2-3 neuroner från elektroden när den först kommer in i skivan.
- Hitta en postsynaptisk partner i ett liknande fokalplan den första presynaptiska inspelning (figur 2C). Inspelningen är i allmänhet erhålla parade inspelningar mellan CA3 pyramidala nervceller andra hela cellen från 0-200 mm neuron i den första rInspelning (fig 2C, D).
OBS: Synaptic transmission mellan neuronala par är stabila över tidsperioder på upp till 3-4 timmar vid användning av dessa standard hela cell inspelningsteknik.
- Synaptic plasticitet: Once Upon få en framgångsrik synaptically ansluten pyramidcellen par (Figur 3A, B), undersöka egenskaper synaptisk transmission och plasticitet.
- LTP-induktion.
- Inducera LTP genom att para ihop presynaptiska aktionspotentialer (1 Hz) med postsynaptiska depolarisation till -10 till 0 mV för en min (fig 3C) 7-9,12-14. Aktivera ihopparningen inom 10 min av inbrott i den postsynaptiska neuronen.
OBS: LTP kan också induceras med både nervceller som hålls i strömtång genom att para ihop presynaptiska och postsynaptiska aktionspotentialer vid 1 Hz under 1 min, med postsynaptiska aktionspotentialer framkallade 10 msek efter injektion av ström till presynaptiska neuron 8
- Inducera LTP genom att para ihop presynaptiska aktionspotentialer (1 Hz) med postsynaptiska depolarisation till -10 till 0 mV för en min (fig 3C) 7-9,12-14. Aktivera ihopparningen inom 10 min av inbrott i den postsynaptiska neuronen.
- Ytterligare framkalla LTD med lågfrekvent stimulering (AKU) vid 1 Hz i kombination med en svag depolarisation av postsynaptiska neuron till -55 mV för 5-10 min (Figur 3C) 9.
- LTP-induktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synaptic anslutning är uppenbart genom att stimulera presynaptiska neuron att avfyra en aktionspotential genom att en depolariserande strömpuls (vanligtvis 20-50 pA för 20 msek) via inspelningen elektroden. Den postsynaptiska nuvarande spår undersöks sedan med avseende på närvaro av en monosynaptiska EPSC evoked snar (<5 ms) och konsekventa latenser efter toppen av den presynaptiska aktionspotentialen (figur 3A). I de flesta experiment flera postsynaptiska neuroner testas innan man kan få en synaptically ansluten par. Sammantaget ~ 1/3 av presynaptiska CA3 celler monosynaptically kopplad till den postsynaptiska CA3 cell genom aktiva synaptiska anslutningar (figur 3A), och cirka 20% av CA3-neuroner är sammanbundna med all-tysta synapsförbindelser 6,8.
Amplituden för baslinjen AMPA-receptormedierade strömmar varierar från rättegång till rättegång inom parade inspelning, och även mellan oberoende pairöda inspelningar (Figur 3B) 6,8. Genomsnittlig Ampar EPSC amplitud varierade från <10 pA till> 800 pA, och troligen beror på skillnader i antalet funktionella synapser mellan parade inspelningar. Felfrekvens har också observerats att variera kraftigt mellan parade inspelningar 6,7, från 100% Ampar EPSC felfrekvens på tysta synapser, till 0-95% felfrekvens parvis förbundna genom aktiva synapser 6,7. Inom enskilda parade inspelningar, synaptiska misslyckanden inträffade, särskilt i inspelningar med mindre Ampar EPSC amplituder. Variabiliteten i Ampar EPSC amplitud framgår av rättegången inför rätta i rådata (Figur 3B) beror sannolikt på variationer i quantal nummer frigörs från rättegång till rättegång, som sker vid andra synapser 6.
Dubbla hela cell inspelningar ger också direkt tillgång till både före och den postsynaptiska nerv cytoplasman, vilket möjliggör farmakologisk manipulation av antingen / både presynaptiska och postsynaptiska celler via registreringselektrod 6. Typiskt presynaptiska farmakologiska manipulationer är mycket snabb (inom 10 min). Detta är inte begränsat till små molekyler (t.ex., BAPTA), såsom fluorescensmärkta dextraner har åtkomst presynaptiska terminaler ≤200 xm bort från den registrerande elektroden. Därför analys liknande den som utförs vid bläckfisk jätten synapsen 25 skulle kunna utvidgas till studier av synaptiska vesikler frigör maskiner i hippocampus slice. Läget för de specifika synapser som uppmätts i de parade inspelningar inte identifierats i inspelningsprocessen. Därför proximala kontra distala platser i synapser kan inte bedömas lika lätt som lokal stimulering med extracellulära stimulerande elektroder eller fokal glutamat ansökan. Däremot kan färgämne fyllning av varje neuron under parade inspelning möjliggör morfologisk rekonstruktion av axonal hållare och potentiella synaptiska platser LTP och LTD tillförlitligt induceras vid CA3-CA3 synapser i denna kultur (figur 3C), och båda formerna av plasticitet sista för den tid hela cellinspelningar (över 2 timmar). LTP och LTD induktionsparadigm som används är identiska med de som utförs i akuta skivor och LTP och LTD uppvisar egenskaper NMDAR-beroende, associativitet och väg oberoende, och därför denna kombination av odlingssystem och parade inspelningar ger ett värdefullt modellsystem för att undersöka synaptiska plasticitet 7. Polysynaptisk hämmande händelser ofta observeras i parade inspelningar mellan CA3 pyramidal cell par (Figur 3D). Vi vill inte farmakologiskt blockera denna GABAergic hämning eftersom det ger mycket störande hyperaktivitet. Men på grund av den längre latens dessa polysynaptisk hämmande händelser, de i allmänhet inte hindra mätning av monosynaptic excitatory ström. Om polysynaptisk hämmande händelser observerades störa monosynaptic Ström, skymmer toppen av monosynaptic Ström, dessa par måste undantas från analysen. Polysynaptisk stimulerande anslutningar är också ibland observeras, men är betydligt mindre vanliga och också undantas från analysen. Sällan är en monosynaptic hämmande synaptiska ström erhålls på grund av den presynaptiska neuron är en hämmande interneuronen. Detta är lätt identifieras av bristen på boende handlingspotential bränning som svar på längre (1 sek) ström injektion. Detta är inte möjligt i postsynaptiska neuroner där den interna lösningen cesium glukonat-baserade. Men eftersom nervceller identifieras visuellt före inspelningen, i vår erfarenhet detta inträffar <1% av tiden. Intern inom organotypic hippocampus skivor är lätt identifieras visuellt av deras icke-pyramidal cellkroppen, speciellt i stratum radiatum och oriens. Därför är detta preparation möjliggör även inspelningar av Intern retande och hämmande strömmar. Dock är väldigt lite känt om de hämmande nätverk i organotypiska skivor, och om de behåller anslutning liknande den som i hjärnan är inte klart. 
Figur 1 Beredning av organotypic hippocampus slice kulturer. (A) Den hippocampus, in situ, som beskrivs av den streckade linjen. För att ta bort hippocampus, är anslutningarna till fornix avskiljas och hippocampus rullade sakta ut ur hjärnan. (B) hippocampi är placerade på scenen av skivaren ovanpå filterpapper. (C) hippocampus skivor överförs via breda borrning av en pasteurpipett för att förhindra skador. (D) Exempel på "bra" kontra "dåliga" skivor.(E) Tecknad film av skiva setup på membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2 erhålla parade hela cell inspelningar från hippocampus CA3 nervceller. Sekventiella bilder att uppnå en parad inspelning, visar optimal elektrod och neuronal positionering. (A) Efter att ha erhållit det första hela cellen inspelning mikroskopet flyttas 10-200 mm i x- axeln så att den etablerade inspelningen (pilen) ligger i utkanten av det område som syns på bildskärmen. Skala bar:. 25 m (B) För att möjliggöra utrymme för den andra elektroden, är linsen mikroskopets sedan upp ~ 5-10 mm, se till att ACSF fortfarande håller kontakt medlinsen. För att säkerställa den andra elektroden inte stöta den andra inspelningen elektroden, är den andra elektroden flyttas i x-axeln tills det är direkt under ljusbanan genom objektivet men fortfarande betydligt över det etablerade inspelnings elektroden. (C) Etablerad parade inspelning visning båda elektroderna (pilar) i samma fokalplan. Skala bar:. 25 pm (D) Kopplade inspelning från intilliggande CA3 nervceller i ett transgent djur, som visar EGFP-positiva neuroner på RHS. Skala bar:. 20 pm klicka gärna här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3 Synaptic transmission och plasticitet mellan CA3-CA3 pyramidal cellspar. (A) Exempel på påter och postsynaptiska spår från en ihopparad inspelning mellan två CA3 pyramidala nervceller. Som svar på en 20 sek strömpuls att framkalla presynaptiska aktionspotential bränning, den postsynaptiska Ampar-medierad Ström (inspelad vid -65 mV) uppträder i direkt svar på aktionspotential (B) Vänster:. Amplituden för Ampar-medierade EPSCs varierar inte bara mellan parade inspelningar, men också från rättegången till rättegång inom parade inspelning. Varje prov representerar amplituden hos EPSC uppmätt vid 0,1 Hz. I detta exempel varierar Ampar EPSC amplitud från 5 pA till> 60 pA. Höger: NMDAR EPSC amplituder mäts vid +40 mV i närvaro av 10 nM CNQX. NMDAR EPSC amplituder är vanligtvis betydligt mindre amplitud som Ampar EPSCs, men visar fortfarande betydande variabilitet. NMDAR EPSC amplitud typiskt genomsnitt mellan 10-20 pA i parade inspelningar mellan CA3 pyramidala celler, vilket gör fel lätt identifierbara (C) Vänster:. CA3 pyramidala cellspar uttrycker LTP som kvarstår för längden på den parade inspelningen. LTP är lätt uppenbar genom en ökning i amplituden hos Ampar EPSCs. Betydande rättegång till rättegång variabilitet i Ampar EPSC amplituden kvar efter induktion av LTP. Höger: Uttryck av långvarig depression (LTD) mellan CA3 pyramidala nervceller. Notera minskningen i genomsnittliga amplituden för Ampar EPSC och åtföljande minskning i rättegången till rättegång amplitud variabilitet. (D) Exempel på postsynaptiska polysynaptisk hämmande strömmar, som uppträder på en längre latens jämfört med monosynaptiska Ampar EPSC. När postsynaptiska neuron är spänning fastklämd vid -65 mV, de polysynaptisk strömmarna är synliga som en andra topp vid en latens på> 5 ms efter toppen av presynaptiska aktionspotential. Håll postsynaptiska neuron vid -30 mV bekräftar att polysynaptisk strömmen är hämmande på grund av återföring av den aktuella riktningen.es.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Tabell 1 Potentiella problem som uppstår i parade inspelningar och beredning av organotypiska slice kulturer. Detta listar vanliga potentiella problem som uppstår med parade hela cell inspelningar i organotypiska slice kulturer. Dessutom rekommenderar vi också att betydande tid krävs för att spenderas "köra" på elektrofysiologi setup för parade inspelningar, eftersom de flesta problem är relaterade till rörelsestörningar som lätt kan visualiseras och åtgärdas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit kraven för upprättande framgångsrika parade hela cell inspelningar i organotypic hippocampus slice kulturer. Kopplade inspelningar kan också utföras i flera preparat, inklusive akut skivor och dissocierade odlingssystem 26,27. Medan fokus här har varit på induktion av längre former av synaptisk plasticitet (dvs. LTP och LTD), är det viktigt att framhäva att parade hela cell inspelningar i organotypisk, akut skiva och dissocierade cellpreparat har gett viktiga insikter i quantal storlek, korta -TERM plasticitet, presynaptiska funktion, samt LTP och LTD 2,4,8,26,27.
Den stora fördelen med organotypisk slice-systemet är den ökade anslutningsmöjligheter mellan nervceller. Synaptic anslutning i den akuta slice förberedelser är låg på grund av att bryta axonal anslutningar under skiva beredning. Vår erfarenhet parade inspelningar från synaptically connected CA3 nervceller i akut skivor var möjligt bara ~ 5% av parade inspelningar som erhålls. Det vill säga att 95% av parade inspelningar var oansluten. Ett alternativ är att använda primära dissocierade hippocampus kulturer där synaptic anslutning är betydligt högre 26. Emellertid med dissocierade odlade beredningar komma frågor angående neuron identitet och huruvida deras egenskaper liknar dem hos mogna synapser i nativ vävnad. Användningen av organotypic hippocampus slice kulturer förbättrar delvis denna oro eftersom neuronala subtyper lätt med kan identifieras, och cellerna upprätthåller morfologi och anslutningsmöjligheter som liknar infödda hjärnvävnad 20. Men eftersom segment bibehålles in vitro för över en vecka, är det viktigt att notera att signifikant axonal tillväxt sker under denna tid. Den resulterande ökningen av anslutning är mycket fördelaktigt att utföra parade inspelningar som undersöker synaptisk funktion och plasticitet, men det skanoteras att studier som undersökt nätverksanslutning kanske inte passar för denna beredning.
Medan de flesta av våra parade inspelningar har gjorts på CA3-CA3 pyramidal cellspar, kan denna teknik lätt anpassas till CA3-CA1 och gyrus dentatus-CA3 parade inspelningar. Incidensen av synaptisk konnektivitet mellan gyrus dentatus och CA3 pyramidala neuroner i detta system är betydligt lägre. Dock har monosynaptic excitatoriska anslutningar mellan CA3 och CA1 i detta system rapporterats vara så hög som 76% 28.
Dessutom är ihopkopplade helcells inspelningar rutinmässigt utförs i mus hippocampus vävnad, inklusive transgena möss (fig 2D) 29-31. Tekniken kan förfinas ytterligare för att spela in synaptisk transmission och plasticitet mellan nervceller med mosaik genuttryck 30. GFP märkning av vildtyp nervceller möjliggör riktad parade hela cell inspelningar i neuroner of känd genotyp. Dessa experiment har identifierat förändringar i synaptisk anslutning mellan enskilda nervceller, inklusive hyperconnectivity eller asymmetrisk presynaptiska funktion 30,31 som kan bidra till beteendestörningar som observerats hos dessa djur.
Sammanfattningsvis parade hela cell inspelningar öka förmågan att tolka elektrofysiologiska synaptiska egenskaper och att bestämma de subcellulära mekanismer som nervceller använder för att förändra synaptisk styrka. Med denna teknik har gjort det möjligt för förutsägelser av pre-och postsynaptiska modeller av synaptisk plasticitet vara direkt testas. Dessutom har fenotypen av tysta synapser och specifika roller aktiv-zonen och PSD proteiner också beskrivits i denna beredning 6-16. Det har också gjort det möjligt för upptäckten att synapser finns i olika elektrofysiologiskt definierade stater, och att under synaptisk plasticitet synapser rör sig mellan dessa stater 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
