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Neuroscience

Organotypic hippocampal स्लाइस में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग

doi: 10.3791/51958 Published: September 28, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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ग्लूटामेट रिसेप्टर्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र synapses पर उत्तेजक synaptic प्रसारण के बहुमत मध्यस्थता. पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली की रीढ़ सिर पर स्थानीयकृत ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की दो प्रमुख उपप्रकार एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) और α-अमीनो-3-hydroxy-5 proprionic-4-methylisoxazole एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स हैं. झिल्ली क्षमता आराम से कम, AMPA रिसेप्टर्स synaptic प्रसारण के दौरान पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान के सबसे ले. हिप्पोकैम्पस में, NMDA रिसेप्टर पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में AMPA रिसेप्टर्स की संख्या में परिवर्तन ट्रिगर करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: एक "संयोग डिटेक्टर" के रूप में अभिनय द्वारा 1 अन्तर्ग्रथनी शक्ति 1 में परिवर्तन शुरू करने के लिए, NMDA रिसेप्टर synaptic तंत्र में भाग लेता है कि एक subcellular स्तर पर सीखने और स्मृति पिन लगा रहे हैं. Presynaptic ट्रांसमीटर रिलीज के साथ समानांतर में पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन की विध्रुवण के जवाब में, कैल्शियम NMDA के माध्यम से प्रवेश करती हैरिसेप्टर AMPA रिसेप्टर प्रविष्टि या हटाने 2 आरंभ करने के लिए. ये रिसेप्टर गतिशीलता अन्तर्ग्रथन plasticity आबाद: अन्तर्ग्रथनी शक्ति में कमी लंबे समय तक अवसाद 4 (लिमिटेड) है, जबकि अन्तर्ग्रथनी शक्ति में वृद्धि हुई है, लंबी अवधि potentiation 2,3 (एलटीपी) है. NMDA रिसेप्टर्स अपने प्रेरण नियंत्रित करने के लिए लगा रहे हैं, जबकि इसलिए AMPA रिसेप्टर आंदोलन, synaptic plasticity अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार माना जाता है.

Synaptic प्रसारण और plasticity अंतर्निहित सटीक तंत्र का निर्धारण आदर्श synapses के छोटे आबादी, एकल synapses का अध्ययन की आवश्यकता है. कुछ synapses अत्यधिक होने के कारण synaptic कनेक्शन के छोटे और फैलाना प्रकृति के इस बेहद मुश्किल है सबसे synaptic आबादी के लिए इस स्तर, उदाहरण के लिए, 5 आयोजित की बाह्यदलपुंज, पर अध्ययन के लिए अनुकूल हैं जबकि. दो प्रमुख इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक एकल synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए विकसित किया गया है: पहले न्यूनतम उत्तेजना है, wherएक प्रीसानेप्टिक फाइबर माना जाता है ई extracellularly को प्रेरित किया. दूसरी तकनीक synaptically जुड़े न्यूरॉन्स से दो एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग किया जाता है जहां रिकॉर्डिंग, बनती है. कम से कम उत्तेजना का एक बड़ा फायदा यह एक साथ एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग जबकि axonal पथ में एक बाह्य उत्तेजक इलेक्ट्रोड की नियुक्ति से जुड़े, प्रदर्शन करने के लिए तेजी से और अपेक्षाकृत सरल है. इस तकनीक का उपयोग करते समय प्राथमिक चिंता का विषय एक एकल कक्ष के विश्वसनीय उत्तेजना शायद ही कभी परीक्षण के बाद परीक्षण गारंटी दी जा सकती है.

पिछले पंद्रह वर्षों से हम नियमित तौर पर दो synaptically जुड़े पिरामिड न्यूरॉन्स 6-17 से पूरे सेल रिकॉर्डिंग बनती इस्तेमाल किया है. इस तकनीक का प्रमुख लाभ केवल एक प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन लगातार और मज़बूती से प्रेरित है. यह भी electrophysiological लक्षण वर्णन भी है लेकिन प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन 6,18 <के औषधीय हेरफेर न केवल अनुमति देता है/ Sup>. हालांकि, न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्टिविटी की संभावना 19 प्राप्त करने के लिए जुड़ा जोड़े मुश्किल बना, कम है. organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग synaptic संपर्क के रूप में इस बाधा विट्रो में फिर से स्थापित कर सकते हैं और इसके अलावा परिणामस्वरूप कनेक्टिविटी की प्रकृति देशी मस्तिष्क ऊतक 20 में समान है circumvents. इसके अलावा, organotypic संस्कृतियों को प्लास्टिसिटी तंत्र को सक्षम करने, एलटीपी, लिमिटेड 7-10,12-15,21 और बनती पल्स सुविधा (पीपीएफ) और अवसाद (पीपीडी) 6,22,23 सहित अल्पकालिक synaptic plasticity के अतिरिक्त रूपों व्यक्त न्यूरॉन्स के जोड़े में अध्ययन किया. यहाँ हम इस सफलतापूर्वक इन विट्रो प्रणाली में बनती रिकॉर्डिंग को प्राप्त करने में शामिल विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन. यह जानकारी आसानी से तीव्र स्लाइस और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों सहित अन्य प्रयोगात्मक सिस्टम, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Protocol

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पशु आचार विवरण:

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल ऑकलैंड और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय द्वारा स्थापित जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन करें. P7 चूहे पिल्ले तेजी से कत्ल द्वारा euthanized थे. हिप्पोकैम्पस विच्छेदन तो तुरंत नीचे के रूप में वर्णित किया जाता है.

1 Organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृति

  1. तैयारी
    1. (मस्तिष्क विदारक के लिए ही प्रयोग किया जाता) विच्छेदन मध्यम तैयार. , 5 एमएल HEPES बफर समाधान, 2 एमएल 1 एम Tris शेयर समाधान (पीएच 7.2) (0.85% NaCl में प्रत्येक की 10,000 इकाइयों,) 200 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मध्यम, 2 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान का मिश्रण है, और फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ . ठंडा विच्छेदन मध्यम में हिप्पोकैम्पस विच्छेदन बाहर ले.
    2. विच्छेदन मध्यम कूल. लगभग 1 घंटा पूर्व तरल बहुत ठंड है जब तक विच्छेदन शुरुआत करने के लिए फ्रीजर में विच्छेदन मीडिया रखें. बड़े बर्फ करोड़ की अनुमति न देंystals बनाने के लिए. जब तक आवश्यक बर्फ पर स्टोर.
    3. (हिप्पोकाम्पी के विच्छेदन के अलावा सब कुछ के लिए इस्तेमाल किया) संस्कृति के माध्यम से तैयार करें. / एल glutamine, 2 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान डब्ल्यू, हांक लवण w / 100 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मध्यम, (1x एकाग्रता, तरल) गठबंधन (0.85% में तरल, प्रत्येक की 10,000 इकाइयों, NaCl), 2.5 मिलीलीटर HEPES 1 एम बफर समाधान, 50 मिलीलीटर हांक संतुलित नमक समाधान, 50 मिलीलीटर घोड़े सीरम (परिभाषित, गर्मी निष्क्रिय), और फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ.
    4. संस्कृति व्यंजन तैयार करते हैं. 35 मिमी संस्कृति पकवान प्रति संस्कृति मीडिया के 1 मिलीग्राम, जगह और हर डिश के लिए एक झिल्ली डालने जोड़ें. एक 150 मिमी पेट्री डिश में इन व्यंजनों के सात रखो (एक 'थाली' के रूप में इसके बाद के लिए कहा गया है). बर्तन में संस्कृति के माध्यम उचित तापमान और पीएच उपलब्ध हो जाता है इतना है कि विच्छेदन शुरू होने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
  2. प्रसव के बाद 7 दिन में चूहा पिल्ले से hippocampi के विच्छेदन (P7)
    1. प्रक्रिया से पहले यूवी प्रकाश के तहत सभी विच्छेदन उपकरण पूर्व बाँझ.
    2. तेजी से कत्ल करने के बाद, एक थाली में ठंडा मध्यम में मस्तिष्क और जगह निकालें, और तब विच्छेदन के लिए सिक्त फिल्टर कागज के एक टुकड़े को हटा दें. हिप्पोकैम्पस उजागर कुंद चिकनी प्लास्टिक में लिपटे लघु spatulas का उपयोग कर दूर मध्यमस्तिष्क से प्रांतस्था छेड़ो. तोरणिका कट, और फिर धीरे से (चित्रा 1 ए) इसे बाहर फ्लिप करने के हिप्पोकैम्पस के नीचे रंग काम करते हैं.
      नोट: सफल टुकड़ा संस्कृतियों P10 अप करने के लिए पशुओं का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.
    3. दूर मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से अलग हिप्पोकैम्पस ट्रिम. एक सिक्त मुलायम तूलिका का उपयोग कर ठंडा विच्छेदन मीडिया युक्त एक नई डिश में हिप्पोकाम्पी स्थानांतरण (जैसे, सफेद सेबल # 4).
    4. इन खंखरा, meninge तरह ऊतकों यह मुश्किल हिप्पोकैम्पस अलग करने के लिए कर के रूप में, विच्छेदन के दौरान रंजित जाल के हिप्पोकैम्पस के नीचे (यानी चापलूसी की ओर) साफबाद में एक दूसरे से स्लाइस.
      नोट: वे धीरे दूर छेड़ा नहीं जा सकता है अगर जगह में इन ऊतकों छोड़ दें.
    5. हिप्पोकाम्पी को नुकसान पहुँचाए बिना जितना ज्यादा हो सके पूरे विच्छेदन प्रदर्शन.
      ध्यान दें: एक सावधान विच्छेदन के रूप में लंबे समय प्रयोगात्मक शर्तों ठंडा कर रहे हैं, के रूप में एक तेजी से एक से ज्यादा महत्वपूर्ण है. एक साथ तीन चूहों से हिप्पोकाम्पी स्लाइस. चढ़ाया स्लाइस इनक्यूबेटर में जाना जब टुकड़ा स्वास्थ्य के रूप में लंबे समय के लिए शुरू से कुल समय के रूप में प्रभावित नहीं है 30 मिनट के अधीन है.
  3. टुकड़ा करने की क्रिया
    1. Transversely एक पुस्तिका ऊतक slicer का उपयोग 400 माइक्रोन पार वर्गों में हिप्पोकाम्पी स्लाइस. टुकड़ा करने की क्रिया का आयोजन किया जाता है जिसके द्वारा विधि यह ऊतक पीढ़ी हानिकारक नहीं है और (अम्मोनियों के हॉर्न आसानी से ऊतक में संरक्षित हो जाता है यानी) आसानी से दिखाई दे लामिना वास्तुकला के साथ संगत मोटाई के स्लाइस पैदा करता है, इसलिए जब तक महत्वपूर्ण नहीं है.
    2. ऊतक के मंच पर हिप्पोकाम्पी झूठ# 2 फिल्टर पेपर की एक ट्रिपल मोटाई की चोटी पर हेलिकॉप्टर. हिप्पोकाम्पी (, बल्कि इस बात पर कटा हुआ रोटी की रोटियां की तरह, चित्रा 1 बी सभी कटौती किया गया है जब तक पूरे हिप्पोकैम्पस हेलिकॉप्टर के मंच पर छोड़ दिया जाता है यानी) व्यक्तिगत रूप से किसी भी स्लाइस को हटाने के बिना पूरी तरह कटा हुआ है.
    3. प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के बगल में रखी एक नरम तूलिका (2 सफेद सेबल #) का उपयोग कर विच्छेदन मध्यम में हिप्पोकाम्पी स्थानांतरण. धीरे हिप्पोकैम्पस और अंतर्निहित फिल्टर पेपर के बीच आसंजन को तोड़ने की ओर करने के लिए प्रत्येक हिप्पोकैम्पस धक्का. मंच से इसे लेने के लिए प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के नीचे ब्रश रोल. ठंडा विच्छेदन माध्यम की एक ही 35 मिमी पेट्री डिश में सभी हिप्पोकाम्पी रखें. मैन्युअल दक्षिणावर्त और वामावर्त गतियों बारी में पकवान आंदोलनकारी द्वारा व्यक्तिगत स्लाइस में हिप्पोकाम्पी अलग करें.
    4. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे स्लाइस निरीक्षण और स्पष्ट रूप से दिखाई सेल के पास नहीं है, छोटे क्षतिग्रस्त, या जो कर रहे हैं जो किसी भी त्यागनेशरीर परतों.
      नोट: यह अक्सर सभी स्लाइस सफलतापूर्वक इस तरीके से अपने भाई बहनों से अलग हो रहे हैं नहीं कि मामला होगा. इस मामले में, वे किनारे पर उन्हें बदल रहे हैं और ठीक संदंश के सुझावों के साथ उन्हें उकसाने के द्वारा अलग किया जा सकता है. "अच्छा" स्लाइस तो एक काटा और आग पॉलिश पाश्चर पिपेट (आंकड़े 1 सी ई) का उपयोग कर ठंडा विच्छेदन मध्यम युक्त एक और साफ पेट्री डिश को हस्तांतरित कर रहे हैं.
  4. संग्रहण
    1. झिल्ली फिल्टर आवेषण पर व्यक्तिगत स्लाइस रखें. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग काटा और आग, एक बड़ा बोर दे व्यक्तिगत रूप से संस्कृति सम्मिलित करने के लिए स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए पॉलिश.
      नोट: काटने और आग चमकाने पिपेट महत्वपूर्ण है जब बनाया बोर का आकार. बहुत छोटा है और स्लाइस आसानी झिल्ली के लिए पिपेट नहीं छोड़ेगा. बहुत बड़ी है और अतिरिक्त तरल पदार्थ टुकड़ा के साथ झिल्ली की सतह पर रखा गया है. सबसे अच्छा बोर व्यास आम तौर पर के बारे में आधा diam हैपिपेट की नली की eter. जब काटने, यह व्यास पिपेट की घटना पर उचित जगह पर काटने से चुना जा सकता है.
    2. स्लाइस स्थानांतरण
      1. पहले मध्यम साथ विंदुक भरें, और फिर छोटे चूषण बलों के साथ एक भी टुकड़ा चूसना. इस पिपेट के उद्घाटन के पास टुकड़ा रहता है और टुकड़ा जगह को डालने में बहुत ज्यादा मध्यम निष्कासन से बचाता है.
      2. एक छोटे से फांसी छोटी बूंद के लिए फार्म बल्ब पर एक मामूली दबाव लागू करें, टुकड़ा है कि छोटी बूंद में बसा है, और फिर झिल्ली को उस छोटी बूंद स्पर्श और झिल्ली पर टुकड़ा "पतन" जाने के लिए अनुमति देते हैं. आम तौर पर तीन स्लाइस प्रत्येक झिल्ली डालने पर रखा जाता है.
        नोट: द्रव छोटी बूंद भी बड़ी है, तीन स्लाइस से बूंदों झिल्ली सतह पर मर्ज करने के लिए करते हैं, और स्लाइस इस प्रकार सभी इसे और अधिक कठिन बाद में electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उन्हें अलग करने के लिए कर रही है, झिल्ली के केंद्र के लिए इकट्ठा करेंगे.
    3. द्रव removअल
      1. स्लाइस में डूबे या विच्छेदन माध्यम की एक पूल से घिरा नहीं कर रहे हैं, ताकि उस थाली में सभी स्लाइस (डालने प्रति 3 स्लाइस = प्लेट प्रति 21 स्लाइस) के लिए संस्कृति प्लेट डालने के ऊपर से किसी भी अतिरिक्त मध्यम aspirate.
      2. यह एक काटा हुआ साथ है प्रदर्शन करना है, लेकिन आग पॉलिश पाश्चर पिपेट. टुकड़ा व्यवस्थित और pipetting से पहले एक मिनट के लिए झिल्ली का पालन करने की अनुमति दें. ऊपर पिपेट में टुकड़ा चूसना नहीं ख्याल रखना. स्लाइस व्यवस्थित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए, पहली चढ़ाया जाता है कि आवेषण के लिए तरल पदार्थ को हटाने के लिए बाहर ले.
    4. स्लाइस भंडारण
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5.0% सीओ 2 इनक्यूबेटर में स्टोर टुकड़ा संस्कृतियों. चित्रा 1E में संस्कृतियों के अंतिम व्यवस्था का निरीक्षण करें. व्यक्तिगत स्लाइस एक तल के लिए एक झरझरा झिल्ली है जो एक संस्कृति थाली डालने पर आराम, और इस डालने माध्यम की एक छोटी राशि के साथ भरा एक पेट्री डिश के अंदर फिट बैठता है; इस तरह से, स्लाइस मुझ में डूबे नहीं हैंdium, लेकिन केवल संस्कृति की थाली डालने के तल पर झिल्ली के माध्यम से इसे करने के लिए उपयोग किया है.
      2. वैकल्पिक रूप से, संस्कृति थाली डालने निकाल कर या एक टुकड़ा युक्त डालने झिल्ली के एक वर्ग को काटने द्वारा मई अध्ययन के लिए या तो स्लाइस को हटा दें.
  5. रखरखाव
    1. संस्कृतियों करने के बाद दिन पेट्री डिश में मध्यम विनिमय. हस्तांतरण करने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए इनक्यूबेटर में equilibrated है कि ताजा संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त एक नया पेट्री डिश संस्कृति थाली डालने स्थानांतरण.
    2. संस्कृतियों करने के बाद तीसरे दिन एक ही तरीके से फिर से मध्यम बदलें. तीसरे दिन, 34 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन सेट करने के लिए संस्कृतियों हस्तांतरण. दो बार प्रत्येक सप्ताह (हर 3-4 दिन) मध्यम बदलें.
    3. स्वस्थ संस्कृतियों को पहचानें. बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए स्वस्थ संस्कृतियों का चयन करें.
      नोट: स्वस्थ संस्कृतियों एक अच्छी तरह से परिभाषित बढ़त और एक स्पष्ट रूप से परिभाषित पिरामिड सेल परत है. संस्कृति बुद्धिघंटे अंधेरे (संभावना परिगलित) क्षेत्रों वर्तमान या चपटी सीमाओं के साथ एक vacuolated उपस्थिति खारिज कर रहे हैं. इन मानदंडों को रोजगार, टुकड़ा संस्कृतियों का आमतौर पर दो तिहाई पर्याप्त रिकॉर्डिंग के लिए स्वस्थ हैं.
    4. समय के एक काफी छोटी सी खिड़की के भीतर इन संस्कृतियों का उपयोग. न्यूरॉन्स धीरे धीरे समय के साथ बिगड़ जाती है जो थोड़ा epileptiform व्यवहार प्रदर्शित करने के लिए शुरू के बाद से दो सप्ताह से अधिक के लिए संवर्धित कर रहे हैं कि नहीं इस्तेमाल किया ऊतकों करो. neuronal अस्तित्व का सही ऊपरी सीमा नहीं जाना जाता है लेकिन यह संस्कृति में पिरामिड कोशिकाओं के रूप में देर के रूप में 16 सप्ताह के कामकाज से रिकॉर्ड करने के लिए संभव है.

2 बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग

  1. ACSF और intracellular समाधान
    1. 120 पोटेशियम gluconate, 40 HEPES, 5 2 MgCl, 2 NaATP, और 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm परासारिता KOH के साथ पीएच 7.2) (मिमी में) के मिश्रण से प्रीसानेप्टिक इलेक्ट्रोड समाधान तैयार है. एक ही इलेक्ट्रोड समाधान पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स, सीज़ियम gluconate के लिए प्रयोग किया जाता है जबकि (120 मिमी) आम तौर पर प्रमुख पोस्टअन्तर्ग्रथनी इलेक्ट्रोड में नमक, प्लस 5 मिमी QX314 के रूप में प्रयोग किया जाता है.
      नोट: यह पोस्टअन्तर्ग्रथनी NMDAR की मध्यस्थता धाराओं 8-10,13 रिकॉर्ड करने के लिए सकारात्मक क्षमता पर स्थिर वोल्टेज clamping के लिए सक्षम बनाता है. यह भी एक Giga ओम सील किया जाता है पहले पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से बह आंतरिक समाधान द्वारा प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन की पोटेशियम प्रेरित hyperexcitability रोकता है.
    2. (मिमी में) रचना पोस्टअन्तर्ग्रथनी इलेक्ट्रोड समाधान 120 सीज़ियम gluconate, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, और (;: 290 mOsm परासारिता CsOH साथ 7.2 पीएच) 0.3 NaGTP तैयार करें. 5-10 MΩ प्रतिरोध पर कांच microelectrodes खींचो और फ़िल्टर आंतरिक समाधान के साथ भरें.
    3. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) 119 NaCl, 2.4 KCl, (मिमी में) रचना तैयार MgSO 4 1.3, 2.4 2 CaCl, 1 ना 2 HPO 4, 26.2 NaHCO 3, 95% 2 हे, 5 के साथ संतृप्त 11 ग्लूकोज, 7.4 पीएच, % सीओ 2. नोट: R Ampar की मध्यस्थता हैंesponses, NMDAR EPSCs की परीक्षा के लिए अवरुद्ध होने की जरूरत ACSF में 10 माइक्रोन CNQX या NBQX शामिल हैं.
  2. बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त
    1. दो व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के बीच synaptic प्रसारण की जांच करने के लिए, प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन के रूप में एक न्यूरॉन को नामित और कार्रवाई क्षमता को प्रेरित और synaptic प्रसारण आरंभ करने के लिए वर्तमान दबाना में पकड़.
    2. पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन के रूप में, दूसरे न्यूरॉन निर्दिष्ट, और शोधकर्ता द्वारा आवश्यक जानकारी के आधार पर वर्तमान या वोल्टेज दबाना में पकड़. वोल्टेज दबाना में पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन धारण करके एम वी 6-16 +30 पर जांच -65 एम वी पर जांच की Ampar की मध्यस्थता EPSCs और NMDAR की मध्यस्थता EPSCs साथ glutamatergic धाराओं की विस्तृत जांच प्राप्त
    3. एक बनती रिकॉर्डिंग स्थापित करना. एक बनती रिकॉर्डिंग की स्थापना करने के लिए, प्रीसानेप्टिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग हमेशा कई अनुक्रमिक पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स, सक्रिय करने के पहले प्राप्त की है connecte synaptically है कि एक तक प्राप्त किया जा करने के लिएडी प्राप्त होता है. Synaptic plasticity प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं, तो यह एलटीपी 8,19 के लिए आवश्यक cytoplasmic कारकों की वार्शआउट रोकने के लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के 10 मिनट के भीतर शुरू किया जाना चाहिए पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन में एलटीपी के शामिल होने के रूप में पहली प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
    4. आंदोलन प्रेरित सेल नुकसान से बचें. बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग करते समय एक बड़ी चुनौती कंपन और दूसरी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने whilst के पहले पूरे सेल रिकॉर्डिंग के आंदोलन प्रेरित विघटन से परहेज है.
      1. पहले पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करें और स्थापित रिकॉर्डिंग की निगरानी (2A चित्रा) पर दिखाई क्षेत्र के किनारे पर स्थित है कि इतना तो एक्स अक्ष में माइक्रोस्कोप के लेंस 10-200 माइक्रोन चाल है.
      2. ACSF अभी भी लेंस के साथ संपर्क बनाए रखता है कि सुनिश्चित करते हुए ~ 5-10 मिमी माइक्रोस्कोप के लेंस उठाएँ. दूसरे इलेक्ट्रोड माउंट और (तरल पदार्थ meniscus में चित्रा 2B गाइड
      3. यह लेंस के माध्यम से प्रकाश पथ के तहत सीधे है, लेकिन अभी भी काफी स्थापित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से ऊपर तक XY विमान में इलेक्ट्रोड ले जाएँ. इलेक्ट्रोड खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहा है एक बार, टिप दूर पहले इलेक्ट्रोड से निगरानी के दूर किनारे पर किया जाता है.
      4. दोनों इलेक्ट्रोड ही फोकल हवाई जहाज़ में हैं जब तक खुर्दबीन ध्यान देने के साथ अनुक्रम में दूसरे इलेक्ट्रोड नीचे ले जाएँ. यह पहली बार पूरे सेल रिकॉर्डिंग को बाधित करने के लिए इतनी के रूप में सकारात्मक दबाव का स्तर भी मजबूत टिप रुकावट से बचने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं बल्कि यह है कि महत्वपूर्ण है. यह यह पहला टुकड़ा में प्रवेश करती है जब इलेक्ट्रोड से 2-3 न्यूरॉन्स में आंदोलन उत्प्रेरण सकारात्मक दबाव के लिए अनुवाद.
      5. पहले presynaptic रिकॉर्डिंग (चित्रा -2) के लिए एक समान फोकल हवाई जहाज़ में एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी साथी का पता लगाएँ. रिकॉर्डिंग आम तौर पर पहले अनुसंधान के एक 0-200 मिमी न्यूरॉन से सीए 3 पिरामिड न्यूरॉन्स दूसरा पूरे सेल के बीच रिकॉर्डिंग बनती प्राप्त हैecording (आंकड़े -2 सी, डी).
        नोट: न्यूरोनल जोड़े के बीच synaptic प्रसारण अप करने के लिए 3-4 घंटे का समय अवधि में स्थिर हैं ये मानक पूरे सेल रिकॉर्डिंग तकनीकों का उपयोग करते समय.
  3. Synaptic plasticity: एक बार एक सफल synaptically से जुड़े पिरामिड सेल जोड़ी प्राप्त करने पर (आंकड़े 3 ए, बी), synaptic प्रसारण और plasticity की विशेषताओं की जांच.
    1. एलटीपी प्रेरण.
      1. 1 मिनट के लिए 0 एम वी (चित्रा -3 सी) 7-9,12-14 -10 को पोस्टअन्तर्ग्रथनी विध्रुवण साथ प्रीसानेप्टिक कार्रवाई क्षमता (1 हर्ट्ज) बाँधना द्वारा एलटीपी प्रेरित. तोड़ने में पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन के 10 मिनट के भीतर बाँधना आरंभ.
        नोट: एलटीपी भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी कार्रवाई क्षमता के साथ, 1 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज पर प्रीसानेप्टिक और पोस्टअन्तर्ग्रथनी कार्रवाई क्षमता बाँधना द्वारा वर्तमान दबाना में आयोजित दोनों न्यूरॉन्स के साथ प्रेरित किया जा सकता प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन 8 में वर्तमान के इंजेक्शन के बाद 10 मिसे हासिल
    2. इसके अलावा 5-10 मिनट (चित्रा -3 सी) 9 के लिए -55 एम वी पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन की एक मामूली विध्रुवण के साथ संयुक्त 1 हर्ट्ज पर कम आवृत्ति उत्तेजना (LFS) लिमिटेड द्वारा प्रेरित.

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Representative Results

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Synaptic संपर्क रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक depolarizing वर्तमान नाड़ी (20 मिसे के लिए आम तौर पर 20-50 PA) से गुजर रहा एक कार्रवाई संभावित आग को presynaptic न्यूरॉन उत्तेजक से स्पष्ट है. पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान ट्रेस तो प्रीसानेप्टिक कार्रवाई संभावित (चित्रा 3) के शिखर के बाद कम (<5 मिसे) और लगातार सुप्तावस्था में पैदा की एक monosynaptic EPSC की उपस्थिति के लिए जांच की है. एक synaptically से जुड़े जोड़ी प्राप्त किया जा सकता से पहले सबसे प्रयोगों में कई पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स जांच की जाती है. कुल मिलाकर, प्रीसानेप्टिक सीए 3 कोशिकाओं की ~ 1/3 monosynaptically सक्रिय synaptic कनेक्शन (चित्रा 3A) द्वारा पोस्टअन्तर्ग्रथनी सीए 3 सेल करने के लिए मिलकर कर रहे हैं, और सीए 3 न्यूरॉन्स की लगभग 20% सब चुप synaptic कनेक्शन 6,8 से जुड़े हुए हैं.

आधारभूत AMPA रिसेप्टर मध्यस्थता धाराओं के आयाम स्वतंत्र पै के बीच भी एक बनती रिकॉर्डिंग के भीतर परीक्षण से परीक्षण करने चर रहा है, औरलाल रिकॉर्डिंग (3B चित्रा) 6,8. औसत Ampar EPSC आयाम 800 पीए <को 10 पीए> से लेकर, और संभावना बनती रिकॉर्डिंग के बीच कार्यात्मक synapses की संख्या में अंतर से पैदा होती है. असफलता की दर भी सक्रिय synapses 6,7 से जुड़े जोड़े में 0-95% असफलता की दर को, चुप synapses में 100% Ampar EPSC असफलता की दर से लेकर बनती रिकॉर्डिंग 6,7 के बीच काफी भिन्न करने के लिए मनाया गया है. व्यक्तिगत बनती रिकॉर्डिंग के भीतर, synaptic विफलताओं खासकर छोटे Ampar EPSC आयाम के साथ रिकॉर्डिंग में हुई. अन्य synapses 6 पर होता है के रूप में Ampar EPSC आयाम में परिवर्तनशीलता, परीक्षण से होने के कारण परीक्षण के लिए परीक्षण से जारी quantal संख्या में अस्थिरता के लिए (चित्रा 3 बी) की संभावना है कच्चे डेटा में परीक्षण करने के लिए स्पष्ट है.

दोहरी पूरे सेल रिकॉर्डिंग भी औषधीय manipulat सक्षम करने, पूर्व और postsynaptic न्यूरोनल कोशिका द्रव्य दोनों के लिए सीधी पहुँच प्रदानरिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड 6 के माध्यम से या तो / presynaptic और postsynaptic कोशिकाओं दोनों के आयन. आमतौर पर, प्रीसानेप्टिक औषधीय जोड़तोड़ (10 मिनट के भीतर) बहुत तेजी से कर रहे हैं. इस रूप में fluorescently लेबल dextrans रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से ≤200 माइक्रोन दूर प्रीसानेप्टिक टर्मिनल का उपयोग कर सकते हैं, छोटे अणु (जैसे, BAPTA) तक सीमित नहीं है. इसलिए विद्रूप विशाल synapse 25 में प्रदर्शन किया है कि इसी तरह के विश्लेषण हिप्पोकैम्पस टुकड़ा में synaptic पुटिका रिहाई मशीनरी की पढ़ाई के लिए बढ़ाया जा सकता है. बनती रिकॉर्डिंग में मापा विशिष्ट synapses के स्थिति रिकॉर्डिंग प्रक्रिया में पहचान नहीं कर रहे हैं. इसलिए synapses के बाहर साइटों बनाम समीपस्थ कोशिकी उत्तेजक इलेक्ट्रोड या फोकल ग्लूटामेट आवेदन के साथ स्थानीय उत्तेजना के रूप में के रूप में आसानी से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता. हालांकि, बनती रिकॉर्डिंग के दौरान एक न्यूरॉन की डाई भरने axonal arbors और संभावित synaptic साइट्स रूपात्मक पुनर्निर्माण सक्षम कर सकते हैं

एलटीपी और लि मज़बूती से इस संस्कृति प्रणाली (चित्रा -3 सी) में सीए 3-सीए 3 synapses में प्रेरित किया, और (एचआर पर 2) पूरे सेल रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए plasticity के दोनों रूपों पिछले रहे हैं. उपयोग एलटीपी और लि प्रेरण लद तीव्र स्लाइस और एलटीपी और लि प्रदर्शनी NMDAR निर्भरता, सहचारिता और मार्ग स्वतंत्रता, और संस्कृति प्रणाली का इसलिए इस संयोजन के गुणों में प्रदर्शन उन लोगों के लिए समान हैं और बनती रिकॉर्डिंग synaptic जांच करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली प्रदान करता है प्लास्टिसिटी 7.

Polysynaptic निरोधात्मक घटनाओं अक्सर सीए 3 पिरामिड सेल जोड़े (चित्रा 3 डी) के बीच रखा रिकॉर्डिंग में मनाया जाता है. इस अत्यधिक विघटनकारी सक्रियता का उत्पादन के रूप में हम औषधीय इस GABAergic निषेध ब्लॉक नहीं है. हालांकि, इन polysynaptic निरोधात्मक घटनाओं की लंबी विलंबता के कारण, वे आम तौर पर monosynaptic excitato की माप को रोकने नहीं हैRY वर्तमान. Polysynaptic निरोधात्मक घटनाओं monosynaptic वर्तमान के शिखर obscuring, monosynaptic वर्तमान के साथ हस्तक्षेप करने के लिए मनाया गया, तो ये जोड़े विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. Polysynaptic उत्तेजक कनेक्शन भी कभी कभी मनाया, लेकिन काफी कम आम हैं और भी विश्लेषण से बाहर रखा गया हैं. शायद ही कभी, एक monosynaptic निरोधात्मक synaptic वर्तमान प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन को एक निरोधात्मक interneuron जा रहा है की वजह से प्राप्त किया जाता है. यह आसानी से लंबे समय तक (1 सेकंड) वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में कार्रवाई संभावित फायरिंग के आवास की कमी से पहचाना जाता है. यह आंतरिक समाधान सीज़ियम gluconate आधारित है जिसमें पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स में संभव नहीं है. न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग करने के लिए नेत्रहीन पूर्व पहचान कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि हमारे अनुभव में इस <समय के 1% होता है. Organotypic hippocampal स्लाइस के भीतर interneurons आसानी से विशेष रूप से परत radiatum और oriens में, उनके गैर पिरामिड सेल शरीर से नेत्रहीन पहचान कर रहे हैं. इसलिए इस जनसंपर्कeparation भी interneuron उत्तेजक और निरोधात्मक धाराओं के रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है. हालांकि, बहुत कम organotypic स्लाइस में निरोधात्मक नेटवर्क के बारे में जाना जाता है, और वे मस्तिष्क में है कि इसी तरह कनेक्टिविटी बनाए रखने के लिए कि क्या स्पष्ट नहीं है.

चित्रा 1
Organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों की संख्या 1 तैयारी. (ए) बिंदीदार रेखा द्वारा उल्लिखित बगल में हिप्पोकैम्पस,. हिप्पोकैम्पस को दूर करने के लिए, तोरणिका को कनेक्शन विच्छेद कर रहे हैं और हिप्पोकैम्पस धीरे मस्तिष्क के बाहर गिर गयी है. (बी) hippocampi फिल्टर पेपर के शीर्ष पर slicer के मंच पर स्थान दिया जाता है. (सी) hippocampal स्लाइस विस्तृत माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं नुकसान को रोकने के लिए एक पाश्चर विंदुक के बोर. 'अच्छा' बनाम 'बुरा' स्लाइस (डी) उदाहरण.(ई) कार्टून झिल्ली पर टुकड़ा सेटअप की. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 हिप्पोकैम्पस सीए 3 न्यूरॉन्स से पूरे सेल रिकॉर्डिंग बनती प्राप्त करने. इष्टतम इलेक्ट्रोड और neuronal स्थिति दिखा, एक बनती रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की अनुक्रमिक छवियों. (ए) खुर्दबीन रिकॉर्डिंग पहले पूरे सेल प्राप्त करने के बाद एक्स में 10-200 मिमी ले जाया जाता है धुरी कि इतनी स्थापित रिकॉर्डिंग (तीर) के मॉनिटर पर दिखाई क्षेत्र के किनारे पर स्थित है. स्केल बार:. 25 माइक्रोन (बी) के दूसरे इलेक्ट्रोड के लिए कमरे में सक्षम करने के लिए, माइक्रोस्कोप के लेंस तो ACSF अब भी साथ संपर्क बनाए रखता है यह सुनिश्चित करना कि ~ 5-10 मिमी उठाया हैलेंस. यह लेंस के माध्यम से प्रकाश पथ के तहत सीधे है, लेकिन अभी भी काफी स्थापित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से ऊपर तक अन्य रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टक्कर नहीं करता दूसरा इलेक्ट्रोड सुनिश्चित करने के लिए, दूसरा इलेक्ट्रोड एक्स अक्ष में ले जाया जाता है. (सी) की स्थापना की बनती रिकॉर्डिंग दिखा एक ही फोकल हवाई जहाज़ में दोनों इलेक्ट्रोड (तीर). स्केल बार:. आरएचएस पर EGFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स दिखा एक ट्रांसजेनिक पशु में आसन्न सीए 3 न्यूरॉन्स से 25 माइक्रोन (डी) बनती रिकॉर्डिंग. स्केल बार:. 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
सीए 3-सीए 3 पिरामिड सेल जोड़े के बीच 3 चित्र synaptic प्रसारण और plasticity. (ए) पी के उदाहरणदो सीए 3 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच एक बनती रिकॉर्डिंग से फिर से और पोस्टअन्तर्ग्रथनी निशान. एक 20 सेकंड वर्तमान नाड़ी के जवाब में प्रीसानेप्टिक कार्रवाई संभावित फायरिंग प्रेरित करने के लिए, पोस्टअन्तर्ग्रथनी Ampar की मध्यस्थता वर्तमान (-65 एम वी पर दर्ज की) कार्रवाई क्षमता के लिए सीधी प्रतिक्रिया में होता है (बी) वाम:. Ampar की मध्यस्थता EPSCs के आयाम बदलता है न केवल बनती रिकॉर्डिंग के बीच, लेकिन यह भी परीक्षण करने के लिए परीक्षण एक बनती रिकॉर्डिंग के भीतर से. प्रत्येक परीक्षण 0.1 हर्ट्ज पर मापा EPSC के आयाम का प्रतिनिधित्व करता है. इस उदाहरण में, Ampar EPSC आयाम> 60 फिलीस्तीनी अथॉरिटी को 5 फिलीस्तीनी अथॉरिटी से उतार चढ़ाव होता रहता. अधिकार: NMDAR EPSC आयाम 10 माइक्रोन CNQX की उपस्थिति में 40 एम वी पर मापा जाता है. NMDAR EPSC आयाम आमतौर पर Ampar EPSCs, लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता दिखा कि आयाम में काफी छोटे हैं. सीए 3 पिरामिड कोशिकाओं के बीच बनती रिकॉर्डिंग में 10-20 पीए के बीच आम तौर पर मूविंग NMDAR EPSC आयाम, विफलताओं आसानी से पहचाने बनाने (सी) वाम:. सीए 3 पिरामिड सेल जोड़े बनती रिकॉर्डिंग की लंबाई के लिए बनी रहती है कि एलटीपी व्यक्त करते हैं. एलटीपी Ampar EPSCs के आयाम में वृद्धि के द्वारा आसानी से स्पष्ट है. Ampar EPSC आयाम में महत्वपूर्ण परीक्षण करने वाली परीक्षण परिवर्तनशीलता एलटीपी के शामिल होने के बाद बनी हुई है. अधिकार: सीए 3 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच लंबे समय तक अवसाद (लिमिटेड) की अभिव्यक्ति. Ampar EPSC की औसत आयाम और परीक्षण आयाम परिवर्तनशीलता के लिए परीक्षण में सहवर्ती कमी में कमी नोट. Monosynaptic Ampar EPSC की तुलना में एक लंबे समय तक विलंबता पर होते हैं जो पोस्टअन्तर्ग्रथनी polysynaptic निरोधात्मक धाराओं, (डी) उदाहरण. पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन -65 एम वी पर clamped वोल्टेज होता है, polysynaptic धाराओं प्रीसानेप्टिक संभावित कार्रवाई के शिखर के बाद> 5 मिसे के एक विलंबता पर एक दूसरे शिखर के रूप में दिखाई दे रहे हैं. -30 एम वी पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन होल्डिंग polysynaptic वर्तमान वजह से वर्तमान दिशा के पलटने के लिए निरोधात्मक है कि पुष्टि करता है.es.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1
टेबल बनती रिकॉर्डिंग और organotypic टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी में उत्पन्न होने वाली 1. संभावित समस्याओं. इस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ होने वाले आम संभावित समस्याओं को सूचीबद्ध करता है. इसके अलावा, हम भी सबसे अधिक समस्याओं को आसानी से कल्पना और सुधारा जा सकता है कि आंदोलन अवरोधों से जुड़े हुए हैं के रूप में महत्वपूर्ण समय, बनती रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप 'ड्राइविंग' खर्च किए जाने की आवश्यकता है कि सलाह.

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Discussion

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यहाँ हम organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में सफल बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग की स्थापना के लिए आवश्यकताओं का वर्णन किया है. बनती रिकॉर्डिंग भी तीव्र स्लाइस और अलग संस्कृति प्रणालियों 26,27 सहित कई तैयारियों में किया जा सकता है. फोकस यहां synaptic plasticity (अर्थात् एलटीपी और लिमिटेड) की लंबी रूपों के शामिल होने पर किया गया है, वहीं, इसे कम organotypic, तीव्र टुकड़ा में है कि बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है और सेल तैयारी quantal आकार में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है अलग अवधि plasticity, presynaptic समारोह है, साथ ही एलटीपी और लि 2,4,8,26,27.

organotypic टुकड़ा प्रणाली का प्रमुख लाभ न्यूरॉन्स के बीच वृद्धि की कनेक्टिविटी है. तीव्र टुकड़ा तैयारी में synaptic कनेक्टिविटी की वजह टुकड़ा तैयारी के दौरान axonal कनेक्शन के विच्छेद करने के लिए कम है. हमारे अनुभव में, synaptically connecte से रिकॉर्डिंग बनतीतीव्र स्लाइस में डी सीए 3 न्यूरॉन्स प्राप्त बनती रिकॉर्डिंग का ही ~ 5% में संभव हो गया. यही बनती रिकॉर्डिंग का 95% असंबद्ध थे, है. एक वैकल्पिक synaptic कनेक्टिविटी 26 काफी अधिक है जहां प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों अलग प्रयोग है. हालांकि, अलग सुसंस्कृत तैयारी के साथ न्यूरॉन पहचान के बारे में सवालों के जवाब में आ गए और उनके गुणों देशी ऊतक में परिपक्व synapses के उन लोगों के लिए समान हैं या नहीं. न्यूरोनल उपप्रकार आसानी से पहचान सकते हैं क्योंकि organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग आंशिक रूप से इन चिंताओं ameliorates, और कोशिकाओं देशी मस्तिष्क ऊतक 20 के समान हैं कि आकृति विज्ञान और कनेक्टिविटी बनाए रखें. स्लाइस एक सप्ताह से अधिक के लिए इन विट्रो में रखा जाता है लेकिन, जैसा कि यह महत्वपूर्ण axonal विकास इस समय के दौरान होता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. कनेक्टिविटी में जिसके परिणामस्वरूप वृद्धि हालांकि यह चाहिए, synaptic समारोह और plasticity की जांच कि बनती रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए काफी फायदेमंद हैनेटवर्क कनेक्टिविटी की जांच के अध्ययन इस तैयारी के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि ध्यान दिया जाना.

हमारे बनती रिकॉर्डिंग के बहुमत सीए 3-सीए 3 पिरामिड सेल जोड़े पर आयोजित किया गया है, जबकि, इस तकनीक को आसानी से रिकॉर्डिंग बनती सीए 3-सीए 1 और दांतेदार गाइरस-सीए 3 के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रणाली में दांतेदार गाइरस और सीए 3 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्टिविटी की घटनाओं में काफी कम है. हालांकि, इस प्रणाली में सीए 3 और सीए 1 के बीच monosynaptic उत्तेजक कनेक्शन 76% 28 के रूप में उच्च होने की सूचना दी गई है.

इसके अलावा, बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग नियमित ट्रांसजेनिक चूहों (चित्रा 2 डी) 29-31 सहित, माउस हिप्पोकैम्पस ऊतक में प्रदर्शन कर रहे हैं. तकनीक आगे मोज़ेक जीन अभिव्यक्ति 30 के साथ न्यूरॉन्स के बीच synaptic प्रसारण और plasticity रिकॉर्ड करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है. जंगली प्रकार न्यूरॉन्स की GFP लेबलिंग ओ न्यूरॉन्स में पूरे सेल रिकॉर्डिंग बनती लक्षित सक्षम बनाता हैएफ जीनोटाइप में जाना जाता है. इन प्रयोगों से इन पशुओं में मनाया व्यवहार घाटे में योगदान कर सकते हैं कि hyperconnectivity या विषम presynaptic समारोह 30,31 सहित व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के बीच synaptic संपर्क में परिवर्तन की पहचान की है.

संक्षेप में, बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग electrophysiological synaptic गुणों की व्याख्या करने और न्यूरॉन्स synaptic ताकत को बदलने के लिए रोजगार कि subcellular तंत्र का निर्धारण करने की क्षमता में वृद्धि. इस तकनीक का उपयोग synaptic plasticity के पूर्व और postsynaptic मॉडल की भविष्यवाणियों सीधे परीक्षण किया जा करने की अनुमति दी गई है. इसके अलावा, चुप synapses, और सक्रिय क्षेत्र और PSD प्रोटीन की विशिष्ट भूमिकाओं के phenotype भी इस तैयारी 6-16 में वर्णित किया गया है. यह भी synapses अलग electrophysiologically परिभाषित राज्यों में मौजूद है कि खोज सक्षम है, और synaptic plasticity synapses इन राज्यों 9,17 के बीच ले जाने के दौरान कि.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium Stable motorized micromanipulators 
Penicillin-Streptomycin solution  Shallow tissue bath
HEPES buffer solution DIC camera
1 M Tris stock solution Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution Computer
Horse Serum  Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas Upright microscope
Soft paintbrush Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper Electrode puller
#2 Filter paper Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood

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References

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Organotypic hippocampal स्लाइस में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग
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Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).More

Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).

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