器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
グルタミン酸受容体は、中枢神経系のシナプスにおける興奮性シナプス伝達の大部分を媒介する。シナプス後膜のスパインヘッドであるN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）に局在するイオンチャネル型グルタミン酸受容体の二つの主要なサブタイプおよびα-アミノ-3 – ヒドロキシ-5 – メチルイソオキサゾール-4 – プロピオン酸（AMPA）受容体。静止膜電位では、AMPA受容体がシナプス伝達の間にシナプス後電流の大部分を運ぶ。海馬では、NMDA受容体はシナプス後膜におけるAMPA受容体の数の変化を誘発するのに重要な役割を果たしている：「一致検出器」として作用することにより1は 、シナプス強度1の変更を開始するために、NMDA受容体はシナプスのメカニズムに関与してそれは細胞下レベルで学習と記憶を下支えすると考えられている。シナプス前伝達物質放出と平行してシナプス後ニューロンの脱分極に応答して、カルシウムは、NMDAを経由して入る受容体はAMPA受容体の挿入または取り外し2を開始する。これらの受容体の動態は、シナプス可塑性の基礎となる：シナプス強度の低下が長期抑圧4（LTD）である、シナプス強度の増大が、長期増強の2,3（LTP）である。 NMDA受容体は、その誘導を制御すると考えられているつつAMPA受容体の移動は、シナプス可塑性の発現に関与すると考えられている。
シナプス伝達と可塑性の基礎となる正確なメカニズムを決定することは、シナプスの小集団、理想的には単一のシナプスを研究する必要があります。いくつかのシナプスが、このレベルでの研究のために非常に適しているが、 例えば 、5開催の萼は、ほとんどのシナプス集団についてこれは、シナプス結合の小と拡散自然に非常に困難である。二つの主要な電気生理学的技術は、単一のシナプス結合を調べるために開発されている：最初は最小限の刺激であり、機種では電子1シナプス前繊維は細胞外刺激さと推定される。第2の技術は、シナプス接続ニューロンからの2同時ホールセル記録が行われ録音を、ペアになっています。最小限の刺激の主な利点は、それが同時にシナプス後ニューロンから記録しながら軸索管への細胞外刺激電極の配置を含む、実行するために迅速で比較的簡単であることである。この技術を用いて第一の関心事は、単セルの信頼性のある刺激はめったに裁判後に裁判を保証しないことができるということである。
過去15年間で私たちは、日常的に2シナプス接続錐体ニューロン6-17からペアリングホールセル記録を使用している。この技術の主な利点は、1つのシナプス前ニューロンが一貫して確実に刺激されることである。また、電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロン6,18の薬理学的操作だけではないことができます</ SUP>。しかし、ニューロン間のシナプス接続の確率は、19を得るために接続されたペアが困難に低い。シナプス接続は、インビトロ、得られた接続性、さらに自然に再確立できるように、器官型脳切片培養物の使用は、この障害を回避するネイティブ脳組織20と同様である。さらに、器官培養物は可塑性にメカニズムを有効にする、対になったパルスの円滑化（PPF）とうつ病（PPD）6,22,23を含む短期シナプス可塑性のLTP、LTD 7-10,12-15,21と追加のフォームを表現ニューロンのペアで研究される。ここでは、正常にこのin vitro系でのペアの録音を達成に関わる詳細な方法論について説明します。この情報は、容易に急性スライスおよび他の脳領域を含む他の実験系に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、器官型海馬スライス培養物において成功対の全細胞記録を確立するための要件を記載している。対になった記録はまた、急性スライスおよび解離培養系26,27を含む複数の調製物中で行うことができる。ここでの焦点は、シナプス可塑性（すなわちLTP及びLTD）の長い形の誘導になって、それが器官全体細胞記録をペアにことを強調することが重要であり、急性スライスと細胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
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