Introduction
Los receptores de glutamato median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora en las sinapsis del sistema nervioso central. Los dos subtipos principales de receptores ionotrópicos de glutamato localizados en la cabeza de la columna vertebral de la membrana postsináptica son N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico ácido (AMPA). En reposo los potenciales de membrana, receptores AMPA llevan la mayor parte de la corriente postsináptica durante la transmisión sináptica. En el hipocampo, el receptor de NMDA juega un papel clave en el desencadenamiento de los cambios en el número de receptores AMPA en la membrana postsináptica: al actuar como un "detector de coincidencia" 1 para iniciar los cambios en la fuerza sináptica 1, el receptor de NMDA participa en los mecanismos sinápticos que se cree que subyacen en el aprendizaje y la memoria en un nivel subcelular. En respuesta a la despolarización de la neurona postsináptica en paralelo con la liberación del transmisor presináptica, el calcio entra a través de la NMDAreceptor para iniciar la inserción del receptor de AMPA o extracción 2. Estas dinámicas de los receptores de la plasticidad subyacen sinapsis: un aumento en la fuerza sináptica es la potenciación a 2,3 largo plazo (LTP), mientras que una disminución en la fuerza sináptica es la depresión a largo plazo 4 (LTD). Por lo tanto el movimiento del receptor de AMPA se piensa que es responsable de la expresión de la plasticidad sináptica, mientras que los receptores de NMDA se cree que el control de su inducción.
La determinación de los mecanismos precisos que subyacen a la transmisión sináptica y la plasticidad requiere el estudio de pequeñas poblaciones de sinapsis, idealmente sinapsis individuales. Mientras que algunas sinapsis son muy adecuados para el estudio a este nivel, por ejemplo, el cáliz de Held 5, para las poblaciones más sinápticas esto es extremadamente difícil debido a la naturaleza pequeña y difusa de las conexiones sinápticas. Dos de las principales técnicas de electrofisiología se han desarrollado para examinar las conexiones sinápticas individuales: El primero es la estimulación mínima, where una fibra presináptica se presume estimulada extracelularmente. La segunda técnica se combina grabaciones, donde se lleva a cabo dos grabaciones simultáneas de células enteras de neuronas conectadas sinápticamente. Una ventaja importante de estimulación mínima es que es rápida y relativamente fácil de realizar, que implica la colocación de un electrodo de estimulación extracelular en el tracto axonal mientras que simultáneamente se grabe de una neurona postsináptica. La principal preocupación cuando se utiliza esta técnica es que la estimulación fiable de una única célula rara vez se puede garantizar prueba tras prueba.
Durante los últimos quince años hemos utilizados habitualmente se combina grabaciones de células enteras a partir de dos neuronas piramidales conectados sinápticamente 6-17. La principal ventaja de esta técnica es que sólo una neurona presináptica es estimulada consistente y fiable. También permite no sólo la caracterización electrofisiológica, sino también la manipulación farmacológica de la neurona presináptica 6,18 </ Sup>. Sin embargo, la probabilidad de conectividad sináptica entre neuronas es baja, por lo que los pares conectados difícil obtener 19. El uso de cultivos de cortes de cerebro organotípicos evita este obstáculo como la conectividad sináptica puede volver a establecer in vitro y, además, la naturaleza de la conectividad resultante es similar a la que en el tejido cerebral nativa 20. Además, cultivos organotípicos expresan LTP, LTD 7-10,12-15,21 y otras formas de plasticidad sináptica a corto plazo, incluyendo la facilitación a dos pulsos (PPF) y la depresión (PPD) 6,22,23, lo que permite a los mecanismos de plasticidad ser estudiado en pares de neuronas. Aquí se describe la metodología detallada que participan en la consecución con éxito grabaciones pareadas en este sistema in vitro. Esta información puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas experimentales, incluso en lonchas agudas y otras regiones del cerebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de Ética Animal:
Los protocolos descritos en este manuscrito siguen las directrices de cuidado animal establecidas por la Universidad de Auckland y la Universidad de Stanford. P7 crías de rata fueron sacrificados por decapitación rápida. La disección del hipocampo se realiza entonces inmediatamente como se describe a continuación.
1. organotípicos del hipocampo rebanada Cultura
- Preparación
- Preparar el medio de disección (sólo se utiliza para diseccionar el cerebro). Combinar 200 ml de medio esencial mínimo, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 5 ml de solución tampón de HEPES, 2 ml de solución madre 1 M Tris (pH 7,2), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras . Llevar a cabo la disección del hipocampo en medio de disección en frío de hielo.
- Enfriar el medio de disección. Coloque la disección de los medios de comunicación en el congelador aproximadamente 1 hora antes de comenzar la disección hasta que el líquido es muy frío. No permita que gran cr hieloystals para formar. Almacenar en hielo hasta que se necesite.
- Preparar el medio de cultivo (utilizado para todo, excepto la disección de hipocampos). Combinar 100 ml de medio mínimo esencial, (concentración 1x, líquido) w / sales de Hank, W / L-glutamina, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampón solución, 50 ml solución salina equilibrada de Hank, 50 ml de suero de caballo (definida, inactivado por calor), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras.
- Preparar las placas de cultivo. Coloque 1 ml de medios de cultivo por 35 mm placa de cultivo, y añadir un inserto de membrana para cada plato. Ponga hasta siete de estos platos en una placa de Petri de 150 mm (en lo sucesivo como un 'plato'). Colocar la placa en una incubadora de CO 2 durante al menos una hora antes de la disección comienza de modo que el medio de cultivo en los platos alcanza la temperatura y pH adecuado.
- La disección de los hipocampos de rata cachorros en Postnatal Día 7 (P7)
- Pre-esterilizar todas las herramientas de disección con luz UV antes del procedimiento.
- Después de la decapitación rápida, retire el cerebro y el lugar en un medio frío en un plato, y luego retírela con un trozo de papel de filtro humedecido para la disección. Se burlan de la corteza lejos del cerebro medio usando espátulas lisas contundentes recubiertos de plástico en miniatura, dejando al descubierto el hipocampo. Corte el fondo de saco, y luego trabajar suavemente la espátula debajo del hipocampo para voltear hacia fuera (Figura 1A).
NOTA: El éxito de cultivos de corte se pueden preparar usando animales hasta P10. - Recorte el hipocampo aislado lejos del resto del cerebro. Transferir el hipocampo en un nuevo plato que contiene los medios de comunicación disección fría utilizando un pincel suave humedecido (por ejemplo, blanco sable # 4).
- Limpiar la parte inferior (es decir, el lado más plano) del hipocampo de plexo coroideo durante la disección, ya que estos tejidos esponjosos,-meninge como hacen difícil separar del hipocamporebanadas entre sí más adelante.
NOTA: Deje estos tejidos en su lugar si no pueden ser objeto de burlas de distancia con cuidado. - Realizar toda la disección tan rápidamente como sea posible sin dañar los hipocampos.
NOTA: Una cuidadosa disección es más importante que uno rápido, siempre y cuando se enfrían las condiciones experimentales. Cortar los hipocampos de tres ratas simultáneamente. La salud rebanada no se ve afectada, siempre y cuando el tiempo total desde el principio hasta cuando las rebanadas chapados entran en la incubadora tiene menos de 30 min.
- Rebanar
- Cortar los hipocampos transversalmente en 400 micras secciones transversales utilizando una máquina de cortar el tejido manual. El método por el cual se lleva a cabo el corte no es importante, siempre y cuando no sea demasiado perjudicial para el tejido y produce rebanadas de espesor consistente con la arquitectura laminar fácilmente visible (es decir, el cuerno de Ammon se ve fácilmente que se conserva en el tejido).
- Lie los hipocampos en el escenario del tejidochopper en la parte superior de un espesor triple # 2 de papel de filtro. El hipocampo se cortó por completo sin necesidad de retirar algún segmento individual (es decir, todo el hipocampo se deja en la escena del helicóptero hasta que se hayan hecho todos los cortes, sino como hogazas de pan de molde en este punto; Figura 1B).
- Transfiera los hipocampos en medio de disección utilizando un pincel suave relajado al lado de cada hipocampo (blanco sable # 2). Empujar suavemente cada hipocampo a un lado para romper la adhesión entre el hipocampo y el papel de filtro subyacente. Enrolle el cepillo debajo de cada hipocampo a recogerlo fuera del escenario. Coloque todos los hipocampos en la misma 35 mm placa de Petri de medio de disección fría. Separar los hipocampos en rodajas individuales agitando manualmente el plato en la alternancia de movimientos en sentido horario y antihorario.
- Inspeccione las rebanadas con un microscopio de disección y descartar cualquier que se daña, pequeña, o que no poseen células claramente visiblecapas del cuerpo.
NOTA: A menudo será el caso de que no todas las rebanadas se separan con éxito de sus hermanos de esta manera. En este caso, se pueden separar girándolas en el borde y empujando con la punta de unas pinzas finas. "Buenas" cortes se transfieren a otra placa de Petri que contenía medio limpio disección fría utilizando una cortada y pulida al fuego pipeta Pasteur (figuras 1C-E).
- Almacenamiento
- Coloque las rebanadas individuales en los elementos filtrantes de membrana. Con una pipeta Pasteur cortada y pulida al fuego para dar una luz mayor, transferir individualmente rebanadas a los insertos de cultivo.
NOTA: El tamaño del agujero creado al cortar y es importante la pipeta-pulido fuego. Demasiado pequeño y las rodajas no dejarán fácilmente la pipeta para la membrana. Fluido demasiado grande y el exceso se coloca en la superficie de la membrana junto con la rebanada. La mejor diámetro del agujero es típicamente de alrededor de la mitad del diámetrotro del cilindro de la pipeta. Al cortar, este diámetro puede ser elegido por el corte en el lugar adecuado sobre el cono de la pipeta. - Rodaja de transferencia
- Llenar la pipeta con el medio, y luego aspirar una sola rebanada con pequeñas fuerzas de succión. Esto mantiene la porción cerca de la abertura de la pipeta y evita demasiado expulsión medio en el inserto para colocar la rebanada.
- Aplique una ligera presión en el bulbo para formar una pequeña gota colgante, permita que el segmento se asiente en esa gota, y luego toque que gota a la membrana y dejar que el sector "caída" sobre la membrana. Generalmente tres rebanadas se colocan en cada inserción de membrana.
NOTA: Si la gotita de líquido es demasiado grande, las gotitas procedentes de los tres rodajas tienden a fusionarse en la superficie de la membrana, y las rodajas se reúnen para así todo el centro de la membrana, lo que hace más difícil separarlas para registro electrofisiológico más tarde.
- Remov Fluidal
- Aspirar el medio sobrante de la parte superior del inserto de placa de cultivo para todos los sectores en que la placa (3 rebanadas por inserto = 21 rebanadas por placa), de modo que las rebanadas no están sumergidos en o rodeados por una piscina de medio de disección.
- Realice esto es con un sin cortar, pero pipeta Pasteur pulida al fuego. Deje que la rebanada se asiente y se adhieren a la membrana por un minuto antes de pipetear. Tenga cuidado de no aspirar la rebanada en la pipeta. Llevar a cabo la eliminación de líquido para las inserciones que se sembraron en primer lugar, para que haya tiempo suficiente para que las rodajas se asienten.
- Rodaja de almacenamiento
- Cultivos de corte tienda en un incubador de CO2 un 5,0% a 37 ° C. Observar la disposición final de las culturas en la figura 1E. Las rodajas individuales descansan sobre un inserto de placa de cultivo que tiene una membrana porosa por un fondo, y este inserto encaja dentro de una placa de Petri llena con una pequeña cantidad de medio; por este medio, las rebanadas no están inmersos en el meDium, pero tiene acceso a ella sólo a través de la membrana en la parte inferior del inserto de placa de cultivo.
- Opcionalmente, puede eliminar las rodajas de estudio, ya sea mediante la eliminación de la inserción de placa de cultivo o mediante la reducción de una sección de la membrana inserto que contiene una rebanada.
- Coloque las rebanadas individuales en los elementos filtrantes de membrana. Con una pipeta Pasteur cortada y pulida al fuego para dar una luz mayor, transferir individualmente rebanadas a los insertos de cultivo.
- Mantenimiento
- Cambie el medio de las placas de Petri el día después de hacer las culturas. Transferir el inserto de placa de cultivo a una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de medio de cultivo fresco que se equilibra en la incubadora durante al menos una hora antes de la transferencia.
- Cambiar el medio de nuevo de la misma manera en el tercer día después de hacer las culturas. En el tercer día, transferir las culturas a una incubadora a 34 ° C. Cambie el medio dos veces por semana (cada 3-4 días).
- Identificar los cultivos sanos. Seleccione culturas saludables para grabaciones de células enteras pareadas.
NOTA: Los cultivos sanos tienen un borde bien definido y una capa de células piramidales claramente definido. Culturas ingenioh oscuro (probablemente necrótico) áreas o presente un aspecto vacuolado con bordes aplanados son rechazadas. El empleo de estos criterios, generalmente de dos tercios de los cultivos de cortes son lo suficientemente saludable para la grabación. - Utilizar estas culturas dentro de una bastante pequeña ventana de tiempo. No tejidos utilizados que son cultivadas durante más de dos semanas desde que las neuronas comienzan a mostrar un comportamiento ligeramente epileptiforme que empeora lentamente con el tiempo. El límite superior exacto de la supervivencia neuronal no se conoce, pero es posible grabar de funcionamiento de las células piramidales tan tarde como 16 semanas en cultivo.
2. pareadas grabaciones de células enteras
- ACSF y Soluciones intracelulares
- Preparar la solución de electrodo presináptica mezclando (en mM) 120 gluconato de potasio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolaridad: 290 mOsm). Mientras que la misma solución de electrodo se utiliza para las neuronas postsinápticas, gluconato de cesio (120 mM) Se utiliza típicamente como la sal importante en el electrodo postsináptica, además de 5 mM QX314.
NOTA: Esto permite fijación de tensión estable a potenciales positivos para registrar corrientes NMDAR mediada postsinápticos 8-10,13. También evita que la hiperexcitabilidad inducida por potasio de la neurona presináptica por la solución interna que fluye desde el electrodo de registro postsináptica antes de que se hizo un sello ohmios giga. - Preparar la solución de electrodo postsináptica componer (en mM) 120 gluconato de cesio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con CsOH; osmolaridad: 290 mOsm). Tire de microelectrodos de vidrio a 5-10 resistencia mW y rellenar con solución interna filtrada.
- Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) componer (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3, 11 de glucosa, pH 7,4, saturado con 95% O 2, 5 % de CO 2. NOTA: Si r AMPAR mediadaesponses necesitan ser bloqueado para el examen de NMDAR EPSCs, incluyen 10 M CNQX o NBQX en la ACSF.
- Preparar la solución de electrodo presináptica mezclando (en mM) 120 gluconato de potasio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolaridad: 290 mOsm). Mientras que la misma solución de electrodo se utiliza para las neuronas postsinápticas, gluconato de cesio (120 mM) Se utiliza típicamente como la sal importante en el electrodo postsináptica, además de 5 mM QX314.
- Obtener emparejado enteros Grabaciones celulares
- Para examinar la transmisión sináptica entre dos neuronas individuales, designar una neurona como la neurona presináptica y mantenga en la pinza de corriente para inducir potenciales de acción e iniciar la transmisión sináptica.
- Designe la segunda neurona, como la neurona postsináptica, y mantenerlo en su pinza de corriente o voltaje en función de la información requerida por el investigador. Obtener un examen detallado de las corrientes glutamatérgicas, con EPSCs mediados por AMPAR examinados a -65 mV y EPSCs NMDAR mediada examinados en 30 mV 6-16 mediante la celebración de la neurona postsináptica de fijación de voltaje
- Establecer una grabación emparejado. Establecer una grabación emparejado, la grabación de células completas presináptica se obtiene siempre primero, lo que permite múltiples neuronas postsinápticas secuenciales para obtener hasta uno que es sinápticamente connectese obtiene d. Si la realización de experimentos de plasticidad sináptica, es especialmente crítica para obtener la neurona presináptica primera como la inducción de LTP en la neurona postsináptica debe iniciarse dentro de los 10 min de la obtención de células enteras las grabaciones para evitar el lavado de los factores citoplásmicos necesarios para LTP 8,19.
- Evitar la pérdida de células inducida por el movimiento-. Un reto importante al realizar grabaciones de células enteras pareadas es evitar la vibración y la interrupción inducida movimiento-de la primera grabación de células enteras, mientras que la obtención de la segunda grabación.
- Obtener la primera grabación de células enteras y luego mover el microscopio lente 10-200 micras en el eje x de manera que el registro establecido se encuentra en el borde de la zona visible en el monitor (Figura 2A).
- Elevar la lente del microscopio ~ 5-10 mm garantizando al mismo tiempo que la ACSF todavía mantiene contacto con la lente. Monte el segundo electrodo y guiar en el menisco de líquido (Figura 2B
- Mueva el electrodo en el plano xy hasta que esté directamente debajo de la trayectoria de la luz a través del objetivo, pero todavía muy por encima del electrodo de registro establecido. Una vez que el electrodo es visible bajo el microscopio, asegurar la punta está en el borde más alejado de la monitor lejos del primer electrodo.
- Mueva el segundo electrodo hacia abajo en secuencia con el foco del microscopio hasta que ambos electrodos están en el mismo plano focal. Es importante que el nivel de presión positiva es lo suficientemente fuerte para evitar el bloqueo punta pero no demasiado fuerte como para perturbar la primera grabación de células enteras. Esto se traduce en la presión positiva inducir movimiento en 2-3 neuronas del electrodo cuando entra primero la rebanada.
- Localizar un socio postsináptica en un plano focal similar a la primera grabación presináptica (Figura 2C). Grabación generalmente obtener grabaciones entre las neuronas piramidales CA3 el segundo conjunto de células emparejado de una neurona 0-200 mm de la primera rrabación (Figuras 2C, D).
NOTA: La transmisión sináptica entre pares neuronales son estables durante periodos de tiempo de hasta 3-4 horas cuando se utilizan estas técnicas de grabación de células enteras normalizadas.
- La plasticidad sináptica: Érase obtener un éxito par de células piramidales conectado sinápticamente-3A (figuras, B), examinar las características de la transmisión sináptica y la plasticidad.
- Inducción de LTP.
- Inducir LTP por el emparejamiento de los potenciales de acción presináptica (1 Hz) con la despolarización postsináptica a -10 a 0 mV durante 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicia la vinculación dentro de 10 minutos de rodaje a la neurona postsináptica.
NOTA: LTP también puede ser inducida con ambas neuronas celebradas en pinza de corriente por el emparejamiento de los potenciales de acción presinápticos y postsinápticos a 1 Hz durante 1 min, con potenciales de acción postsináptica suscitó 10 mseg después de la inyección de la corriente en la neurona presináptica 8
- Inducir LTP por el emparejamiento de los potenciales de acción presináptica (1 Hz) con la despolarización postsináptica a -10 a 0 mV durante 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicia la vinculación dentro de 10 minutos de rodaje a la neurona postsináptica.
- Además inducir LTD por estimulación de baja frecuencia (EPA) a 1 Hz en combinación con una ligera despolarización de la neurona postsináptica a -55 mV durante 5-10 minutos (Figura 3 C) 9.
- Inducción de LTP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Conectividad sináptica es evidente mediante la estimulación de la neurona presináptica para disparar un potencial de acción por el que pasa un impulso de corriente de despolarización (típicamente 20-50 Pa durante 20 mseg) a través del electrodo de registro. La traza actual postsináptica se examina para detectar la presencia de un EPSC monosináptico evocado en corto (<5 ms) y latencias consistentes después del pico del potencial de acción presináptica (Figura 3A). En la mayoría de los experimentos múltiples neuronas postsinápticas se prueban antes de poder obtener un par sinápticamente conectados. En general, ~ 1/3 de las células CA3 presinápticos están acoplados monosinápticamente a la célula postsináptica CA3 por conexiones sinápticas activos (Figura 3A), y aproximadamente el 20% de las neuronas CA3 están conectados por conexiones sinápticas todo-silenciosas 6,8.
La amplitud de los receptores AMPA corrientes mediadas de referencia es variable de un ensayo a otro dentro de una grabación emparejado, y también entre pai independientegrabaciones rojos (Figura 3B) 6,8. Promedio amplitud AMPAR EPSC varió de <10 pA a> 800 pA, y probablemente se debe a diferencias en el número de sinapsis funcionales entre grabaciones pareadas. Las tasas de fracaso se han observado también a variar significativamente entre grabaciones pareadas 6,7, que van desde 100% AMPAR EPSC tasas de fracaso en las sinapsis silenciosas, a 0-95% las tasas de fracaso en parejas conectadas por sinapsis activas 6,7. Dentro de grabaciones pareadas individuales, hubo fallos sinápticas, especialmente en grabaciones con pequeñas amplitudes AMPAR EPSC. La variabilidad en AMPAR EPSC amplitud es evidente a partir de un ensayo a otro en los datos sin procesar (Figura 3B) es probablemente debido a la fluctuación de número cuántico liberado de un ensayo a otro, como ocurre en otras sinapsis 6.
Duales grabaciones de células enteras también proporcionan acceso directo tanto a la pre y el citoplasma neuronal postsináptica, permitiendo manipulat farmacológicaion de cualquiera / ambas las células presinápticas y postsinápticas a través de los electrodos de registro 6. Típicamente, las manipulaciones farmacológicas presinápticos son muy rápido (dentro de 10 min). Esto no se limita a las pequeñas moléculas (por ejemplo, BAPTA), como dextranos marcados con fluorescencia pueden acceder a las terminales presinápticas ≤200 m de distancia desde el electrodo de registro. Por lo tanto, un análisis similar al realizado en la sinapsis del calamar gigante 25 podría extenderse a estudios de maquinaria liberación de vesículas sinápticas en la corte de hipocampo. La posición de las sinapsis específicas medidas en las grabaciones emparejados no se identifican en el proceso de grabación. Por lo tanto el proximal frente a sitios distantes de las sinapsis no se puede evaluar con tanta facilidad como la estimulación local con electrodos estimulantes extracelulares o aplicación glutamato focal. Sin embargo, el llenado de colorante de cada neurona durante la grabación emparejado puede permitir la reconstrucción morfológica de cenadores axonal y sitios potenciales sinápticos LTP y LTD se inducen de forma fiable en las sinapsis CA3-CA3 en este sistema de cultivo (Figura 3C), y ambas formas de plasticidad pasado para la duración de las grabaciones de células enteras (más de 2 h). Los paradigmas de LTP y LTD de inducción utilizados son idénticos a los realizados en rodajas agudas y LTP y LTD exhiben las propiedades de NMDAR-dependencia, la asociatividad y la independencia vía, y por lo tanto esta combinación de sistema de cultivo y grabaciones pareadas proporciona un sistema modelo valioso para examinar sináptica plasticidad 7. Eventos inhibitorios polisinápticos se observan con frecuencia en grabaciones pareadas entre pares de células piramidales CA3 (Figura 3D). Nosotros no bloqueamos farmacológicamente esta inhibición GABAérgica como este produce hiperactividad altamente perjudicial. Sin embargo, debido a la latencia más larga de estos eventos inhibitorios polisinápticos, por lo general no impiden la medición de la excitato monosinápticoactual ry. Si se observan los eventos inhibitorios polisinápticos para interferir con la corriente monosináptico, oscureciendo el pico de la corriente monosináptico, estas parejas tienen que ser excluidos del análisis. Conexiones excitadoras polisinápticos también a veces se observan, pero son mucho menos comunes y también se excluyen del análisis. En raras ocasiones, una corriente sináptica inhibitoria monosináptico se obtiene debido a la neurona presináptica ser un interneuronas inhibitorias. Esto se identifica fácilmente por la falta de alojamiento de disparo del potencial de acción en respuesta a más largo (1 seg) de inyección de corriente. Esto no es posible en las neuronas postsinápticas en los que se basa gluconato de cesio-la solución interna. Sin embargo, como las neuronas se identifican visualmente antes de la grabación, en nuestra experiencia esto ocurre <1% del tiempo. Interneuronas dentro de cortes de hipocampo organotípicos son fácilmente identificados visualmente por su cuerpo celular no piramidal, especialmente en el estrato radiado y oriens. Por lo tanto este preparation también permite grabaciones de excitatorio interneuron y las corrientes inhibitorias. Sin embargo, se sabe muy poco acerca de las redes inhibitorias en rebanadas organotípicos, y si mantienen la conectividad similar a la que en el cerebro no está claro. 
Figura 1 Preparación de cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. (A) El hipocampo, in situ, se indica por la línea de puntos. Para eliminar el hipocampo, las conexiones con el fondo de saco se cortan y el hipocampo rodar suavemente fuera del cerebro. (B) hipocampos se colocan en la etapa de la máquina de cortar en la parte superior de papel de filtro. (C) rebanadas de hipocampo se transfieren a través de la amplia orificio de una pipeta Pasteur para evitar daños. (D) Los ejemplos de "buenas" contra "malos" rebanadas.(E) de la historieta de configuración rebanada en membranas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2. Obtención emparejado grabaciones de células enteras de las neuronas CA3 del hipocampo. Imágenes secuenciales de la consecución de una grabación emparejado, mostrando electrodo óptima y posicionamiento neuronal. (A) Después de obtener la primera célula completa la grabación del microscopio se mueve 10-200 mm en las direcciones x eje, de manera que la grabación establecido (flecha) se encuentra en el borde de la zona visible en el monitor. Barra de escala:. 25 micras (B) Para habilitar espacio para el segundo electrodo, la lente del microscopio se eleva entonces ~ 5-10 mm, asegurando que la ACSF todavía mantiene contacto conla lente. Para asegurar el segundo electrodo no golpee el otro electrodo de registro, el segundo electrodo se mueve en el eje x hasta que esté directamente debajo de la trayectoria de la luz a través de la lente, pero todavía muy por encima del electrodo de registro establecido. (C) Establecido representa la grabación emparejado ambos electrodos (flechas) en el mismo plano focal. Barra de escala:. 25 micras (D) de grabación de emparejado de las neuronas CA3 adyacentes en un animal transgénico, que muestran las neuronas EGFP-positivas en el lado derecho. Barra de escala:. 20 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3 La transmisión sináptica y la plasticidad entre pares de células piramidales CA3-CA3. (A) Ejemplo de pre y trazas postsináptica de una grabación emparejado entre dos neuronas piramidales CA3. En respuesta a un impulso de corriente 20 seg para inducir la acción presináptica potencial de disparo, la postsináptica mediada por AMPAR actual (grabado a -65 mV) se produce en respuesta directa a la potencial de acción (B) Izquierda:. La amplitud de EPSCs mediados por AMPAR varía no sólo entre las grabaciones pareadas, sino también de ensayo-a juicio dentro de una grabación emparejado. Cada ensayo representa la amplitud de la EPSC medido a 0,1 Hz. En este ejemplo, AMPAR EPSC amplitud fluctúa entre 5 pA a> 60 pA. Derecha: amplitudes NMDAR EPSC midieron a 40 mV en presencia de 10 mM CNQX. Amplitudes NMDAR EPSC suelen ser significativamente más pequeño en amplitud que AMPAR EPSCs, pero aún muestran una variabilidad significativa. NMDAR EPSC amplitud general un promedio entre 10 a 20 pA en grabaciones pareadas entre las células piramidales CA3, haciendo fallos fácilmente identificables (C) A la izquierda:. Pares de células piramidales CA3 expresar LTP que persiste durante la duración de la grabación emparejado. LTP es fácilmente evidente por un aumento en la amplitud de AMPAR EPSCs. Significativa variabilidad al juicio-a juicio de la amplitud AMPAR EPSC queda después de la inducción de la LTP. Derecha: Expresión de depresión a largo plazo (LTD) entre las neuronas piramidales CA3. Tenga en cuenta la disminución de la amplitud media de la AMPAR EPSC y disminución concomitante en el ensayo a la variabilidad de amplitud juicio. (D) Ejemplo de corrientes postsinápticas inhibitorias polisinápticos, que se producen en una latencia más larga en comparación con el monosináptico AMPAR EPSC. Cuando la neurona postsináptica es sujetado tensión en -65 mV, las corrientes polisinápticos son visibles como un segundo pico a una latencia de> 5 mseg después del pico del potencial de acción presináptica. Sosteniendo la neurona postsináptica a -30 mV confirma que la corriente polisináptico es inhibitorio debido a la inversión de la dirección de la corriente.es.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Tabla 1. problemas potenciales que surgen en las grabaciones pareadas y preparación de cultivos de cortes organotípicos. Esta lista de posibles problemas comunes que se producen con las grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes organotípicos. Además, también aconsejamos que se requiere un tiempo considerable para ser gastado 'conducir' la configuración de electrofisiología para grabaciones pareadas, como la mayoría de los problemas están relacionados con trastornos de movimiento que pueden ser fácilmente visualizados y rectificados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí hemos descrito los requisitos para establecer exitosas grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. Grabaciones apareadas también se pueden realizar en múltiples preparaciones, incluso en lonchas agudas y sistemas de cultivo disociadas 26,27. Mientras que el enfoque aquí ha estado en la inducción de formas de plasticidad sináptica (LTP y LTD saber) más largos, es importante destacar que las grabaciones de células enteras pareadas en organotípico, rebanada aguda y disociada preparaciones celulares han aportado importantes conocimientos sobre el tamaño cuántico, corto plasticidad -TERM, la función presináptica, así como LTP y LTD 2,4,8,26,27.
La principal ventaja del sistema de cortes organotípicos es el aumento de la conectividad entre las neuronas. Conectividad sináptica en la preparación rebanada aguda es la baja debido a la ruptura de las conexiones axonales durante la preparación de la rebanada. En nuestra experiencia, a la par de grabaciones connecte sinápticamenteneuronas CA3 d en rodajas agudas eran posibles en sólo ~ 5% de las grabaciones de pares obtenidos. Es decir, el 95% de las grabaciones fueron emparejados sin conectar. Una alternativa es utilizar primaria disociarse cultivos de hipocampo donde la conectividad sináptica es significativamente más alto 26. Sin embargo, con las preparaciones de cultivos disociados llegado preguntas acerca de la identidad de las neuronas y si sus propiedades son similares a las de las sinapsis maduros en el tejido nativo. El uso de cultivos de cortes de hipocampo organotípicos aminora parcialmente estas preocupaciones porque los subtipos neuronales pueden fácilmente por identificado, y las células mantienen la morfología y la conectividad que son similares al tejido cerebral nativa 20. Sin embargo, como rodajas se mantienen in vitro durante más de una semana, es importante tener en cuenta que el crecimiento axonal significativa se produce durante este tiempo. El consiguiente aumento de la conectividad es muy beneficioso para la realización de grabaciones pareadas que examinan la función sináptica y la plasticidad, sin embargo lo que deberíacabe señalar que los estudios que analizan la conectividad de red pueden no ser adecuados para esta preparación.
Mientras que la mayoría de nuestras grabaciones pareadas se han realizado en los pares de células piramidales CA3-CA3, esta técnica se puede adaptar fácilmente a CA3-CA1 y giro dentado-CA3 emparejado grabaciones. La incidencia de la conectividad sináptica entre gyrus y piramidales CA3 neuronas dentados en este sistema es considerablemente menor. Sin embargo, se ha informado de conexiones excitatorias monosinápticos entre CA3 y CA1 en este sistema para ser tan alta como 76% 28.
Además, las grabaciones de células enteras emparejados se realizan rutinariamente en el tejido del hipocampo de ratón, incluyendo ratones transgénicos (Figura 2D) 29-31. La técnica se puede refinar aún más para grabar la transmisión sináptica y la plasticidad entre las neuronas con la expresión de genes mosaico 30. GFP etiquetado de las neuronas de tipo salvaje permite dirigidos emparejado grabaciones de células enteras en las neuronas of conocido genotipo. Estos experimentos han identificado alteraciones en la conectividad sináptica entre neuronas individuales, incluyendo la hiperconectividad o función presináptica 30,31 asimétrica que puede contribuir a déficits de comportamiento observados en estos animales.
En resumen, las grabaciones de células enteras pareadas aumentan la capacidad de interpretar propiedades electrofisiológicas sinápticas y para determinar los mecanismos subcelulares que las neuronas emplean para cambiar la fuerza sináptica. Usando esta técnica ha permitido a las predicciones de los modelos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica a ensayar directamente. Además, el fenotipo de las sinapsis silenciosas, y las funciones específicas de zona activa-y proteínas PSD también se han descrito en esta preparación 6-16. También ha permitido el descubrimiento de que existen sinapsis en diferentes estados definidos electrofisiológicamente-, y que durante las sinapsis de plasticidad sináptica se mueven entre estos estados 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
