Introduction
Glutamat-reseptorer medierer flertallet av eksitatorisk synaptisk transmisjon i sentralnervesystemet synapser. De to hoved subtyper av ionotrofiske glutamatreseptorer lokalisert på ryggraden hodet av postsynaptiske membranen er N-metyl-D-aspartat (NMDA) og α-amino-3-hydroksy-5-metylisoksazol-4-propionsyre (AMPA) reseptorer. Hos hvilende membranpotensialer, AMPA-reseptorer bære mesteparten av den postsynaptiske strøm under synaptisk transmisjon. I hippocampus, spiller NMDA-reseptor-en nøkkelrolle i å utløse endringer i antallet AMPA-reseptorer i den postsynaptiske membranen: ved å fungere som en "tilfeldighet detektor" 1 for å igangsette endringer i synaptisk styrke 1, er med NMDA-reseptoren i de synaptiske mekanismer som er tenkt å understøtte læring og hukommelse på et subcellulære nivå. I respons til depolarisering av den postsynaptiske nevroner parallelt med presynaptisk transmitterfrigjørelse, går kalsium via NMDAreseptor for å initiere AMPA reseptor innsetting eller fjerning to. Disse reseptor-dynamikken til grunn synapse plastisitet: en økning av synaptisk styrke er langvarig potense 2,3 (LTP), mens en reduksjon i synaptisk styrke er langvarig depresjon 4 (LTD). Derfor AMPA-reseptor-bevegelsen er antatt å være ansvarlig for synaptisk plastisitet ekspresjon, mens NMDA-reseptorer er antatt å kontrollere dens induksjon.
Bestemme de nøyaktige mekanismene bak synaptisk transmisjon og plastisitet krever studere små bestander av synapser, helst enkelt synapser. Mens noen synapser er godt egna for studier på dette nivået, for eksempel, den Calyx av Held 5, for de fleste synaptiske populasjoner dette er ekstremt vanskelig på grunn av den lille og diffuse natur synaptiske forbindelser. To store elektrofysiologiske teknikker har blitt utviklet for å undersøke enkelt synaptiske forbindelser: Den første er minimal stimulering, der hvore en presynaptisk fiber antas stimulert ekstracellulært. Den andre teknikken er paret innspillinger, der to samtidige hele celle opptak fra postsynaptisk koblet nevroner er utført. En stor fordel med minimal stimulering er at den er rask og relativt enkel å utføre, som omfatter plassering av et ekstracellulært stimulerende elektrode inn i den aksonal kanalen samtidig opptak fra en postsynaptiske nevroner. Den primære bekymring når du bruker denne teknikken er at pålitelig stimulering av en enkelt celle kan sjelden være garantert rettssak etter rettssak.
I løpet av de siste femten årene har vi rutinemessig brukt paret hel-celle opptak fra to postsynaptisk koblet pyramidale nevroner 6-17. Den store fordelen med denne teknikken er at bare én presynaptiske nevron er konsekvent og pålitelig stimulert. Den gjør det også ikke bare elektrofysiologisk karakterisering men også farmakologisk manipulasjon av den presynaptiske nervecellen 6,18 </ Sup>. Imidlertid er sannsynligheten for synaptisk forbindelse mellom nevroner lav, noe som gjør koblede par vanskelig å få 19. Bruken av organotypic hjernen skive kulturer omgår dette hinderet som synaptiske tilkobling kan reetablere in vitro og dessuten arten av den resulterende tilkobling er lik som i native hjernevev 20. I tillegg organotypic kulturer uttrykke LTP, LTD 7-10,12-15,21 og andre former for kortsiktig synaptisk plastisitet inkludert parvise puls tilrettelegging (PPF) og depresjon (PPD) 6,22,23, slik plastisitet mekanismer for å studeres i parene av neuroner. Her beskriver vi detaljert metodikk involvert i vellykket oppnå sammenkoblede opptak i denne in vitro system. Denne informasjonen kan lett tilpasses andre eksperimentelle systemer, inkludert akutte skiver og andre hjerneregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreetikk erklæringen:
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet følge retningslinjene dyr omsorg etablert ved The University of Auckland og Stanford University. P7 rotteunger ble avlivet av rask halshogging. Hippocampal disseksjon blir deretter umiddelbart utført som beskrevet nedenfor.
1. organotypic Hippocampus Slice Kultur
- Forberedelse
- Forbered disseksjon Medium (brukes kun for å dissekere hjernen). Kombiner 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml penicillin-streptomycin-løsning (10.000 enheter av hvert, i 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-buffer-løsning, 2 ml 1 M Tris-stamløsning (pH 7,2), og filtersteriliser med 0,22 mikrometer filter . Gjennomføre hippocampus disseksjon i iskaldt disseksjon medium.
- Avkjøl disseksjon medium. Plasser disseksjon mediet i fryseren omtrent 1 time før start av disseksjon inntil væsken er svært kaldt. Ikke la stor is crystals å danne. Oppbevar på is inntil nødvendig.
- Forbered kulturmedium (brukes for alt unntatt disseksjon av hippocampi). Kombiner 100 ml Minimum Essential Medium, (1x konsentrasjons, væske) w / Hanks salter, w / L-glutamin, 2 ml penicillin-streptomycin løsning (flytende, 10.000 enheter av hver, i 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES en M buffer løsning, 50 ml Hanks balanserte saltoppløsning, 50 ml hesteserum (definert, varme-inaktivert), og filtersteriliser med 0,22 mikrometer filter.
- Forbered kultur retter. Plasser en ml kulturmedier per 35 mm kultur fatet, og legge en membran innsats til hver rett. Sett opp til syv av disse retter inn i en 150 mm petriskål (henvist til heretter som en "plate"). Sett platen i en CO2-inkubator i minst en time før disseksjon begynner slik at kulturmediet i rettene oppnår den riktige temperatur og pH.
- Disseksjon av Hippocampi fra rotteunger på Postnatal Dag 7 (P7)
- Pre-sterilisere alle disseksjon verktøy under UV lys før prosedyren.
- Etter en rask halshogging, fjerne hjernen og sted inn kjølt medium i en skål, og deretter ta det til et stykke fuktet filterpapir for disseksjon. Erte cortex bort fra midthjernen med butte glatte plastbelagt miniatyr spatler, utsette hippocampus. Skjær fornix, og deretter jobbe forsiktig slikkepotten under hippocampus å snu den ut (figur 1A).
MERK: Vellykket skive kulturer kan være forberedt på å bruke dyr opp til P10. - Reduser det isolerte hippocampus bort fra resten av hjernen. Overfør hippocampi inn i en ny rett som inneholder kjølt disseksjon medier med en fuktet myk pensel (f.eks hvit sable # 4).
- Rengjør undersiden (dvs. flatere side) av hippocampus i årehinne plexus under disseksjon, da disse svampete, meninge lignende vev gjør det vanskelig å skille hippocampusskiver fra hverandre senere.
MERK: La disse vev på plass hvis de ikke kan bli ertet vekk forsiktig. - Utfør hele disseksjon så raskt som mulig uten å skade hippocampi.
MERK: En forsiktig disseksjon er viktigere enn en fast en, så lenge som de eksperimentelle betingelsene er kjølt. Skjær hippocampi fra tre rotter samtidig. Den skive helse er ikke påvirket så lenge som den totale tid fra start til når de pletterte skiver går inn i kuvøsen er under 30 min.
- Slicing
- Skjær hippocampi tvers inn i 400 mikrometer tverrsnitt ved hjelp av en manuell vev slicer. Metoden hvorved kutting utføres, er ikke viktig, så lenge som det ikke er altfor skadelige for vevet, og gir stykker av jevn tykkelse med lett synlige laminær arkitektur (dvs. ammon Horn enkelt sett å bli bevart i vevet).
- Ligger de hippocampi på scenen av vevethakkeren på toppen av en trippel tykkelse av # 2 filterpapir. Hippocampi er skiver helt uten å fjerne skiver individuelt (dvs. hele hippocampus er igjen på scenen av helikopteret før alle kutt er gjort, snarere som brød av skiver brød på dette punktet; Figur 1B).
- Overfør hippocampi inn disseksjon medium med en myk pensel lagt ved siden av hver hippocampus (hvit sable # 2). Skyv hver hippocampus til siden for å bryte adhesjon mellom hippocampus og den underliggende filterpapir. Rull børsten under hver hippocampus å plukke den opp av scenen. Plasser alle hippocampi inn i den samme 35 mm petriskål av kjølt disseksjon medium. Separer hippocampi i individuelle skiver ved manuelt propaganderte fatet i vekslende med og mot klokken bevegelser.
- Inspiser skiver under et dissekere mikroskop og kast noen som er skadet, små, eller som ikke har klart synlig cellekropps lag.
MERK: Det vil ofte være slik at ikke alle skivene er vellykket skilt fra sine søsken på denne måten. I dette tilfellet, kan de separeres ved å slå dem på kant og prodding dem med tuppen av fin pinsett. "God" stykker blir deretter overført til en annen ren petriskål inneholdende kjølt disseksjon medium med en avskåret og ild-polert Pasteur pipette (figurene 1C-E).
- Lagring
- Plasser de enkelte skiver på membranen filterinnsatser. Ved hjelp av en Pasteur-pipette avskåret og brann polert for å gi en større diameter, hver for å overføre skiver til kulturen innsatser.
MERK: Størrelsen av boringen laget ved skjæring og ild-polering pipetten er viktig. For liten og skivene vil ikke lett forlater pipetten for membranen. For stor og overskytende væske er plassert på overflaten av membranen sammen med stykket. Den beste innvendig diameter som typisk er omtrent halvparten av diaeter av fatet av pipetten. Når du kutter, kan dette diameter velges ved å kutte på riktig sted på taper av pipetten. - Slice Transfer
- Fyll pipetten med medium først, og deretter suge opp et enkelt stykke med små sugekreftene. Dette holder skive i nærheten av åpningen av pipetten og forhindrer for mye medium utstøting inn i innsatsen for å plassere stykket.
- Påfør et lett trykk på pæren å danne en liten hengende dråpe, la stykket å bosette seg i at dråpe, og deretter på at dråpen til membranen og la stykket "fall" på membranen. Vanligvis er tre skiver er anbrakt på hver membraninnsats.
MERK: Hvis væskedråpen er for stor, dråpene fra de tre skiver har en tendens til å flette på membranoverflaten, og skivene vil således alle samles i sentrum av membranen, noe som gjør det mer vanskelig å skille dem for elektrofysiologisk opptak senere.
- Fluid fjernelseal
- Aspirer overskytende medium fra toppen av kulturen platen innsats for alle skivene i at platen (3 stykker pr innsatsen = 21 skiver pr plate), slik at skivene ikke er neddykket i eller omgitt av en pool av disseksjon medium.
- Utføre dette på er med en uncut, men brann-polert Pasteur pipette. La skive å bosette og følge membranen i et minutt før pipettering. Pass på å ikke suge stykket opp i pipetten. Gjennomføre væske fjerning for innleggene som er belagt først, for å gi tilstrekkelig tid for de skiver å bosette seg.
- Slice Storage
- Butikken skive kulturer i en 5,0% CO 2 inkubator ved 37 ° C. Observere den endelige ordningen av kulturer i figur 1E. De enkelte skiver hviler på en kulturplate innsats som har en porøs membran for en bunn, og dette innsats passer inne i en petriskål fylt med en liten mengde av mediet; på denne måten, er skivene ikke er neddykket i megdium, men har tilgang til den bare gjennom membranen ved bunnen av kulturen platen innsatsen.
- Eventuelt fjerne skivene kan for studier enten ved å fjerne kultur plate innsats eller ved å kutte ut en del av innsatsen membran som inneholder en skive.
- Plasser de enkelte skiver på membranen filterinnsatser. Ved hjelp av en Pasteur-pipette avskåret og brann polert for å gi en større diameter, hver for å overføre skiver til kulturen innsatser.
- Vedlikehold
- Utveksler mediet i petriskåler på dagen etter at kulturene. Overfør kultur plate innsatsen til en ny petriskål inneholdende 1 ml friskt kulturmedium som er ekvilibrert i inkubatoren i minst en time før overføring.
- Skift medium på nytt på samme måte på den tredje dagen etter at kulturene. På den tredje dagen, overfører de kulturer til en inkubator innstilt på 34 ° C. Endre medium to ganger hver uke (hver 3-4 dager).
- Identifisere sunne kulturer. Velg sunne kulturer for parede hele celle innspillinger.
MERK: Sunn kulturer har en godt definert kant og en klart definert pyramidecellelaget. Kulturer viddh mørk (sannsynligvis nekrotisk) områder tilstede eller en vacuolated utseende med flate grenser er avvist. Ansette disse kriteriene, vanligvis to tredeler av skive kulturer er tilstrekkelig sunt for opptak. - Utnytte disse kulturene innenfor et ganske lite vindu av tid. MÅ IKKE brukes vev som er dyrket i mer enn to uker siden nevronene begynner å vise litt epileptiform atferd som langsomt forverres med tiden. Den eksakte øvre grense for neuronal overlevelse er ikke kjent, men det er mulig å ta opp fra fungerende pyramidale celler så sent som 16 uker i kultur.
2. Sammenkoblede helcelle Recordings
- ACSF og intracellulære Solutions
- Forbered presynaptiske elektrode løsning ved å blande (i mM) 120 glukonat kalium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP, og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Mens det samme elektrodeoppløsning brukes postsynaptiske nevroner, cesium glukonat (120 mM) Blir vanligvis brukt som hoved salt i den postsynaptiske elektrode, pluss 5 mM QX314.
MERK: Dette muliggjør stabil spenning klem på positive potensialer for å spille inn postsynaptiske NMDAR-mediert strøm 8-10,13. Det forhindrer også kalium-indusert hypereksitabilitet av den presynaptiske neuron av den interne oppløsning som strømmer fra den postsynaptiske opptaks elektrode før forsegling giga ohm er gjort. - Forbered postsynaptiske elektrode løsning komponere (i mm) 120 cesium gluconate, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med CsOH; osmolaritet: 290 mOsm). Trekk mikroelektroder av glass på 5-10 mÊ motstand og fyll med filtrert intern løsning.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) komponere (i mm) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1.3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 glukose, pH 7,4, mettet med 95% O 2, 5 % CO 2. MERK: Hvis Ampar-mediert responses må blokkeres for undersøkelse av NMDAR EPSCs, inkluderer 10 mikrometer CNQX eller NBQX i ACSF.
- Forbered presynaptiske elektrode løsning ved å blande (i mM) 120 glukonat kalium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP, og 0,3 NaGTP (pH 7,2 med KOH; osmolaritet: 290 mOsm). Mens det samme elektrodeoppløsning brukes postsynaptiske nevroner, cesium glukonat (120 mM) Blir vanligvis brukt som hoved salt i den postsynaptiske elektrode, pluss 5 mM QX314.
- Skaff parvise helcelle Recordings
- For å undersøke synaptisk overføring mellom to individuelle nerveceller, utpeke en nervecelle som den presynaptiske nervecellen og hold i strømtang for å indusere aksjonspotensialer og initiere synaptisk overføring.
- Utpeke den andre nervecellen, som den postsynaptiske nervecellen, og hold den i strøm eller spenning klemme avhengig av informasjon som kreves av forskeren. Få detaljert undersøkelse av glutamatergic strømninger, med Ampar-medierte EPSCs undersøkt ved -65 mV og NMDAR-mediert EPSCs undersøkt på 30 mV 6-16 ved å holde den postsynaptiske nevron i spenning klemme
- Etablere en sammenkoblet opptak. Å etablere en sammenkoblet opptak, er den presynaptiske hele cellen opptak alltid innhentes først, slik at flere sekvensielle postsynaptiske nevroner som skal innhentes før en som er postsynaptisk connected er oppnådd. Ved å utføre synaptisk plastisitet eksperimenter, er det spesielt viktig å oppnå den presynaptiske neuron først som induksjon av LTP i den postsynaptiske nevroner må initieres innen 10 min for å oppnå hele celleopptak for å hindre utvasking av cytoplasmiske faktorer som kreves for LTP 8,19.
- Unngå bevegelse-indusert celle tap. En stor utfordring når du utfører sammenkoblede hele celle innspillinger er å unngå vibrasjoner og bevegelse-indusert forstyrrelse av første hele cellen opptak mens skaffe det andre opptaket.
- Skaff første hele cellen opptak og deretter flytte mikroskopet objektivet 10-200 mikrometer i x-aksen slik at den etablerte opptaket ligger på kanten av området som er synlig på skjermen (Figur 2A).
- Hev linsen av mikroskopet ~ 5-10 mm og samtidig sikre at ACSF fortsatt opprettholder kontakt med objektivet. Monter annen elektrode og lede inn i fluid menisken (figur 2B
- Beveg elektroden i xy-planet til den er direkte under lysbanen gjennom linsen, men fremdeles betydelig over den etablerte opptakselektrode. Når elektroden er synlige under mikroskopet, sikre at spissen er helt til kanten av skjermen, bort fra den første elektrode.
- Beveg annen elektrode ned i sekvens med mikroskop fokus til begge elektroder er i det samme fokalplan. Det er viktig at nivået av positivt trykk er sterk nok til å unngå blokkering tuppen, men ikke for sterkt, slik som å forstyrre den første hel celle-opptak. Dette kan oversettes til den positive trykkinduserende bevegelse i 2-3 nerveceller fra elektroden når den først kommer inn i stykket.
- Finn en postsynaptisk partner på en lignende fokalplanet til den første presynaptiske opptaket (figur 2C). Innspilling er generelt få paret opptak mellom CA3 pyramidale nevroner andre hele celle fra en 0-200 mm nevron av første recording (Tall 2C, D).
MERK: Synaptic overføringen mellom nerve parene er stabil over tidsperioder på opptil 3-4 timer når du bruker disse standard helcelle opptak teknikker.
- Synaptisk plastisitet: Once Upon skaffe en vellykket postsynaptisk-tilkoblet pyramidecelle par (3A, B), undersøke egenskapene til synaptisk transmisjon og plastisitet.
- LTP induksjon.
- Fremkall LTP ved sammenkobling presynaptiske aksjonspotensialer (1 Hz) med postsynaptiske depolarisering til -10 til 0 mV for 1 min (Figur 3C) 7-9,12-14. Initiere paring innen 10 min av innbrudd på den postsynaptiske nervecellen.
MERK: LTP kan også fremkalles med både nevroner holdt i strømtang ved sammenkobling presynaptiske og postsynaptiske aksjonspotensialer ved 1 Hz i 1 min, med postsynaptiske aksjonspotensialer fremkalte 10 msek etter injeksjon av strøm inn i den presynaptiske nervecellen 8
- Fremkall LTP ved sammenkobling presynaptiske aksjonspotensialer (1 Hz) med postsynaptiske depolarisering til -10 til 0 mV for 1 min (Figur 3C) 7-9,12-14. Initiere paring innen 10 min av innbrudd på den postsynaptiske nervecellen.
- Videre indusere LTD ved lav frekvens stimulering (AKU) ved 1 Hz kombinert med en svak depolarisering av den postsynaptiske nervecelle til -55 mV for 5-10 min (Figur 3C) 9.
- LTP induksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synaptic tilkobling er tydelig ved å stimulere den presynaptiske nervecellen til brann et aksjonspotensial ved å sende en depolariserende strømpuls (vanligvis 20-50 pA for 20 ms) via innspillingen elektroden. Den postsynaptisk strøm sporing blir deretter undersøkt for tilstedeværelse av en monosynaptisk EPSC fremkalt på kort (<5 msek) og konsistente ventetider etter at toppen av den presynaptiske aksjonspotensial (figur 3A). I de fleste eksperimenter flere postsynaptiske nevroner er testet før en postsynaptisk-tilkoblet pair kan skaffes. Overall, ~ 1/3 av presynaptiske Ca3 celler er monosynaptically koblet til den postsynaptiske CA3 cellen ved aktive synaptiske forbindelser (figur 3A), og ca 20% av CA3 nevroner er koblet sammen med all-tause synaptiske forbindelser 6,8.
Amplituden av baseline AMPA reseptor mediert strøm er variabel fra rettssaken til rettssak innenfor en sammenkoblet opptak, og også mellom selvstendig pairøde opptak (Figur 3B) 6,8. Gjennomsnittlig Ampar EPSC amplitude varierte fra <10 pA til> 800 pA, og sannsynligvis oppstår forskjeller i antall funksjonelle synapser mellom sammenkoblede innspillinger. Feilrater har også blitt observert å variere betydelig mellom sammenkoblede innspillinger 6,7, alt fra 100% Ampar EPSC feilrater på tause synapser, til 0-95% feilrater i par forbundet med aktive synapser 6,7. Innenfor enkelte sammenkoblede innspillinger, synaptiske feil oppstod, særlig i innspillinger med mindre Ampar EPSC amplituder. Variasjonen i Ampar EPSC amplitude er tydelig fra rettssaken til rettssak i rådata (Figur 3B) skyldes sannsynligvis svingninger i quantal nummer løslatt fra rettssaken til rettssak, som skjer på andre synapser seks.
Dual hele celleopptak gir også direkte tilgang til både pre-og postsynaptiske nevronale cytoplasma, slik at farmakologisk manipulation av enten / både presynaptiske og postsynaptiske celler via opptaks elektroder seks. Vanligvis presynaptiske farmakologiske manipulasjoner er svært hurtig (i løpet av 10 min). Dette er ikke begrenset til små molekyler (f.eks BAPTA), som fluorescensmerkede dekstraner kan få tilgang til presynaptiske terminaler ≤200 um bort fra opptakselektrode. Derfor analyse lik den som er utført på blekksprut gigant synapse 25 kan bli utvidet til studier av synaptisk vesikkel frigjøring maskineri i hippocampus skive. Plasseringen av de spesifikke synapser målt i de sammenkoblede opptakene er ikke identifisert i innspillingsprosessen. Derfor proksimale versus distale områder av synapser kan ikke vurderes så lett som lokal stimulering med ekstracellulære stimulerende elektroder eller fokus glutamat søknad. Imidlertid kan fargestoff fylling av hver nervecelle under den sammenkoblede opptak aktiver morfologisk rekonstruksjon av aksonale lysthus og potensielle synaptiske sider LTP og LTD er pålitelig indusert ved CA3-CA3 synapser i dette kultursystem (figur 3C), og begge former for plastisitet sist for varigheten av hele celle-opptak (i løpet av 2 timer). LTP og LTD induksjons paradigmer benyttes er identiske med de utføres i akutte skiver og LTP og LTD utstillings egenskapene NMDAR-avhengighet, associativity og sti uavhengighet, og derfor er denne kombinasjonen av kultur system og sammenkoblede opptak gir en verdifull modellsystem for å undersøke synaptic plastisitet 7. Polysynaptic hemmende hendelser er ofte observert i sammenkoblede opptak mellom CA3 pyramidecelle par (Figur 3D). Vi har ikke farmakologisk blokkere denne GABAergic hemming som dette gir svært forstyrrende hyperaktivitet. Imidlertid, på grunn av den lengre ventetid av disse polysynaptic inhibitoriske hendelser, de som regel ikke til hinder for måling av monosynaptisk excitatory strøm. Dersom polysynaptic hemmende hendelser ble observert å forstyrre monosynaptisk strøm, utydelig toppen av monosynaptisk strøm, disse parene trenger å bli ekskludert fra analysen. Polysynaptic eksitatoriske forbindelser er også noen ganger ikke observert, men er betydelig mindre vanlig, og også er ekskludert fra analysen. I sjeldne tilfeller er en monosynaptisk synaptisk hemmende strøm oppnås på grunn av det presynaptiske neuron blir en hemmende interneuron. Dette er lett identifisert ved mangelen på innkvartering av aksjonspotensialet avfyring i respons til lengre (1 sek) strøm injeksjon. Dette er ikke mulig i postsynaptiske nevroner i hvilken den interne oppløsning cesium glukonat-baserte. Men som nevroner identifiseres visuelt før opptak, i vår erfaring dette skjer <1% av tiden. Interneuroner innenfor organotypic hippokampale skiver er lett identifiseres visuelt ved deres ikke-pyramidal cellekroppen, spesielt i stratum radiatum og Oriens. Derfor dette preparation gjør også opptak av interneuron eksitatoriske og hemmende strømninger. Imidlertid er svært lite kjent om de hemmende nettverk i organotypic skiver, og om de opprettholde tilkobling lik som i hjernen er ikke klart. 
Figur 1. Utarbeidelse av organotypic hippocampus skive kulturer. (A) Den hippocampus, in situ, er skissert ved den stiplede linje. For å fjerne hippocampus, er tilkoblingene til fornix kuttet og hippocampus forsiktig rullet ut av hjernen. (B) Hippocampi er plassert på scenen av slicer på toppen av filterpapir. (C) hippocampus skiver overføres via den brede boring av en Pasteur pipette for å unngå skade. (D) Eksempler på 'gode' versus 'dårlige' skiver.(E) Cartoon of skive oppsett på membraner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2. Innhenting paret hele celle opptak fra hippocampus Ca3 nevroner. Tyver for å oppnå en sammenkoblet opptak, som viser optimal elektrode og nevronale posisjonering. (A) Etter å ha fått den første hele cellen opptak mikroskopet flyttes 10-200 mm i x- aksen, slik at den etablerte opptaket (pil) er plassert på kanten av området som er synlig på skjermen. Skala bar:. 25 mikrometer (B) for å muliggjøre plass for den andre elektrode, blir linsen av mikroskopet deretter hevet ~ 5 til 10 mm, som sikrer at ACSF fortsatt opprettholder kontakt medlinsen. For å sikre at den annen elektrode ikke støte den andre opptaks elektroden, den andre elektroden beveges i x-aksen til den er direkte under lysbanen gjennom linsen, men fremdeles betydelig over den etablerte opptakselektrode. (C) Etablert sammenkoblet opptak viser begge elektrodene (piler) i det samme fokalplan. Målestokk:. 25 mikrometer (D) Paret opptak fra tilstøtende Ca3 nevroner i en transgen dyr, og viser de EGFP-positive nevroner på RHS. Målestokk:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3. synaptisk transmisjon og plastisitet mellom CA3-CA3 pyramidecelle par. (A) Eksempler på pre og postsynaptiske spor fra en sammenkoblet opptak mellom to CA3 pyramidale nevroner. Som svar på en 20 sek strømpuls å indusere presynaptisk aksjonspotensial avfyring, den postsynaptiske Ampar-mediert Strøm (innspilt på -65 mV) forekommer i direkte respons til aksjonspotensial (B) Venstre:. Amplituden Ampar-medierte EPSCs varierer ikke bare mellom sammenkoblede innspillinger, men også fra prøve-til-rettssaken i en sammenkoblet opptak. Hver prøveperiode representerer amplituden av EPSC målt ved 0,1 Hz. I dette eksempelet, svinger Ampar EPSC amplitude fra 5 pA til> 60 Pa. Høyre: NMDAR EPSC amplituder målt ved 40 mV i nærvær av 10 pM CNQX. NMDAR EPSC amplituder er vanligvis betydelig mindre i amplitude at Ampar EPSCs, men fortsatt vise betydelig variasjon. NMDAR EPSC amplitude typisk gjennomsnitt mellom 10-20 pA i sammenkoblede innspillinger mellom CA3 pyramidale celler, noe som gjør feil lett identifiserbare (C) Venstre:. CA3 pyramidale celle parene uttrykke LTP som vedvarer i lengden av paret opptaket. LTP er lett synlig ved en økning i amplituden til Ampar EPSCs. Betydelig prøve-å-rettssaken variabilitet i Ampar EPSC amplitude gjenstår etter induksjon av LTP. Høyre: Uttrykk for langsiktig depresjon (LTD) mellom CA3 pyramidale nevroner. Legg merke til nedgangen i gjennomsnittlig amplitude av Ampar EPSC og samtidig reduksjon i rettssaken for retten amplitude variasjon. (D) Eksempel på som forekommer på en lengre ventetid i forhold til monosynaptisk Ampar EPSC postsynaptiske polysynaptic hemmende strømninger,. Når den postsynaptiske nevroner er klemt fast spenning på -65 mV, de polysynaptic strømninger er synlige som en andre topp ved en ventetid på> 5 msek etter at toppen av den presynaptiske aksjonspotensial. Holder den postsynaptiske nervecellen ved -30 mV bekrefter at polysynaptic strømmen er hemmende på grunn av reversering av den nåværende retningen.es.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Tabell 1. Potensielle problemer som oppstår i sammenkoblede innspillinger og utarbeidelse av organotypic skive kulturer. Dette viser vanlige potensielle problemer som oppstår med sammenkoblede hele celle opptak i organotypic skive kulturer. I tillegg har vi også informere om at mye tid er nødvendig for å bli brukt "kjøre 'elektrofysiologi oppsett for sammenkoblede innspillinger, som de fleste problemer er knyttet til bevegelsesforstyrrelser som lett kan visualiseres og utbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet kravene for å etablere vellykkede paret hele celleopptak i organotypic hippocampus skive kulturer. Sammenkoblede opptak kan også utføres i flere preparater, inkludert akutte skiver og dissosiert kultursystemer 26,27. Mens fokuset her har vært på induksjon av lengre former for synaptisk plastisitet (nemlig LTP og LTD), er det viktig å understreke at sammenkoblede hele celle opptak i organotypic, akutt skive og dissosiert celle forberedelser har gitt viktig innsikt i quantal størrelse, kort -term plastisitet, presynaptiske funksjon, samt LTP og LTD 2,4,8,26,27.
Den store fordelen med den organotypic skive systemet er økt tilkobling mellom nerveceller. Synaptic tilkobling i den akutte slice forberedelser er lav på grunn av adskillelse av aksonale forbindelser under skive forberedelse. I vår erfaring, sammen opptak fra postsynaptisk connected CA3 nevroner i akutte skiver var mulig i bare ~ 5% av sammenkoblede innspillinger innhentet. Det vil si at 95% av sammenkoblede opptakene var usammenhengende. Et alternativ er å bruke primære dissosiert hippocampus kulturer hvor synaptic tilkobling er betydelig høyere 26. Men med dissosiert dyrkede forberedelser kommer spørsmål om nevron identitet og om deres egenskaper er lik de av modne synapser i innfødte vev. Bruken av organotypic hippocampal skive kulturer delvis lindrer disse bekymringene fordi neuronal subtyper kan lett identifiseres av, og cellene beholde morfologien og tilkobling som er lik den opprinnelige hjernevevet 20. Men som skiver er opprettholdt in vitro i løpet av en uke, er det viktig å merke seg at betydelige aksonal vekst skjer i løpet av denne tiden. Den resulterende økning i tilkobling er sterkt gunstig å utføre sammenkoblede innspillinger som undersøker synaptisk funksjon og plastisitet, men det børbemerkes at studier som undersøker nettverkstilkobling ikke kan være egnet for dette preparatet.
Mens de fleste av våre sammenkoblede opptak er gjennomført på CA3-CA3 pyramidecelle parene, kan denne teknikken lett tilpasses CA3-CA1 og dentate gyrus-CA3 paret innspillinger. Forekomsten av synaptiske tilkobling mellom dentate gyrus og CA3 pyramidale nevroner i dette systemet er betydelig lavere. Imidlertid har monosynaptisk eksitatoriske forbindelser mellom CA3 og CA1 i dette system er rapportert å være så høy som 76% 28.
I tillegg er sammenkoblede hele celleopptak rutinemessig utført i mus hippocampal vev, inkludert transgene mus (figur 2D) 29-31. Teknikken kan bli ytterligere raffinert å registrere synaptisk transmisjon og plastisitet mellom nevroner med mosaikk genuttrykk 30. GFP merking av villtype nevroner muliggjør målrettet sammen hele celle opptak i nevroner of kjent genotype. Disse eksperimentene har identifisert endringer i synaptisk tilkobling mellom individuelle nerveceller, inkludert hyperconnectivity eller asymmetrisk presynaptiske funksjon 30,31 som kan bidra til atferds underskudd observert hos disse dyrene.
I sammendraget, sammenkoblede helcelle- innspillinger øke evnen til å tolke elektrofysiologiske synaptiske egenskaper og for å bestemme de subcellulære mekanismer som nevroner benytte for å endre synaptiske styrke. Ved hjelp av denne teknikken har gjort spådommer om pre-og postsynaptiske modeller av synaptisk plastisitet å være direkte testet. I tillegg har fenotype av tause synapser, og spesifikke roller aktiv-sonen og PSD proteiner også blitt beskrevet i dette preparatet 6-16. Det har også muliggjort oppdagelsen at synapser eksistere i forskjellige elektrofysiologisk-definerte stater, og at i løpet av synaptisk plastisitet synapser bevege seg mellom disse statene 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
