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Neuroscience

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d'hippocampe

doi: 10.3791/51958 Published: September 28, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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Les récepteurs du glutamate médient la majorité de la transmission synaptique excitatrice dans les synapses du système nerveux central. Les deux principaux sous-types de récepteurs ionotropiques du glutamate localisées à la tête de la colonne vertébrale de la membrane post-synaptique sont la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionique acide (AMPA) des récepteurs. A des potentiels de membrane au repos, les récepteurs AMPA portent plus du courant post-synaptique au cours de la transmission synaptique. Dans l'hippocampe, le récepteur NMDA joue un rôle clé dans le déclenchement de l'évolution du nombre de récepteurs de l'AMPA dans la membrane post-synaptique: en agissant comme un "détecteur de coïncidence" 1 à initier des changements dans la force synaptique 1, le récepteur NMDA participe aux mécanismes synaptiques qui sont pensés pour soutenir l'apprentissage et la mémoire à un niveau subcellulaire. En réponse à la dépolarisation du neurone post-synaptique en parallèle avec la libération du transmetteur présynaptique, le calcium pénètre par le NMDArécepteur pour lancer l'insertion du récepteur AMPA ou d'enlèvement 2. Cette dynamique des récepteurs à la base de plasticité synaptique: une augmentation de la force synaptique est potentialisation à long terme 2,3 (LTP), alors qu'une diminution de la force synaptique est la dépression à long terme 4 (LTD). Par conséquent, le mouvement du récepteur AMPA est considéré comme responsable de l'expression de la plasticité synaptique, tandis que les récepteurs NMDA sont considérées pour contrôler son induction.

Déterminer les mécanismes précis qui sous-tendent la transmission synaptique et la plasticité nécessite l'étude de petites populations de synapses, idéalement synapses individuelles. Alors que certaines synapses sont parfaitement adaptés pour l'étude à ce niveau, par exemple, le calice de Held 5, pour les populations les plus synaptiques ce qui est extrêmement difficile en raison de la petite et diffuse la nature des connexions synaptiques. Deux principales techniques d'électrophysiologie ont été développés pour examiner les connexions synaptiques simples: La première est la stimulation minimale, where une fibre présynaptique est présumé stimulée extracellulaire. La deuxième technique est jumelé enregistrements, où deux enregistrements simultanés de cellules entières de neurones reliés par des synapses est effectuée. Un avantage majeur de stimulation minimal est qu'elle est rapide et relativement simple à réaliser, comportant le placement d'une électrode de stimulation extracellulaire dans le tube tout en enregistrant simultanément des axones d'un neurone post-synaptique. La principale préoccupation lors de l'utilisation de cette technique est que la stimulation fiable d'une seule cellule peut rarement être garantie procès après procès.

Au cours des quinze dernières années, nous avons utilisé couramment associé enregistrements de cellules entières de deux neurones pyramidaux reliés par des synapses 6-17. L'avantage majeur de cette technique est que seul neurone présynaptique est stimulée cohérente et fiable. Il permet aussi non seulement la caractérisation électrophysiologique, mais aussi la manipulation pharmacologique du neurone présynaptique 6,18 </ Sup>. Cependant, la probabilité de la connectivité synaptique entre les neurones est faible, ce qui rend difficile les paires connectées à obtenir 19. L'utilisation de cultures de tranches de cerveau organotypiques de contourner cet obstacle comme la connectivité synaptique peut rétablir in vitro et d'ailleurs la nature de la connexion qui en résulte est semblable à celle dans le tissu cérébral 20 native. En outre, les cultures organotypiques expriment LTP, LTD 7-10,12-15,21 et d'autres formes de plasticité synaptique à court terme, y compris la facilitation double choc (PPF) et la dépression (PPD) 6,22,23, permettant mécanismes de plasticité à être étudiée dans des paires de neurones. Nous décrivons ici en détail la méthodologie nécessaire pour atteindre des succès enregistrements appariés dans ce système in vitro. Cette information peut aisément être adapté à d'autres systèmes expérimentaux, y compris les tranches aiguës et d'autres régions du cerveau.

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Protocol

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Déclaration d'éthique animale:

Les protocoles décrits dans ce manuscrit suivent les directives de protection des animaux établies par l'Université d'Auckland et de l'Université de Stanford. Les ratons P7 ont été euthanasiés par décapitation rapide. Dissection de l'hippocampe est alors immédiatement effectué comme décrit ci-dessous.

1. organotypique hippocampe Slice Culture

  1. Préparation
    1. Préparer dissection moyen (utilisé seulement pour la dissection du cerveau). Mélanger 200 ml de milieu essentiel minimum, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de chaque, dans 0,85% de NaCl), 5 ml de solution tampon HEPES, 2 ml de Tris 1 M solution stock (pH 7,2), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um . Effectuer une dissection de l'hippocampe dans le milieu de dissection glacée.
    2. Refroidir le milieu de dissection. Placer le support de dissection au congélateur environ 1 heure avant le début de la dissection jusqu'à ce que le liquide est très froid. Ne pas laisser grand cr de glaceystals à former. Stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
    3. Préparer le milieu de culture (utilisé pour tout, sauf de dissection hippocampes). Mélanger 100 ml de milieu essentiel minimum (concentration de 1 x, liquide) w / des sels de Hank, w / L-glutamine, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (liquide, 10 000 unités de chaque, dans NaCl à 0,85%), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampon solution, 50 ml solution saline équilibrée de Hank, 50 ml de sérum de cheval (défini, inactivé par la chaleur), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um.
    4. Préparer les boîtes de culture. Placer 1 ml de milieu de culture par boîte de 35 mm de la culture, et ajouter un insert de membrane à chaque plat. Mettre en place à sept de ces plats dans une boîte de Pétri de 150 mm (ci-après comme «plaque»). Placer la plaque dans un incubateur à CO 2 pendant au moins une heure avant le début de la dissection, afin que le milieu de culture dans les plats atteint la température et le pH approprié.
  2. Dissection de la hippocampes de rats chiots à Jour Post-natal 7 (P7)
    1. Pré-stériliser tous les outils de dissection sous lumière UV avant la procédure.
    2. Après décapitation rapide, retirer le cerveau et le lieu dans un milieu réfrigéré dans un plat, et puis la retirer pour un morceau de papier filtre humidifié pour la dissection. Taquiner le cortex loin du mésencéphale utilisant émoussés lisses spatules décoratifs recouverts de plastique, ce qui expose l'hippocampe. Couper le cul de sac, puis retirez doucement la spatule sous l'hippocampe pour la retourner (Figure 1A).
      NOTE: Le succès des cultures de tranche peuvent être préparés en utilisant des animaux jusqu'à P10.
    3. Coupez l'hippocampe isolé loin du reste du cerveau. Transférer la hippocampes dans un nouveau plat contenant médias de dissection froide à l'aide d'un pinceau doux humide (par exemple, blanc sable # 4).
    4. Nettoyez le dessous (c'est à dire le côté plat) de l'hippocampe de plexus choroïde lors de la dissection, comme ces tissus spongieux, Meninge-comme il est difficile de séparer l'hippocampedes tranches les unes des autres par la suite.
      REMARQUE: Laissez ces tissus en place si elles ne peuvent pas être taquiné loin doucement.
    5. Effectuer l'ensemble de dissection aussi rapidement que possible sans endommager le hippocampes.
      REMARQUE: Une dissection minutieuse est plus important que d'un, rapide, aussi longtemps que les conditions expérimentales sont refroidis. Trancher le hippocampes de rats trois simultanément. L'état de santé de la tranche ne soit pas affectée aussi longtemps que le temps total du début à lorsque les tranches étalées entrent dans l'étuve est de moins de 30 min.
  3. Tranchage
    1. Couper les hippocampes transversalement en 400 um sections en utilisant une trancheuse manuelle des tissus. La méthode par laquelle le découpage est réalisé n'est pas important, tant qu'il n'est pas trop dommageable pour le tissu et produit des tranches d'épaisseur uniforme avec une architecture laminaire facilement visible (c'est à dire la corne d'Ammon est facile de voir à conserver dans le tissu).
    2. Allongez la hippocampes sur la scène du tissuhachoir sur une triple épaisseur de # 2 de papier-filtre. Le hippocampes sont entièrement tranché sans retirer les tranches individuellement (c'est à dire l'ensemble de l'hippocampe est laissé sur la scène de l'hélicoptère jusqu'à ce que toutes les coupes ont été faites, mais plutôt comme des miches de pain tranché à ce stade, figure 1B).
    3. Transférer la hippocampes dans le milieu de dissection à l'aide d'un pinceau doux posé à côté de l'hippocampe (blanc sable 2 #). Poussez doucement chaque hippocampe sur le côté pour briser l'adhérence entre l'hippocampe et le papier filtre sous-jacent. Rouler la brosse sous chaque hippocampe à ramasser sur la scène. Placez tous les hippocampes dans la même boîte de Pétri de 35 mm de milieu de dissection froide. Séparez les hippocampes en tranches individuelles en agitant manuellement le plat en alternant mouvements droite et à gauche.
    4. Inspectez les tranches sous un microscope à dissection et supprimer tout ce qui est endommagé, petit, ou qui ne possèdent pas de cellule visiblecouches de corps.
      NOTE: Il sera souvent le cas que toutes les tranches sont séparés de leur fratrie avec succès de cette façon. Dans ce cas, ils peuvent être séparés en les tournant sur le bord et à les pousser du bout des pinces fines. Les «bons» des tranches sont ensuite transférés dans un autre plat propre Petri contenant un milieu de dissection froide à l'aide d'une pipette Pasteur coupée et polie à la flamme (figures 1C-E).
  4. Stockage
    1. Placez les tranches individuelles sur les cartouches filtrantes à membrane. Avec une pipette Pasteur coupée et le feu poli pour donner un plus gros calibre, transférer individuellement tranches les inserts de culture.
      REMARQUE: La taille du trou créé lors de la coupe et la pipette de polissage-le-feu est important. Trop petit et les tranches ne seront pas facilement quitter la pipette pour la membrane. Fluide trop grand excès et est placé sur la surface de la membrane avec la tranche. Le diamètre de l'alésage mieux est généralement d'environ la moitié de la diammètre du cylindre de la pipette. Lors de la coupe, ce diamètre peut être choisi en coupant au bon endroit sur le cône de la pipette.
    2. Transfert tranche
      1. Remplir la pipette avec le milieu, et ensuite aspirer une seule tranche de petites forces d'aspiration. Cela permet de maintenir la tranche près de l'ouverture de la pipette et empêche l'expulsion trop fluide dans l'insert de placer la tranche.
      2. Appliquez une légère pression sur l'ampoule afin de former une petite goutte de suspension, permet la tranche de s'installer dans cette gouttelette, puis touchez que des gouttelettes de la membrane et laisser la tranche «chute» sur la membrane. Généralement trois tranches sont placées sur chaque insert de membrane.
        REMARQUE: si la gouttelette de liquide est trop importante, les gouttes provenant des trois tranches ont tendance à fusionner sur la surface de la membrane, et les tranches seront donc tout rassembler vers le centre de la membrane, ce qui rend plus difficile de les séparer pour l'enregistrement électrophysiologique par la suite.
    3. Enlev fluideal
      1. Aspirer tout milieu en excès de la partie supérieure de l'insert de plaque de culture de toutes les tranches en ce que la plaque (3 tranches par plaquette = 21 tranches par plaque), de sorte que les tranches ne sont pas immergés dans ou entourés par un réservoir de milieu de dissection.
      2. Effectuez ce soit avec un non coupée, mais poli-feu pipette Pasteur. Laisser la tranche de régler et d'adhérer à la membrane pendant une minute avant pipetage. Prenez soin de ne pas aspirer la tranche dans la pipette. Effectuer le retrait de fluide pour les inserts qui sont immatriculés en premier lieu, à laisser suffisamment de temps pour les tranches de s'installer.
    4. Tranche de stockage
      1. cultures tranche de magasin dans un incubateur à CO2 de 5,0% à 37 ° C. Observez la disposition finale des cultures de la figure 1E. Les tranches individuelles reposent sur un insert de plaque de culture qui a une membrane poreuse d'un fond, et s'ajuste à l'intérieur de cette pièce une boîte de Pétri remplie avec une petite quantité de milieu; par ce moyen, les tranches ne sont pas immergés dans la medium, mais elle est ouverte uniquement à travers la membrane au fond de l'insert de plaque de culture.
      2. Eventuellement, retirer les tranches de l'étude peut, soit en retirant l'insert de plaque de culture ou en découpant une section de la membrane de l'insert contenant une tranche.
  5. Entretien
    1. Remplacer le milieu dans les boîtes de Pétri jours après la prise de cultures. Transfert de l'insert de plaque de culture à une nouvelle boîte de Pétri contenant 1 ml de milieu de culture frais qui est équilibrée dans l'incubateur pendant au moins une heure avant le transfert.
    2. Changer le milieu de nouveau de la même manière, le troisième jour après la prise de cultures. Le troisième jour, le transfert des cultures à un incubateur réglé à 34 ° C. Changer le support deux fois par semaine (tous les 3-4 jours).
    3. Identifier les cultures saines. Sélectionnez cultures saines pour les enregistrements de cellules entières paires.
      REMARQUE: Les cultures en bonne santé ont un bord bien défini et une couche de cellules pyramidales clairement définie. Cultures d'esprith foncé (nécrotique probable) zones présente un aspect ou vacuole avec des frontières aplaties sont rejetées. En utilisant ces critères, normalement les deux tiers de cultures de tranches sont suffisamment saine pour l'enregistrement.
    4. Utiliser ces cultures dans un délai assez petite fenêtre de temps. Ne pas les tissus utilisés qui sont cultivées depuis plus de deux semaines que les neurones commencent à afficher un comportement légèrement épileptique qui s'aggrave lentement avec le temps. La limite supérieure exacte de la survie neuronale n'est pas connu, mais il est possible d'enregistrer le fonctionnement des cellules pyramidales aussi tard que 16 semaines en culture.

2. paires enregistrements de cellules entières

  1. ACSF et Solutions intracellulaires
    1. Préparer la solution d'électrode présynaptique en mélangeant (en mM) 120 gluconate de potassium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec KOH, osmolarité: 290 mOsm). Alors que la même solution de l'électrode est utilisée pour les neurones post-synaptiques, gluconate de césium (120 mM) Est généralement utilisé comme le principal sel dans l'électrode post-synaptique, plus mM QX314 5.
      NOTE: Ceci permet de serrage de tension stable à des potentiels positifs pour enregistrer les courants NMDAR médiation post-synaptiques 8-10,13. Elle empêche également l'hyperexcitabilité induite par le potassium, le neurone présynaptique de la solution en écoulement interne de l'électrode d'enregistrement avant un joint postsynaptique de giga ohm est faite.
    2. Préparer la solution d'électrode postsynaptique composition (en mM) 120 gluconate de césium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, NaATP 2, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec CsOH, osmolarité: 290 mOsm). Tirez microélectrodes de verre à 5-10 résistance de MQ et remplir avec une solution interne filtré.
    3. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) composition (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 glucose, pH 7,4, saturé avec 95% O 2, 5 % de CO 2. REMARQUE: Si r AMPAR médiationEPONSES doivent être bloquées pour l'examen des NMDAR EPSCs, comprennent 10 uM CNQX ou NBQX dans l'ACSF.
  2. Obtenir jumelés entiers enregistrements cellulaires
    1. Pour examiner la transmission synaptique entre deux neurones individuels, désigner un neurone comme le neurone présynaptique et maintenir pince de courant pour induire des potentiels d'action et de lancer la transmission synaptique.
    2. Désigner le deuxième neurone, comme le neurone post-synaptique, et le maintenir en pince de courant ou de tension en fonction de l'information requise par le chercheur. Obtenir un examen détaillé des courants glutamatergiques, avec EPSCs AMPAR médiation examinés à -65 mV et EPSCs NMDAR médiation examinés à +30 mV 6-16 en tenant le neurone post-synaptique de la tension de serrage
    3. Établir un enregistrement associé. Pour établir un enregistrement associé, l'enregistrement de la cellule entière présynaptique on obtient toujours la première, permettant à plusieurs neurones post-synaptiques séquentielles à obtenir jusqu'à celui qui est synaptique actuellement connectésd est obtenu. Si la réalisation d'expériences de plasticité synaptique, il est particulièrement important d'obtenir le premier neurone présynaptique comme l'induction de la LTP dans le neurone post-synaptique doit être initiée dans les 10 minutes de l'obtention de l'ensemble des enregistrements de cellules de lavage pour éviter les facteurs cytoplasmiques nécessaires à 8,19 LTP.
    4. Éviter la perte cellulaire induite par le mouvement. Un défi majeur lors de l'exécution des enregistrements de cellules entières paires est d'éviter les vibrations et les perturbations induites mouvement du premier enregistrement de la cellule entière tout en obtenant le deuxième enregistrement.
      1. Obtenir le premier enregistrement de cellules entières et de passer ensuite au microscope objectif 10-200 pm de l'axe x de telle sorte que l'enregistrement créé est situé au bord de la zone visible sur l'écran (figure 2A).
      2. Soulevez la lentille du microscope ~ 5-10 mm, tout en assurant que le ACSF maintient toujours le contact avec la lentille. Montez la seconde électrode et de guider dans le ménisque de fluide (figure 2B
      3. Déplacer l'électrode dans le plan xy jusqu'à ce qu'il soit directement sous le trajet de la lumière à travers la lentille, mais encore de façon significative au-dessus de l'électrode d'enregistrement établi. Une fois que l'électrode est visible au microscope, est de veiller à la pointe à l'extrémité de l'écran éloignée de la première électrode.
      4. Déplacer la deuxième électrode vers le bas dans l'ordre de la mise au point du microscope jusqu'à ce que les deux électrodes sont dans le même plan focal. Il est important que le niveau de pression positive est suffisamment forte pour éviter le blocage pointe, mais pas trop forte de manière à interrompre le premier enregistrement de cellules entières. Cela se traduit par la pression positive induire un mouvement à 2-3 neurones à partir de l'électrode quand il pénètre dans la tranche.
      5. Trouver un partenaire post-synaptique dans un plan focal similaire au premier enregistrement pré-synaptique (figure 2C). L'enregistrement est généralement jumelé obtenir des enregistrements entre les neurones pyramidaux CA3 la deuxième de cellules entières d'un 0-200 mm neurone de la première rnregistrement (figures 2C, D).
        REMARQUE: La transmission synaptique entre deux neurones sont stables sur des périodes allant jusqu'à 3-4 heures lors de l'utilisation de ces techniques d'enregistrement de cellules standards entiers.
  3. Plasticité synaptique: Once Upon obtenir un succès paire de cellules pyramidales synaptique connecté (3A Figures, B), examiner les caractéristiques de transmission et la plasticité synaptique.
    1. Induction de LTP.
      1. Induire la LTP en associant des potentiels d'action présynaptiques (1 Hz) avec une dépolarisation post-synaptique à -10 à 0 mV pendant 1 min (figure 3C) 7-9,12-14. Procédez au couplage à moins de 10 min de pause dans le neurone post-synaptique.
        REMARQUE: LTP peut aussi être induite par les neurones qui s'est tenue à pince de courant en associant des potentiels d'action présynaptiques et post-synaptiques à 1 Hz pendant 1 min, avec des potentiels d'action post-synaptiques suscité 10 ms après l'injection de courant dans le neurone présynaptique 8
    2. En outre induire LTD par une faible stimulation de fréquence (EPA) à 1 Hz combinée à une légère dépolarisation du neurone post-synaptique à -55 mV pendant 5-10 min (figure 3C) 9.

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Representative Results

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Connectivité synaptique est évident en stimulant le neurone présynaptique de tirer un potentiel d'action en passant une impulsion de courant de dépolarisation (typiquement 20-50 pA pour 20 ms) via l'électrode d'enregistrement. La trace de courant post-synaptique est alors examiné pour rechercher la présence d'un RPEC monosynaptique évoquée à court (<5 ms) et des temps de latence cohérents après le pic du potentiel d'action présynaptique (Figure 3A). Dans la plupart des expériences multiples neurones post-synaptiques sont testés avant d'une paire de synapses connectées peuvent être obtenues. Dans l'ensemble, environ 1/3 des cellules pré-synaptiques sont CA3 monosynaptique couplé à la cellule post-synaptique CA3 par les connexions synaptiques actives (figure 3A), et environ 20% des neurones CA3 sont reliées par des connexions synaptiques tout silencieux 6,8.

L'amplitude de référence récepteurs AMPA courants médiation est variable d'un essai à l'intérieur d'un enregistrement associé, et aussi entre les pai indépendantenregistrements rouges (figure 3B) 6,8. Amplitude moyenne AMPAR RPEC variait de <10 pA à> 800 pA, et se pose probablement des différences dans le nombre de synapses fonctionnelles entre les enregistrements appariés. Les taux d'échec ont également été observés à varier considérablement entre les enregistrements appariés 6,7, allant de 100% AMPAR RPEC taux d'échec au niveau des synapses silencieuses, à 0-95% le taux d'échec dans les paires reliées par des synapses actives 6,7. Dans les enregistrements appariés individuelles, échecs synaptiques ont eu lieu, en particulier dans les enregistrements avec les petites amplitudes AMPAR RPEC. La variabilité dans AMPAR RPEC amplitude est évident d'un essai à des données brutes (figure 3B) est probablement due à la fluctuation du nombre quantique libéré d'un essai à, comme c'est le cas dans d'autres synapses 6.

Enregistrements de cellules entières doubles offrent également un accès direct à l'avant et le cytoplasme des neurones post-synaptiques, permettant manipulat pharmacologiqueion de soit / deux cellules présynaptiques et post-synaptiques via les électrodes d'enregistrement 6. Typiquement, les manipulations pharmacologiques présynaptiques sont très rapide (dans les 10 min). Ce n'est pas limitée à de petites molécules (par exemple, BAPTA), en tant que dextranes marqués par fluorescence peuvent accéder à terminaisons présynaptiques ≤200 um loin de l'électrode d'enregistrement. Par conséquent analyse similaire à celui effectué au niveau de la synapse calmar géant 25 pourrait être étendue à l'étude des vésicules synaptiques libération machines dans la tranche de l'hippocampe. La position des synapses spécifiques mesurées dans les enregistrements par paires ne sont pas identifiés dans le processus d'enregistrement. Par conséquent, la proximale par rapport à des sites distales des synapses ne peut être évaluée aussi facilement que la stimulation locale avec des électrodes de stimulation extracellulaire ou l'application de glutamate focal. Cependant, le remplissage de colorant de chaque neurone lors de l'enregistrement associé peut permettre la reconstruction morphologique des tonnelles axonales et des sites synaptiques potentiels

LTP et LTD sont induites de manière fiable au niveau des synapses CA3-CA3 dans ce système de culture (figure 3C), et les deux formes de plasticité dernier pour la durée des enregistrements de cellules entières (plus de 2 heures). Les paradigmes de LTP et LTD induction utilisés sont identiques à ceux effectués en tranches aiguës et LTP et LTD présentent les propriétés des récepteurs NMDA-dépendance, l'associativité et l'indépendance de la voie, et donc cette combinaison de système de culture et enregistrements appariés fournit un système de modèle utile d'examiner synaptique 7 plasticité.

Événements inhibiteurs polysynaptiques sont fréquemment observées dans les enregistrements appariés entre paires de cellules CA3 pyramidale (figure 3D). Nous ne bloquons pas pharmacologiquement cette inhibition GABAergique que ce produit hyperactivité très perturbateur. Toutefois, en raison de la latence plus longue de ces événements inhibiteurs polysynaptiques, ils n'empêchent généralement pas la mesure de la excitato monosynaptiquecourant de ry. Si les inhibiteurs polysynaptiques événements ont été observés à interférer avec le courant monosynaptique, obscurcissant la crête du courant monosynaptique, ces couples doivent être exclus de l'analyse. Connexions excitatrices polysynaptiques sont parfois observés, mais sont beaucoup moins fréquentes et sont également exclus de l'analyse. Rarement, un courant synaptique inhibitrice monosynaptique est obtenue grâce à la neurone présynaptique être un interneurones inhibiteurs. Cela est aisément identifié par le manque de logements d'action tir potentiel en réponse à plus long (1 sec) injection de courant. Ceci n'est pas possible dans les neurones post-synaptiques à base de gluconate, dans lequel la solution interne est le césium. Cependant, comme les neurones sont identifiés visuellement avant l'enregistrement, dans ce cas l'expérience <1% du temps. Interneurones à l'intérieur des tranches organotypiques d'hippocampe sont facilement identifiés visuellement par leur corps cellulaire non-pyramidale, en particulier dans le stratum radiatum et oriens. Par conséquent, ce pra séparation permet également d'enregistrements interneurones excitateurs et inhibiteurs courants. Cependant, très peu est connu sur les réseaux inhibiteurs de tranches organotypiques, et s'ils maintiennent la connectivité similaire à celle dans le cerveau n'est pas clair.

Figure 1
Figure 1: Préparation des cultures de tranches hippocampiques organotypiques. (A) L'hippocampe, in situ, indiqué par la ligne pointillée. Pour supprimer l'hippocampe, les connexions à la voûte sont rompus et l'hippocampe doucement roulé hors du cerveau (B). Hippocampes sont positionnés sur la scène de la trancheuse sur le dessus du papier-filtre (C). Tranches hippocampiques sont transférés via la large alésage d'une pipette Pasteur pour prévenir les dommages. (D) Exemples de «bons» contre les «mauvais» tranches.(E) de bande dessinée de configuration de la tranche sur les membranes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Obtention couplé enregistrements de cellules entières de neurones de l'hippocampe CA3. Images séquentielles d'atteindre un enregistrement lié, montrant l'électrode et le positionnement optimal des neurones. (A) après l'obtention de la première cellule de l'ensemble d'enregistrement est déplacé le microscope 10 à 200 mm dans la direction x de sorte que l'axe enregistrement établi (flèche) est situé au bord de la zone visible sur l'écran. Barre d'échelle:. 25 pm (B) Pour activer place pour la seconde électrode, la lentille du microscope est ensuite soulevé ~ 5-10 mm, veiller à ce que l'ACSF maintient toujours le contact avecla lentille. Afin d'assurer la seconde électrode ne bosse pas l'autre électrode d'enregistrement, la deuxième électrode est déplacée dans l'axe des x jusqu'à ce qu'il soit directement sous le trajet de la lumière à travers la lentille, mais encore de façon significative au-dessus de l'électrode d'enregistrement établie (C). Fondée enregistrement d'démontrant apparié deux électrodes (flèches) dans le même plan focal. Barre d'échelle:. 25 pm (D) l'enregistrement Couplé à partir de neurones CA3 adjacents dans un animal transgénique, montrant les neurones EGFP positif sur l'ERS. Barre d'échelle: 20. Pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
La figure 3 de la transmission synaptique et la plasticité entre CA3-CA3 paires de cellules pyramidales. (A) Exemple de pre- et post-synaptiques traces d'un enregistrement couplé entre deux neurones pyramidaux CA3. En réponse à une impulsion de courant de 20 sec pour induire une action présynaptique tir potentiel, la post-synaptique AMPAR médiation en cours (enregistrée à -65 mV) survient en réponse directe au potentiel d'action (B) A gauche:. L'amplitude de EPSCs AMPAR médiation varie non seulement entre les enregistrements appariés, mais aussi de procès à un procès dans un enregistrement associé. Chaque essai représente l'amplitude du RPEC mesurée à 0,1 Hz. Dans cet exemple, AMPAR RPEC amplitude varie de 5 pA à> 60 pA. Droite: amplitudes NMDAR RPEC évalués à 40 mV en présence de 10 pM CNQX. Amplitudes NMDAR RPEC sont généralement beaucoup plus faible amplitude que AMPAR EPSCs, mais montrent encore une variabilité importante. NMDAR RPEC amplitude dure en moyenne entre 10-20 Pa dans les enregistrements appariés entre les cellules pyramidales CA3, faisant échecs facilement identifiable (C) A gauche:. CA3 pyramidales paires de cellules exprimer LTP qui persiste pendant la durée de l'enregistrement lié. LTP est facilement évident par une augmentation de l'amplitude de AMPAR EPSCs. Variabilité essai à essai significative de l'amplitude AMPAR RPEC reste après l'induction de la LTP. Droite: Expression de la dépression à long terme (LTD) entre les neurones pyramidaux CA3. Notez la diminution de l'amplitude moyenne de la AMPAR RPEC et une diminution concomitante de la essai à amplitude de la variabilité. (D) Exemple de courants inhibiteurs postsynaptiques polysynaptiques, qui se produisent à un temps de latence plus longue par rapport à la monosynaptique AMPAR RPEC. Lorsque le neurone post-synaptique est serrée tension à -65 mV, les courants polysynaptiques sont visibles sous forme d'un second pic à un temps de latence de> 5 ms après le pic du potentiel d'action présynaptique. En tenant le neurone post-synaptique à -30 mV confirme que le courant polysynaptique est inhibitrice en raison de l'inversion de la direction du courant.es.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Les problèmes potentiels liés à des enregistrements appariés et préparation des cultures organotypique. Cette liste des problèmes potentiels communs qui se produisent avec des enregistrements de cellules entières paires de cultures organotypique. En outre, nous vous conseillons également que beaucoup de temps est nécessaire pour être passé "conduite" de la configuration d'électrophysiologie pour les enregistrements appariés, comme la plupart des problèmes sont liés à des perturbations de circulation qui peuvent être facilement visualisées et corrigées.

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Ici, nous avons décrit les exigences pour établir des enregistrements cellulaires succès paires entières dans les cultures de tranches d'hippocampe organotypiques. Les enregistrements par paires peuvent également être effectuées dans plusieurs préparations, y compris les tranches aiguës et des systèmes de culture 26,27 dissociées. Si l'accent a été mis sur l'induction de formes plus longues de la plasticité synaptique (à savoir LTP et LTD), il est important de souligner que les enregistrements de cellules entières paires de organotypique, tranche aiguë et dissocié des préparations cellulaires ont fourni des informations importantes sur la taille quantique, à court plasticité -term, la fonction présynaptique, ainsi que la LTP et LTD 2,4,8,26,27.

Le principal avantage du système organotypique est la connectivité accrue entre les neurones. La connectivité synaptique dans la préparation de la tranche aiguë est faible en raison de la rupture des connexions axonales lors de la préparation de la tranche. Dans notre expérience, les enregistrements de synapses actuellement connectés jumeléneurones d CA3 en tranches aiguës sont possibles que dans environ 5% des enregistrements appariés obtenus. En effet, 95% des paires d'enregistrements étaient sans rapport. Une alternative est d'utiliser primaire dissociée cultures hippocampe où la connectivité synaptique est nettement plus élevé 26. Cependant, avec des préparations de culture dissociés venir questions concernant l'identité des neurones et si leurs propriétés sont similaires à celles des synapses matures dans le tissu natif. L'utilisation de cultures tranche de l'hippocampe organotypiques améliore partiellement compte de ces sous-types neuronaux car peut facilement par identifiée, et les cellules de maintenir la morphologie et la connectivité qui sont similaires aux tissus du cerveau natif 20. Toutefois, comme les tranches sont maintenues in vitro pendant plus d'une semaine, il est important de noter que la croissance axonale importante se produit pendant ce temps. L'augmentation de la connectivité est très bénéfique pour effectuer des enregistrements appariés qui examinent la fonction et la plasticité synaptique, mais il devraitde noter que les études portant sur la connectivité réseau peuvent ne pas convenir à cette préparation.

Alors que la majorité de nos enregistrements appariés ont été menées sur CA3-CA3 paires de cellules pyramidale, cette technique peut être facilement adapté à CA3-CA1 et CA3 gyrus denté-jumelé enregistrements. L'incidence de la connectivité synaptique entre les neurones du gyrus denté et CA3 pyramidales dans ce système est considérablement plus faible. Toutefois, les connexions entre les excitateurs monosynaptiques CA3 et CA1 de ce système ont été rapportés pour être aussi élevée que 76% 28.

En outre, les enregistrements de cellules entières paires sont régulièrement effectuées dans les tissus de l'hippocampe de la souris, y compris les souris transgéniques (figure 2D) 29-31. La technique peut être encore affiné pour enregistrer la transmission et la plasticité synaptique entre les neurones à l'expression du gène mosaïque 30. marquage GFP de neurones de type sauvage permet ciblée jumelé enregistrements de cellules entières dans les neurones of génotype connu. Ces expériences ont permis d'identifier des altérations de la connectivité synaptique entre les neurones individuels, y compris hyperconnectivité ou présynaptique fonction asymétrique 30,31 qui peuvent contribuer aux déficits comportementaux observés chez ces animaux.

En résumé, les enregistrements de cellules entières paires augmenter la capacité d'interpréter les propriétés électrophysiologiques synaptiques et de déterminer les mécanismes sous-cellulaires que les neurones utilisent pour modifier la force synaptique. En utilisant cette technique a permis aux prédictions des modèles pré-et post-synaptiques de la plasticité synaptique à être testées directement. Par ailleurs, le phénotype des synapses silencieuses, et les rôles spécifiques de la zone active et les protéines PSD ont également été décrite dans cette préparation 16.6. Il a également permis la découverte que les synapses existent dans les Etats électrophysiologiquement définies distinctes, et que, pendant les synapses de plasticité synaptique se déplacent entre ces Etats 9,17.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium Stable motorized micromanipulators 
Penicillin-Streptomycin solution  Shallow tissue bath
HEPES buffer solution DIC camera
1 M Tris stock solution Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution Computer
Horse Serum  Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas Upright microscope
Soft paintbrush Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper Electrode puller
#2 Filter paper Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood

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References

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Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe
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Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).More

Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).

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