Introduction
Glutamat-Rezeptoren vermitteln die Mehrheit der erregenden synaptischen Transmission an Synapsen des zentralen Nervensystems. Die beiden wichtigsten Subtypen von ionotropen Glutamat-Rezeptoren an der Wirbelsäule Kopf der postsynaptischen Membran lokalisiert sind N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren. Bei Ruhemembranpotentiale, AMPA-Rezeptoren tragen die meisten der postsynaptischen Strom während der synaptischen Übertragung. Im Hippocampus spielt der NMDA-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Änderungen der Anzahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran: durch ein "Koinzidenz-Detektor" 1 wirkenden Änderungen der synaptischen Stärke 1 einzuleiten, nimmt der NMDA-Rezeptor in den synaptischen Mechanismen , die gedacht werden, um Lernen und Gedächtnis bei einem subzellulärer Ebene zu untermauern. In Reaktion auf die Depolarisation der postsynaptischen Neuron parallel präsynaptischen Transmitterfreisetzung tritt Kalzium über den NMDARezeptor AMPA-Rezeptor Einsetzen oder Entfernen 2 einzuleiten. Diese Rezeptordynamik zugrunde liegen Synapse Plastizität: eine Erhöhung der synaptischen Stärke ist Langzeit-Potenzierung 2,3 (LTP), während eine Abnahme der synaptischen Stärke ist die langfristige Vertiefung 4 (LTD). Daher AMPA-Rezeptor Bewegung gedacht für die synaptische Plastizität Expression verantwortlich zu sein, während NMDA-Rezeptoren wird angenommen, dass seine Induktion zu steuern.
Die Bestimmung der genauen Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zugrunde liegenden erfordert das Studium kleinen Populationen von Synapsen, idealerweise einzelne Synapsen. Während einige Synapsen sind sehr für Studie aufgrund der kleinen und diffuse Art der synaptischen Verbindungen geeignet auf dieser Ebene, zB der Kelch der gehaltene 5, für die meisten Populationen synaptischen das ist extrem schwierig. Zwei Hauptelektro Techniken entwickelt worden, um einzelne synaptischen Verbindungen zu untersuchen: Die erste ist eine minimale Stimulation where eine präsynaptischen Faser wird vermutet, stimuliert extrazellulär. Die zweite Technik gepaart Aufnahmen, wo zwei gleichzeitige Aufnahmen von ganzen Zelle synaptisch verbundenen Neuronen durchgeführt wird. Ein wesentlicher Vorteil der minimalen Stimulations ist, dass es schnell und relativ einfach durchzuführen, mit Platzierung einer extrazellulären Stimulationselektrode in das axonale Trakt, während gleichzeitig der Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron. Das Hauptanliegen bei der Verwendung dieser Technik ist, dass zuverlässige Stimulation einer einzelnen Zelle nur selten gewährleistet Studie nach Studie werden.
Im Laufe der letzten fünfzehn Jahre haben wir routinemäßig verwendet zwei synaptisch verbunden Pyramidenzellen 6-17 gepaart Ganzzellableitungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass nur eine präsynaptische Neuron konsistent und zuverlässig stimuliert. Außerdem können nicht nur elektro Charakterisierung auch pharmakologische Manipulation der präsynaptischen Neuron 6,18 </ Sup>. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen gering, so verbundenen Paaren schwierig bis 19 zu erhalten. Die Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen umgeht dieses Hindernis als synaptischer Verbindungen wieder hergestellt werden kann in vitro und außerdem die Art der resultierenden Verbindungs ist ähnlich zu der des natürlichen Gehirngewebe 20. Darüber hinaus organotypischen Kulturen auszudrücken LTP, LTD 7-10,12-15,21 und weitere Formen der kurzfristigen synaptischen Plastizität gepaart mit Puls-Erleichterung (PPF) und Depression (PPD) 6,22,23, so dass Plastizität Mechanismen zur in Paaren von Neuronen untersucht werden. Hier beschreiben wir die detaillierte Methode erfolgreich erreichen gepaart Aufnahmen in diesem in vitro-System beteiligt. Diese Information kann leicht in anderen experimentellen Systemen, einschließlich akuter Scheiben und anderen Hirnregionen angepasst werden.
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Protocol
Tierethikerklärung:
Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien der Tierpflege von der University of Auckland und der Stanford University gegründet. P7 Rattenjungen wurden durch schnelle Enthauptung getötet. Hippocampus-Präparation wird dann sofort durchgeführt, wie unten beschrieben.
1. Organotypische hippokampalen Slice-Kultur
- Vorbereitung
- Bereiten Dissektion Medium (nur für das Gehirn sezieren verwendet wird). Kombinieren 200 ml Minimum Essential Medium mit 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-Pufferlösung, 2 ml 1 M Tris-Stammlösung (pH 7,2) und sterilfiltriert mit 0,22 um-Filter . Zuführen Hippocampus Dissektion in eiskaltem Dissektion Medium.
- Kühlen Sie die Dissektion Medium. Platzieren Sie die Dissektion Medien im Gefrierfach etwa 1 Stunde vor dem Beginn der Präparation, bis die Flüssigkeit sehr kalt ist. Sie ermöglichen große Eis cr nichtystals zu bilden. Lagerung auf Eis, bis sie benötigt.
- Bereiten Kulturmedium (für alles verwendet, außer Dissektion der Hippocampus). Kombinieren 100 ml Minimum Essential Medium (1x Konzentration, Flüssigkeit) w / Hank-Salze, W / L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (flüssig, 10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M Puffer Lösung, 50 ml Hanks Balanced Salt Solution, 50 ml Pferdeserum (definiert, Hitze inaktiviert) und Filter zu sterilisieren mit 0,22 um Filter.
- Bereiten Sie die Kulturschalen. Platz 1 ml Kulturmedium pro 35 mm Kulturschale, und fügen Sie eine Membraneinsatzes zu jedem Gericht. Zu sieben dieser Gerichte Aufmachungen in eine 150 mm Petrischale (bezeichnet als "Platte" genannt). Die Platte wird in einem CO 2-Inkubator für mindestens eine Stunde, bevor die Dissektion beginnt, so dass das Kulturmedium in den Gerichten erreicht die richtige Temperatur und pH-Wert.
- Präparation der Hippocampi von Rattenjungen am postnatalen Tag 7 (P7)
- Pre-sterilisieren alle Dissektionswerkzeuge unter UV-Licht vor dem Eingriff.
- Nach schneller Enthauptung, entfernen Sie das Gehirn und Ort in gekühlte Medium in eine Schüssel, und entfernen Sie sie dann auf ein Stück feuchten Filterpapier für die Dissektion. Necken die Rinde vom Mittelhirn mit stumpfen glatten Kunststoff-beschichtet Miniatur-Spatel, Aussetzen des Hippocampus. Schneiden Sie das Scheidengewölbe, und dann sanft zu arbeiten den Spatel unter dem Hippocampus, sie ausflippen (Abbildung 1A).
HINWEIS: Erfolgreiche Schnittkulturen kann mit Tieren bis P10 hergestellt werden. - Schneiden Sie die isolierten Hippocampus weg vom Rest des Gehirns. Übertragen Sie die hippocampi in eine neue Kaltschale mit Dissektion Medien mit einem angefeuchteten weichen Pinsel (zB weiß Zobel # 4).
- Reinigen Sie die Unterseite (dh der flacheren Seite) des Hippocampus von Plexus bei der Präparation, da diese schwammig, meninge artigen Gewebe machen es schwierig, Hippocampus trennenScheiben voneinander später.
HINWEIS: Lassen Sie diese Gewebe an Ort und Stelle, wenn sie nicht entfernt sanft gehänselt werden. - Führen Sie die gesamte Präparation so schnell wie möglich, ohne den Hippocampus.
HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist wichtiger als ein schnelles, solange die Versuchsbedingungen gekühlt werden. Schneiden Sie die hippocampi von drei Ratten gleichzeitig. Die Scheibe Gesundheit nicht beeinträchtigt wird, solange die Gesamtzeit vom Start bis zum, wenn die plattierten Scheiben in den Brutschrank gehen, ist unter 30 min.
- Slicing
- Schneiden Sie die hippocampi quer in 400 um Querschnitte mit einem manuellen Gewebeschneidemaschine. Das Verfahren, mit dem die Schneiddurchgeführt wird, nicht wichtig, so lange es nicht allzu schädlich für das Gewebe und erzeugt Scheiben mäßige Dicke mit gut sichtbaren Schichtarchitektur (dh Ammons ist leicht zu sehen, um in dem Gewebe erhalten werden).
- Liegen die hippocampi auf der Bühne des GewebesChopper auf der Spitze eines dreifache Dicke der # 2-Filterpapier. Der Hippocampus sind vollständig, ohne irgendwelche Scheiben einzeln (; eher wie Laibe Brot in Scheiben geschnitten an dieser Stelle; 1B dh die gesamte Hippocampus ist auf der Bühne des Häckslers nach links, bis alle Schnitte vorgenommen wurden) in Scheiben geschnitten.
- Übertragen Sie die hippocampi in Dissektion Medium mit einem weichen Pinsel zu jedem Hippocampus fest nächsten (weiß Zobel # 2). Drücken Sie vorsichtig jeweils Hippocampus zur Seite, um die Haftung zwischen dem Hippocampus und dem zugrunde liegenden Filterpapier brechen. Rollen Sie die Bürste unter jedem Hippocampus, um ihn abzuholen von der Bühne. Legen Sie alle hippocampi in den gleichen 35 mm Petrischale von gekühlten Dissektion Medium. Trennen Sie die hippocampi in einzelnen Scheiben durch manuelles Bewegen der Schale in Wechselstrom und gegen den Uhrzeigersinn Bewegungen.
- Überprüfen Sie die Scheiben unter einem Binokular und entsorgen Sie alle, die beschädigt sind, klein, bzw. nicht deutlich sichtbar Zelle besitzenKörperschichten.
HINWEIS: Es wird oft der Fall, dass nicht alle Schichten erfolgreich von ihrer Geschwister auf diese Weise getrennt werden. In diesem Fall können sie, indem sie sie auf der Kante und Drängen sie mit den Spitzen der feinen Pinzette abgetrennt werden. "Gut" Scheiben werden dann mit einem anderen sauberen Petrischale mit gekühltem Dissektion Medium unter Verwendung eines abgeschnitten und feuerpolierten Pasteurpipette (1C-E) übertragen.
- Lagerung
- Legen Sie die einzelnen Scheiben auf die Membranfilter-Einsätze. Mit einer Pasteurpipette abgeschnitten und Feuer poliert, um eine größere Bohrung geben, individuell Scheiben Transfer zu den Kultur-Einsätze.
HINWEIS: Die Größe der Bohrung erzeugt wird, wenn das Schneiden und Feuerpolieren der Pipette ist wichtig. Zu klein und die Scheiben nicht so schnell verlassen die Pipette für die Membran. Zu groß, und die überschüssige Flüssigkeit auf der Oberfläche der Membran zusammen mit der Scheibe platziert. Die beste Bohrungsdurchmesser ist in der Regel etwa die Hälfte der diamMesser des Zylinders der Pipette. Beim Schneiden kann dieser Durchmesser durch Schneiden an der richtigen Stelle auf dem Kegel der Pipette gewählt werden. - Slice Überweisung
- Füllen Sie die Pipette mit Medium zuerst, und dann saugen eine einzelne Scheibe mit kleinen Saugkraft. Dies hält die Scheibe in der Nähe der Öffnung der Pipette und verhindert, dass zu viel Medium Vertreibung in den Einsatz, um die Scheibe zu platzieren.
- Tragen Sie einen leichten Druck auf die Lampe, um einen kleinen hängenden Tröpfchen zu bilden, damit die Scheibe in diese Tröpfchen zu regeln, und berühren Sie diese Tröpfchen an der Membran und lassen Sie die Scheibe "Fall" auf die Membran. Regel drei Scheiben werden auf jeder Membran Einsatz gelegt.
Hinweis: Wenn der Flüssigkeitströpfchen zu groß ist, werden die Tröpfchen von den drei Scheiben neigen dazu, auf der Membranoberfläche zu verschmelzen, und die Scheiben werden somit alle mit der Mitte der Membran zu sammeln, so dass es schwierig ist, sie für elektrophysiologische Aufzeichnung später zu trennen.
- Flüssigkeit Removal
- Saugen Sie überschüssiges Medium aus der Spitze der Kulturplatte Einsatz für alle Scheiben in dieser Platte (3 Scheiben pro Einsatz = 21 Scheiben pro Platte), so dass Scheiben sind nicht eingetaucht oder durch einen Pool von Dissektion Medium umgeben.
- Führen Sie dies mit einer ungeschnittenen, aber feuerpolierten Pasteurpipette. Lassen Sie die Scheibe, um sich niederzulassen und sich an die Membran für eine Minute vor dem Pipettieren. Achten Sie darauf, die Scheibe bis in die Pipette zu saugen. Durchführung des Flüssigkeitsentzugs für die Einsätze, die zuerst vernickelt werden, um genügend Zeit für die Scheiben absetzen können.
- Scheibe Lagerung
- Speicher Scheibe Kulturen in einem 5,0% CO 2 Inkubator bei 37 ° C aufweist. Beachten Sie die endgültige Anordnung der Kulturen in 1E. Die einzelnen Scheiben ruhen auf einer Kulturplatte Einsatz, der eine poröse Membran eine Unterseite hat, und dieser Einsatz passend in einer Petrischale mit einer kleinen Menge an Medium gefüllt ist; auf diese Weise werden die Scheiben nicht in der mir eingetauchtdium, aber keinen Zugriff auf sie nur durch die Membran am Boden des Kulturplatteneinsatz.
- Optional, entfernen Sie die Scheiben kann für das Studium entweder durch Entfernen des Kulturplatteneinsatz oder durch Ausschneiden eines Abschnitts des Einsatzes Membran, die eine Scheibe.
- Legen Sie die einzelnen Scheiben auf die Membranfilter-Einsätze. Mit einer Pasteurpipette abgeschnitten und Feuer poliert, um eine größere Bohrung geben, individuell Scheiben Transfer zu den Kultur-Einsätze.
- Wartung
- Tauschen Sie das Medium in den Petrischalen der Tag nach der Herstellung Kulturen. Übertragen der Kulturplatte einfügen, um eine neue Petrischale mit 1 ml frisches Kulturmedium, das in dem Inkubator für mindestens eine Stunde vor der Übertragung ins Gleichgewicht gebracht wird.
- Ändern das Medium wieder in der gleichen Weise am dritten Tag nach der Herstellung Kulturen. Am dritten Tag, übertragen Sie die Kulturen zu einem Brutschrank bei 34 ° C eingestellt. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche (alle 3-4 Tage).
- Identifizieren gesunden Kulturen. Wählen Sie gesunde Kulturen für gepaarte ganze Zelle Aufnahmen.
HINWEIS: Gesunde Kulturen haben eine gut definierte Kante und eine klar definierte pyramidalen Zellschicht. Kulturen Witzh dunkel (wahrscheinlich nekrotischen) Flächen vorhanden sind oder ein vakuolisiertes Aussehen mit abgeflachten Grenzen zurückgewiesen werden. Der Einsatz dieser Kriterien sind in der Regel zwei Drittel der Schnittkulturen ausreichend gesund für die Aufnahme. - Nutzen Sie diese Kulturen in einem ziemlich kleines Zeitfenster. Nicht verwendeten Gewebe, die für mehr als zwei Wochen kultiviert werden, da die Nervenzellen beginnen, leicht epileptiforme Verhalten, das sich langsam verschlechtert sich mit der Zeit zeigen. Die genaue obere Grenze der neuronalen Überlebens ist nicht bekannt, aber es ist möglich, von dem Funktionieren Pyramidenzellen so spät wie 16 Wochen Kultur zu erfassen.
2. Gepaart ganze Zelle Recordings
- ACSF und der intrazelluläre Lösungen
- Vorbereitung präsynaptischen Elektrodenlösung durch Mischen (in mM) 120 Kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit KOH; Osmolarität: 290 mOsm). Während der gleichen Elektroden Lösung wird postsynaptischen Neuronen, Cäsium-Gluconat verwendet (120 mM) Wird in der Regel als Haupt Salz in der postsynaptischen Elektrode, plus 5 mM QX314 eingesetzt.
HINWEIS: Diese ermöglicht eine stabile Spannungsklemm bei positiven Potentialen zu postsynaptischen NMDAR-vermittelten Ströme 8-10,13 aufzeichnen. Es verhindert auch das Kalium-induzierten Übererregbarkeit des präsynaptischen Neurons durch die interne Lösung aus der postsynaptischen Aufzeichnungselektrode fließt, bevor ein Giga-Ohm-Dichtung gemacht. - Vorbereitung postsynaptischen Elektrodenlösung Zusammen (in mM) 120 Cäsium-Gluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit CsOH, Osmolarität: 290 mOsm). Ziehen Glasmikroelektroden 5-10 MOhm Widerstand und füllen mit gefiltertem interne Lösung.
- Vorbereitung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Komposition (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 Glucose, pH 7,4, mit 95% O 2, 5 gesättigte % CO 2. HINWEIS: Wenn AMPAR-vermittelte rAHMEN müssen für die Prüfung der NMDAR EPSCs blockiert werden, gehören 10 uM CNQX oder NBQX in der ACSF.
- Vorbereitung präsynaptischen Elektrodenlösung durch Mischen (in mM) 120 Kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit KOH; Osmolarität: 290 mOsm). Während der gleichen Elektroden Lösung wird postsynaptischen Neuronen, Cäsium-Gluconat verwendet (120 mM) Wird in der Regel als Haupt Salz in der postsynaptischen Elektrode, plus 5 mM QX314 eingesetzt.
- Erhalten Gekoppelte ganze Zelle Recordings
- Synaptische Übertragung zwischen zwei einzelnen Neuronen zu untersuchen, bezeichnen ein Neuron als der präsynaptischen Neuron und halten in Stromzange an Aktionspotentiale auslösen und initiieren die synaptische Übertragung.
- Bestimmen Sie die zweite Neuron, wie der postsynaptischen Neuron, und halten Sie sie in Strom oder Spannung Klemme abhängig von der vom Forscher erforderlichen Informationen. Erhalten detaillierte Untersuchung der glutamatergen Strömungen, bei -65 mV mit sucht AMPAR-vermittelte EPSCs und NMDAR-vermittelte EPSCs bei +30 mV 6-16 sucht, indem die postsynaptischen Neuron in Spannungsklemme
- Stellen Sie eine gepaart Aufnahme. Um eine Aufnahme zu etablieren gepaart wird der präsynaptischen Zelle ganze Aufnahme immer zuerst gewonnen, so dass mehrere aufeinander folgende postsynaptischen Neuronen, bis eine, die synaptisch ist connecte erhalten werdend erhalten wird. Bei Durchführung der synaptischen Plastizität Experimente ist es besonders wichtig, das präsynaptische Neuron zuerst als die Induktion von LTP in dem postsynaptischen Neuron müssen innerhalb von 10 min zum Erhalt der ganzen Zelle Aufnahmen Auswaschen der cytoplasmatischen Faktoren für LTP 8,19 erforderlich verhindern eingeleitet werden erhalten.
- Vermeiden Sie Bewegung induzierten Zellverlust. Eine große Herausforderung bei der Durchführung gepaart ganze Zellableitungen wird die Vibration und Bewegung-induzierte Störung der ersten ganzen Zelle Aufnahme während den Erhalt der zweiten Aufnahme zu vermeiden.
- Erhalten die ersten Ganzzellaufnahme und bewegen Sie dann den Mikroskop-Objektiv 10-200 um in der x-Achse, so dass die etablierte Aufzeichnung wird am Rand der Fläche auf dem Monitor (2A) sichtbar entfernt.
- Heben Sie die Linse des Mikroskops ~ 5-10 mm, während sichergestellt wird, dass die ACSF noch Kontakt mit der Linse hält. Montieren Sie die zweite Elektrode und führen in die Flüssigkeit Meniskus (2B
- Bewegen der Elektrode in der xy-Ebene, bis er sich direkt unter der Lichtweg durch die Linse, aber immer noch deutlich über dem festgelegten Aufzeichnungselektrode. Sobald die Elektrode unter dem Mikroskop sichtbar ist, sicherzustellen, dass die Spitze am äußersten Rand des Monitors von der ersten Elektrode.
- Bewegen Sie die zweite Elektrode in Folge mit dem Mikroskop Fokus, bis beide Elektroden in der gleichen Brennebene sind. Es ist wichtig, dass das Niveau der Überdruck ist stark genug, um Spitzen Blockade zu vermeiden, aber nicht zu stark, so dass die erste ganze Zelle die Aufnahme zu unterbrechen. Dies führt zu dem positiven Druck zu induzieren Bewegung in 2-3 Neuronen von der Elektrode beim Eintritt in die erste Scheibe.
- Suchen Sie eine postsynaptischen Partner in einer ähnlichen Brennebene mit dem ersten präsynaptischen Aufnahme (Abbildung 2C). Die Aufnahme wird in der Regel gepaart Obtain Aufnahmen zwischen CA3 Pyramidenzellen der zweite ganze Zelle aus einer 0-200 mm Neuron der ersten recording (2C, D).
HINWEIS: Synaptische Übertragung zwischen Nervenpaare sind über Zeiträume von bis zu 3-4 Stunden stabil, wenn über diese Standard-Ganzzellaufnahmetechniken.
- Synaptische Plastizität: Es war einmal eine erfolgreiche Gewinnung synaptisch verbundenen Pyramidenzelle Paar (3A, B), untersuchen die Eigenschaften der synaptischen Übertragung und Plastizität.
- LTP Induktion.
- LTP zu induzieren durch Paarung präsynaptischen Aktionspotentiale (1 Hz) mit postsynaptischer Depolarisation auf -10 bis 0 mV für 1 min (3C) 7-9,12-14. Initiieren Sie die Kopplung innerhalb von 10 min von Einbruch in der postsynaptischen Neuron.
HINWEIS: LTP kann auch mit beiden Neuronen Stromklemme durch Paarung präsynaptischen und postsynaptischen Aktionspotentiale bei 1 Hz für 1 min, mit postsynaptischen Aktionspotentiale induziert werden gehalten ausgelöst 10 msec nach der Injektion von Strom in die präsynaptischen Neuron 8
- LTP zu induzieren durch Paarung präsynaptischen Aktionspotentiale (1 Hz) mit postsynaptischer Depolarisation auf -10 bis 0 mV für 1 min (3C) 7-9,12-14. Initiieren Sie die Kopplung innerhalb von 10 min von Einbruch in der postsynaptischen Neuron.
- Weitere induzieren LTD durch Niederfrequenzstimulation (LFS) bei 1 Hz in Kombination mit einer leichten Depolarisation der postsynaptischen Neuron auf -55 mV für 5-10 min (3C) 9.
- LTP Induktion.
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Representative Results
Synaptischer Verbindungen ist offensichtlich durch die Stimulation der präsynaptischen Neuron ein Aktionspotential, indem ein Stromimpuls depolarisiert (typischerweise 20-50 pA für 20 msec) über den Aufzeichnungselektroden ausgelöst. Die postsynaptischen Stromspur wird dann für das Vorhandensein einer monosynaptische EPSC sucht evozierte kurzfristig (<5 ms) und konsistente Latenzen nach dem Höhepunkt der präsynaptischen Aktionspotential (3A). In den meisten Experimenten mehrere postsynaptischen Neuronen getestet werden, bevor eine synaptisch verbundenen Paar erhalten werden. Insgesamt werden ca. 1/3 der präsynaptischen CA3 Zellen monosynaptisch an die postsynaptische Zelle CA3 durch ein aktives synaptische Verbindungen (3A) verbunden ist, und ungefähr 20% der CA3-Neuronen werden durch all-Stumm synaptischen Verbindungen 6,8 verbunden.
Die Amplitude der Grundlinie AMPA-Rezeptor vermittelten Ströme ist variabel von Versuch zu Versuch in einem gekoppelten Aufnahme, und auch zwischen unabhängigen paiRot-Aufnahmen (3B) 6,8. Durchschnittliche AMPAR EPSC Amplitude im Bereich von <10 pA bis> 800 Pa und wahrscheinlich ergibt sich aus Unterschieden in der Anzahl der funktionellen Synapsen zwischen gepaart Aufnahmen. Ausfallraten wurden auch beobachtet, dass deutlich zwischen gepaarten 6,7 Aufnahmen paarweise durch aktive Synapsen 6,7 verbunden sind unterschiedlich und reichen von 100% AMPAR EPSC Ausfallraten bei stillen Synapsen, um 0-95% Ausfallraten. Innerhalb der einzelnen Aufnahmen gepaart, aufgetreten synaptischen Ausfälle, vor allem in Aufnahmen mit kleineren Amplituden AMPAR EPSC. Die Variabilität in AMPAR EPSC Amplitude ist offensichtlich von Versuch zu Versuch in den Rohdaten (3B) ist wahrscheinlich auf Schwankungen in Quantenzahl von Versuch zu Versuch freigesetzt, wie bei anderen Synapsen 6 auftritt.
Dual ganze Zelle Aufnahmen bieten auch direkten Zugang sowohl zum Pre-und postsynaptischen neuronalen Zytoplasma, so dass pharmakologische manipulatIon entweder / sowohl in den präsynaptischen und postsynaptischen Zellen über den Aufzeichnungselektroden 6. Typischerweise sind präsynaptischen pharmakologische Manipulationen sehr schnell (innerhalb von 10 min). Dies ist nicht auf kleine Moleküle (zB BAPTA) begrenzt, wie fluoreszenzmarkierte Dextrane können präsynaptischen ≤200 um weg von der Aufzeichnungselektrode zu gelangen. Daher könnte Analyse ähnlich wie bei der Tintenfisch Riesensynapse 25 durchgeführt, um Studien der synaptischen Vesikel-Freisetzung Maschinen in der Hippocampus-Scheibe erweitert werden. Die Position der spezifischen Synapsen in den gepaarten Messaufnahmen nicht in der Aufzeichnung identifiziert. Daher gegenüber der proximale distale Websites der Synapsen kann nicht so leicht wie lokale Stimulation mit extrazellulären Stimulationselektroden oder Brenn Glutamat Anwendung beurteilt werden. Allerdings kann Farbstoff Füllung jedes einzelnen Neurons während der Aufnahme gepaart morphologische Rekonstruktion des axonalen Lauben und Potenzial synaptischen Websites ermöglichen LTP und LTD zuverlässig bei CA3-CA3 Synapsen in diesem Kultursystem (3C) induziert, und beide Formen der Plastizität letzten für die Dauer des gesamten Zellaufnahmen (über 2 h). Die verwendeten LTP und LTD Induktion Paradigmen sind identisch mit denen in der akuten Scheiben und LTP und LTD weisen die Eigenschaften von NMDAR-Abhängigkeit, Assoziativität und Pathway-Unabhängigkeit, und daher diese Kombination von Kultursystem durchgeführt wird und gepaart Aufnahmen bietet eine wertvolle Modellsystem zu untersuchen synaptischen Plastizität 7. Polysynaptischen hemmende Ereignisse werden häufig in Aufnahmen gepaart zwischen CA3 Pyramidenzellen Paare (3D) beobachtet. Wir wissen nicht pharmakologisch blockieren diese GABAergen Hemmung wie dies erzeugt sehr störend Hyperaktivität. Jedoch aufgrund der längeren Latenz dieser polysynaptic inhibitorische Ereignisse sie in der Regel nicht verhindern Messung der monosynaptische excitatory Strom. Wenn die inhibitorische polysynaptic Ereignisse beobachtet, mit der aktuellen monosynaptische stören, Verschleierung der Spitze des monosynaptische Strom müssen diese Paare aus der Analyse ausgeschlossen werden. Polysynaptischen erregende Verbindungen werden auch manchmal beobachtet, sind aber deutlich weniger verbreitet und werden auch von der Analyse ausgeschlossen. Selten wird eine hemmende synaptische monosynaptische Strom aufgrund der präsynaptischen Neuron eine hemmende Intern erhalten. Dies wird leicht durch die fehlende Aufnahme von neuronaler Aktivität in Reaktion auf längere (1 sec) Stromeinprägung ermittelt. Dies ist in postsynaptischen Neuronen in dem die interne Lösung Cäsium Gluconat Basis nicht möglich. Jedoch, wie Neuronen identifiziert visuell vor der Aufnahme in unserer Erfahrung in diesem Fall <1% der Zeit. Inter in organotypischen Hippocampus leicht visuell durch ihre Nicht-Pyramidenzellen Körper vor allem im Stratum radiatum und oriens identifiziert. Daher ist diese preparation ermöglicht auch Aufnahmen von Intern erregenden und hemmenden Strömungen. Jedoch ist sehr wenig über die inhibitorische Netzwerke in organotypischen Scheiben bekannt, ob sie Verbindung ähnlich der in dem Gehirn zu erhalten, ist nicht klar. 
Abbildung 1. Herstellung der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen. (A) Der Hippocampus, in situ, durch die gestrichelte Linie dargestellt. Um den Hippocampus zu entfernen, werden die Verbindungen zu den Fornix trennt und der Hippocampus sanft gerollt aus dem Gehirn. (B) Hippocampi werden auf der Stufe der Schneidemaschine auf der Oberseite des Filterpapiers positioniert. (C) Hippocampusschnitten über den breiten über Bohrung einer Pasteur-Pipette, um Schäden zu verhindern. (D) Beispiele für "gute" gegen "schlechte" Scheiben schneiden.(E)-Karikatur von Schichtaufbau auf Membranen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2. Gewinnung gepaart ganze Zelle Aufnahmen von Hippocampus-Neuronen CA3. Sequential Bilder der Erreichung eines gepaart Aufnahme, welche optimale Elektroden und neuronalen Positionierung. (A) Nach Erhalt des ersten ganzen Zelle die Aufnahme der Mikroskop 10-200 mm bewegt in der x- Achse, so daß die fest Aufnahme (Pfeil) an der Kante des Bereichs auf dem Bildschirm sichtbar angeordnet. Maßstab:. 25 um (B) Um Platz für die zweite Elektrode zu ermöglichen, wird die Linse des Mikroskops dann hob ~ 5-10 mm, sicherzustellen, dass die immer noch mit ACSF hält Kontaktdie Linse. Um die zweite Elektrode gewährleisten nicht die anderen Aufzeichnungselektrode stoßen, die zweite Elektrode in der x-Achse bewegt, bis es direkt unter dem Lichtpfad durch die Linse, aber immer noch deutlich über dem festgelegten Aufzeichnungselektrode. (C) Gegründet gepaart Aufnahme zeigt beide Elektroden (Pfeile) in der gleichen Brennebene. Maßstab:. 25 um (D) Gepaart Aufnahme von benachbarten Neuronen CA3 in einem transgenen Tier, das die EGFP-positiven Neuronen auf der RHS. Maßstab:. 20 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3. Die synaptische Transmission und Plastizität zwischen CA3-CA3 Pyramidenzellen Paaren. (A) Beispiel PResearch-und postsynaptischen Spuren von einem gekoppelten Aufnahme zwischen zwei CA3 Pyramidenzellen. In Reaktion auf einen Stromimpuls 20 sec bis präsynaptischen Aktionspotentiale auszulösen, die postsynaptischen AMPAR vermittelte Strom (bei -65 mV aufgezeichnet) erfolgt eine direkte Reaktion auf das Aktionspotential (B) Links: variiert die Amplitude AMPAR vermittelte EPSCs. nicht nur zwischen gepaarten Aufnahmen, aber auch von trial-to-trial in einem gekoppelten Aufnahme. Jeder Versuch stellt die Amplitude des EPSC gemessen bei 0,1 Hz liegt. In diesem Beispiel schwankt AMPAR EPSC Amplitude von 5 pA> 60 Pa. Rechts: NMDAR EPSC Amplituden bei +40 mV in Gegenwart von 10 uM CNQX gemessen. NMDAR EPSC Amplituden sind in der Regel in der Amplitude deutlich kleiner, dass AMPAR EPSCs, zeigen aber noch erhebliche Variabilität. NMDAR EPSC Amplitude typischerweise im Durchschnitt zwischen 10-20 pA paar Aufnahmen zwischen CA3 Pyramidenzellen, so dass Ausfälle leicht identifizierbar (C) Links:. CA3 Pyramidenzellpaare Ausdruck LTP, die für die Länge des gepaarten Aufzeichnungs besteht. LTP ist durch einen Anstieg in der Amplitude des AMPAR EPSCs leicht ersichtlich. Aussagekräftige Studie zu Studie Variabilität in der AMPAR EPSC Amplitude bleibt nach der Induktion von LTP. Rechts: Die Expression von Langzeitdepression (LTD) zwischen CA3 Pyramidenzellen. Beachten Sie die Abnahme der durchschnittlichen Amplitude des AMPAR EPSC und gleichzeitige Abnahme der Versuch zu Versuch Amplitudenvariabilität. (D) Beispiel postsynaptischer polysynaptic inhibitorische Ströme, die bei einer längeren Latenzzeit ist im Vergleich zur monosynaptische AMPAR EPSC. Wenn der postsynaptischen Neuron Spannung bei -65 mV geklemmt, die polysynaptic Ströme bei einer Latenzzeit von> 5 ms nach dem Höhepunkt der präsynaptischen Aktionspotential als zweite Peak sichtbar. Halten der postsynaptischen Neuron bei -30 mV bestätigt, dass der Strom ist polysynaptischen hemmende aufgrund der Umkehrung der Stromrichtung.ES.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Tabelle 1. Mögliche Probleme, die sich paarweise Aufnahmen und die Vorbereitung der organotypischen Kulturen. Hier werden gemeinsam mögliche Probleme, die mit gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen Kulturen auftreten. Darüber hinaus haben wir auch darauf hinweisen, dass viel Zeit ist erforderlich, um ausgegeben zu werden "fahren" die Elektrophysiologie-Setup für gepaarte Aufnahmen, wie die meisten Probleme sind auf die Bewegung Störungen, die leicht sichtbar gemacht und behoben werden können, zusammen.
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Discussion
Hier haben wir die Voraussetzungen für die Gründung erfolgreich gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen beschrieben. Gepaart Aufzeichnungen können auch in mehreren Präparaten, einschließlich akute Scheiben und dissoziiert Kultursysteme 26,27 durchgeführt werden. Während der Fokus hier ist auf die Induktion von mehr Formen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD nämlich) gewesen ist, ist es wichtig zu betonen, dass gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen, akute Scheibe und dissoziierte Zellpräparaten haben wichtige Einblicke in Quantengröße, eine Kurz -term Plastizität, präsynaptischen Funktion sowie LTP und LTD 2,4,8,26,27.
Der Hauptvorteil der organotypischen System ist das bessere Anbindung zwischen den Neuronen. Synaptischer Verbindungen in der akuten Schnittpräparat ist die geringe aufgrund der Durchtrennung des axonalen Verbindungen während Schnittpräparat. Nach unserer Erfahrung gepaart Aufnahmen von synaptisch connected CA3 Neuronen in akuten Scheiben waren in nur ~ 5% der erhaltenen Aufnahmen gepaart möglich. Das heißt, 95% der Aufnahmen gepaart waren nicht an. Eine Alternative ist die Verwendung von primären hippocampalen Kulturen dissoziiert, wo synaptischer Verbindungen deutlich höher 26. , Mit dissoziierten kultiviert Vorbereitungen kommen jedoch Fragen zu Neuron Identität und ob ihre Eigenschaften sind vergleichbar mit denen der reifen Synapsen im nativen Gewebe. Die Verwendung von organotypischen hippocampalen Schnittkulturen teilweise mildert diese Probleme, weil neuronalen Subtypen können leicht durch gekennzeichnet, und die Zellen halten Morphologie und Konnektivität, die ähnlich zu nativem Hirngewebe 20 sind. Als Scheiben in vitro über eine Woche erhalten, ist es jedoch wichtig zu beachten, dass signifikante axonale Wachstum während dieser Zeit auftritt. Die daraus resultierende Erhöhung der Konnektivität ist sehr vorteilhaft für die Durchführung gepaart Aufnahmen, die synaptische Funktion und Plastizität zu untersuchen, aber es solltestellte fest, dass Studien, die die Netzwerkverbindung möglicherweise nicht geeignet für diese Vorbereitung sein werden.
Während der Großteil unserer gepaart Aufnahmen wurden auf CA3-CA3 Pyramidenzellpaare durchgeführt wurden, kann diese Technik leicht zu CA3-CA1 und Gyrus dentatus-CA3 angepasst gepaart Aufnahmen werden. Die Inzidenz von synaptischen Verbindungen zwischen Gyrus dentatus und CA3 pyramidalen Neuronen in diesem System ist wesentlich geringer. Allerdings monosynaptische erregende Verbindungen zwischen CA3 und CA1 in diesem System wurde berichtet, so hoch wie 76% 28 zu sein.
Darüber hinaus sind gepaart Gesamtzellaufzeichnungen routinemäßig in Hippocampus-Gewebe der Maus durchgeführt, einschließlich transgenen Mäusen (Figur 2D), 29-31. Die Technik kann weiter verfeinert werden, um die synaptische Übertragung und Plastizität zwischen den Neuronen mit Mosaik Genexpression 30 aufzunehmen. GFP Kennzeichnung von Wildtyp-Neuronen ermöglicht eine gezielte gepaart ganze Zellableitungen in Neuronen of bekannten Genotyps. Diese Experimente haben Veränderungen in der synaptischen Verbindungen zwischen einzelnen Nervenzellen, einschließlich Hyperconnectivity oder asymmetrisch präsynaptischen Funktion 30,31, die bei diesen Tieren beobachtet Verhaltensdefiziten beitragen können, identifiziert.
Zusammenfassend erhöhen gepaart ganze Zellableitungen die Möglichkeit, elektrophysiologische Eigenschaften der synaptischen zu interpretieren und die subzellulären Mechanismen, die Neuronen verwenden, um synaptischen Stärke verändern zu bestimmen. Mit dieser Technik hat es ermöglicht, direkt getestet werden die Vorhersagen der prä-und postsynaptischen Modelle der synaptischen Plastizität. Darüber hinaus haben der Phänotyp der stillen Synapsen, und spezifische Aufgaben der aktiven Zone und PSD-Proteine auch in dieser Zubereitung 6-16 beschrieben. Es ermöglichte auch die Entdeckung, dass Synapsen in verschiedenen elektrophysiologisch definierten Zuständen existieren, und dass während der synaptischen Plastizität Synapsen zwischen diesen Zuständen 9,17 bewegen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
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