Introduction
קולטני גלוטמט לתווך רוב שידור סינפטי מעורר בסינפסות במערכת עצבים מרכזית. שני תתי הסוגים העיקריים של ionotropic קולטני גלוטמט המקומי בראש עמוד השדרה של קרום postsynaptic הם N-methyl-D-aspartate (NMDA) וα-אמינו-3-הידרוקסי-5-methylisoxazole-4-proprionic חומצת קולטנים (AMPA). בנחים פוטנציאלי קרום, קולטני AMPA לשאת רוב הנוכחי postsynaptic במהלך שידור סינפטי. בהיפוקמפוס, רצפטור NMDA ממלא תפקיד מרכזי בגרימת שינויים במספר הקולטנים AMPA בממברנה postsynaptic: על ידי מתנהג כמו "גלאי צירוף מקרים" 1 ליזום שינויים בכוח הסינפטי 1, רצפטור NMDA משתתף במנגנונים סינפטיים כי הם חשבו כדי לחזק את למידה וזיכרון ברמת subcellular. בתגובה לשלילת קוטביות של הנוירון postsynaptic במקביל לשחרור משדר presynaptic, סידן נכנס דרך NMDAקולט ליזום הכנסת קולטן AMPA או הסרת 2. דינמיקת קולט אלה עומדת בבסיס פלסטיות סינפסה: עלייה בכח הסינפטי היא 2,3 הגברה לטווח ארוך (LTP), ואילו ירידה בכוח הסינפטי היא דיכאון לטווח ארוך 4 (בע"מ). לכן הוא חשב תנועת קולטן AMPA שיהיה אחראי לביטוי פלסטיות הסינפטית, ואילו קולטני NMDA הם חשבו לשלוט האינדוקציה שלה.
קביעת המנגנון המדויק שבבסיס שידור סינפטי ופלסטיות דורשת לימוד אוכלוסיות קטנות של סינפסות, באופן אידיאלי סינפסות בודדות. בעוד כמה סינפסות הן מאוד מתאימות למחקר ברמה זו, למשל, Calyx של הלד 5, לאוכלוסיות הסינפטי ביותר זה קשה מאוד בשל האופי הקטן ומפוזר של הקשרים סינפטיים. שתי טכניקות עיקריות אלקטרופיזיולוגיה פותחו כדי לבחון קשרים סינפטיים אחת: הראשון הוא גירוי מינימאלי, wherדואר סיב אחד presynaptic הוא בחזקת מגורה extracellularly. הטכניקה השנייה היא זיווג הקלטות, שבו שתי הקלטות תא כל בו זמנית מתא העצב מחובר synaptically מתבצעת. יתרון עיקרי של גירוי מינימאלי הוא שזה מהיר ופשוט יחסית לביצוע, הכולל מיקום של האלקטרודה מגרה תאית לתוך מערכת axonal בעת הקלטה בו זמנית מתא עצב postsynaptic. הדאגה העיקרית בעת השימוש בטכניקה זו היא שגירוי אמין של תא בודד יכול לעתים רחוקות להיות מובטח משפט אחרי המשפט.
במהלך חמישה עשר השנים האחרונות יש לנו בשימוש שיגרתי לזווג כל תא הקלטות משני נוירונים פירמידה מחוברים synaptically 6-17. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי רק אחד נוירון presynaptic מגורה באופן עקבי ואמין. זה גם מאפשר לא רק אפיון אלקטרו אלא גם מניפולציה תרופתית של נוירון presynaptic 6,18 </ Sup>. עם זאת, ההסתברות של קישוריות הסינפטית בין תאי העצב היא נמוכה, מה שהופך את זוגות מחוברים קשה להשיג 19. השימוש בתרבויות פרוסה מוח organotypic עוקפת את המכשול הזה כקישוריות הסינפטית יכול להקים מחדש במבחנה ויותר מכך את טבעו של הקישוריות וכתוצאה מכך הוא דומה לזה ברקמת מוח ילידי 20. בנוסף, תרבויות organotypic להביע LTP, בע"מ 7-10,12-15,21 וצורות נוספות של פלסטיות הסינפטית לטווח קצר כולל הנחיית לזווג דופק (PPF) ודיכאון (PPD) 6,22,23, המאפשרים למנגנוני פלסטיות ל יילמד בזוגות של תאי עצב. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה מפורטת הכרוכה בהשגת הצלחת הקלטות לזווג במערכת זו במבחנה. מידע זה בקלות יכול להיות מותאם למערכות ניסיוניות אחרות, כוללים פרוסות חריפות ואזורים אחרים במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת בעלי החיים אתיקה:
הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה לעקוב אחר הנחיות הטיפול בבעלי החיים שהוקמו על ידי אוניברסיטת אוקלנד ואוניברסיטת סטנפורד. גורי חולדה P7 היו מורדמים על ידי עריפת ראש מהירה. הנתיחה בהיפוקמפוס לאחר מכן ביצעה באופן מיידי כפי שיתואר להלן.
.1 Organotypic היפוקמפוס Slice תרבות
- הכנה
- הכן לנתיחה בינונית (משמש רק ללנתח המוח). לשלב 200 מ"ל בינוני Essential Minimum, 2 פתרון פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל (10,000 יחידות מכל, ב0.85% NaCl), 5 מ"ל פתרון HEPES חיץ, 2 מ"ל פתרון מניות 1 M טריס (pH 7.2), ומסנן לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן . לבצע נתיחה בהיפוקמפוס במדיום לנתיחה קרה כקרח.
- לקרר את המדיום לנתיחה. הנח את התקשורת לנתיחה במקפיא כ 1 שעות לפני תחילת הנתיחה עד שהנוזלים קרים מאוד. אל תאפשר cr קרח הגדולystals ליצירת. אחסן על קרח עד נדרשת.
- להכין מדיום התרבות (ששימש לכל דבר פרט לנתיחה של hippocampi). לשלב 100 מ"ל בינוני מינימום הכרחי, (ריכוז 1x, נוזל) w / המלחים של האנק, w / L-גלוטמין, 2 מ"ל תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין (נוזל, 10,000 יחידות מכל, ב0.85% NaCl), 2.5 מ"ל HEPES 1 M חיץ פתרון, 50 מ"ל תמיסת מלח מאוזן של האנק, 50 מ"ל סרום הסוס (שהוגדרו, חום מומת), ומסנן לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן.
- הכן את מנות התרבות. מניחים 1 מ"ל של תקשורת בתרבות לכל צלחת תרבות 35 מ"מ, ולהוסיף להוסיף קרום לכל מנה. לשים עד שבע המנות הללו לצלחת פטרי אחת 150 מ"מ (המכונה להלן כ 'צלחת "). מניחים את הצלחת בחממה CO 2 לפחות שעה לפני הנתיחה מתחילה כך שמדיום התרבות במנות משיג את הטמפרטורה וחומציות התקינה.
- Dissection של hippocampi מגורי חולדה ביום אחרי הלידה 7 (P7)
- טרום לעקר את כל הכלים לנתיחה תחת אור UV לפני ההליך.
- לאחר עריפת ראש מהיר, להסיר את המוח ומקום לתוך מדיום קר בצלחת אחת, ולאחר מכן הסר אותה כדי פיסת נייר סינון לח לנתיחה. להקניט את הקליפה מהמוח התיכון באמצעות מריות מצופים פלסטיק חלקים בוטות זעירות, החושף את ההיפוקמפוס. חותך את fornix, ולאחר מכן בעדינות לעבוד המרית מתחת להיפוקמפוס כדי להעיף אותו החוצה (איור 1 א).
ניתן להכין תרבויות פרוסה מוצלחת באמצעות בעלי חיים עד P10: הערה. - חתוך את ההיפוקמפוס המבודד משאר המוח. העבר את hippocampi לתוך צלחת חדשה המכילה תקשורת לנתיחה מקוררת באמצעות מכחול רך לח (למשל, # צובל לבן 4).
- נקה את הצד התחתון (כלומר בצד השטוח) של ההיפוקמפוס של מקלעת דמית העין במהלך נתיחה, כפי שרקמות כמו meninge-אלה ספוגיים, להפוך אותו קשים להפריד בהיפוקמפוספרוסות מזה בשלב מאוחר יותר.
הערה: השאר את הרקמות אלה במקום אם הם לא יכולים להיות הקניטו משם בעדינות. - לבצע את כל הנתיחה מהר ככל האפשר מבלי לפגוע בהיפוקמפוס.
הערה: לנתיחה זהירה חשובה יותר מהיר אחד, כל עוד תנאי הניסוי הם מקוררים. פורסים את hippocampi משלוש חולדות בו זמנית. בריאות הפרוסה אינה מושפעת כל עוד הזמן הכולל מתחילתו ועד מתי את הפרוסות מצופים ללכת לתוך החממה הוא תחת 30 דקות.
- חיתוך
- פורסים את hippocampi רוחבי ל400 מיקרומטר חתכים באמצעות מבצעה רקמה ידני. השיטה שבה החיתוך מתבצע היא לא חשובה, כל עוד זה לא יותר מדי מזיק לרקמה ומייצר פרוסות בעובי בקנה אחד עם ארכיטקטורת מינרית גלויה בקלות (כלומר הורן של עמון נתפסים בקלות ליישמר ברקמה).
- לשקר hippocampi על הבמה של הרקמהמסוק על גבי עובי משולש של נייר סינון המס '2. Hippocampi פרוסה לחלוטין מבלי להסיר כל פרוסות בנפרד (כלומר כל ההיפוקמפוס נשאר על הבמה של המסוק עד שכל הקיצוצים שנעשו, אלא כמו כיכרות לחם פרוס בשלב זה; איור 1).
- העבר את hippocampi למדיום לנתיחה באמצעות מכחול רך הונח ליד כל ההיפוקמפוס (# צובל לבן 2). דחף בעדינות כל היפוקמפוס בצד כדי לשבור את ההדבקה בין ההיפוקמפוס ונייר הסינון הבסיסי. גלגל את המברשת מתחת לכל ההיפוקמפוס כדי להרים אותו מהבמה. מניחים את כל hippocampi לאותה צלחת פטרי 35 מ"מ של מדיום לנתיחה מקורר. הפרד את hippocampi לפרוסות בודדות על ידי התססה ידנית הצלחת לסירוגין תנועות בכיוון השעון ונגד כיוון שעון.
- בדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ לנתח ולסלק כל שניזוקו, קטן, או שאין לי תא נראה בבירורגוף שכבות.
הערה: לעתים קרובות זה יהיה המקרה שלא כל פרוסות מופרדות בהצלחה מהאחים שלהם בצורה זו. במקרה זה, הם יכולים להיות מופרדים על ידי הפיכה אותם על קצה ודוחף אותם בקצות מלקחיים בסדר. לאחר מכן פרוסות "טובות" מועברות למשנהו צלחת נקייה פטרי המכילה מדיום לנתיחה מקורר באמצעות פיפטה פסטר מנותקת ואש מלוטשת (איורים 1 ג-E).
- אחסון
- מניחים את הפרוסות בודדות על מוסיף מסנן קרום. בעזרת פיפטה פסטר מנותק ואש מלוטשת לתת משעמם גדולה יותר, באופן אישי להעביר את הפרוסות לתרבות מוסיף.
הערה: הגודל של שעמם נוצר בעת החיתוך וליטוש פיפטה האש היא חשובה. גם קטן והפרוסות לא בקלות לעזוב את פיפטה לממברנה. נוזל גדול מדי ועודף ממוקם על פני השטח של הקרום יחד עם הפרוסה. קוטר הקדח הטוב ביותר הוא בדרך כלל כמחצית מהקוטרeter של החבית של פיפטה. בעת החיתוך, ניתן לבחור בקוטר זה על ידי חיתוך במקום הנכון בלהתחדד של פיפטה. - העברת Slice
- מלא את פיפטה עם המדיום ראשון, ולאחר מכן למצוץ את פרוסה אחת עם כוחות יניקה קטנים. דבר זה שומר את הפרוסה ליד הפתח של פיפטה ומונע יותר מדי גירוש בינוני להוספה למקום הפרוסה.
- החל לחץ קל על הנורה כדי ליצור טיפה תלויה קטנה, לאפשר לפרוסה להתיישב לתוך אגל ש, ולאחר מכן גע טיפה שעל הקרום ולתת פרוסה "נפילה" על הממברנה. בדרך כלל שלוש פרוסות ממוקמות על גבי להכניס כל אחד קרום.
הערה: אם טיפת הנוזל גדולה מדי, הטיפות משלוש פרוסות נוטות להתמזג על פני השטח הקרום, ואת הפרוסות כולם ובכך לאסוף למרכז של הקרום, ולכן קשה יותר להפריד ביניהם להקלטת אלקטרו מאוחר יותר.
- Remov נוזלאל
- לשאוב כל מדיום עודף מהחלק העליון של להכניס את צלחת תרבות לכל הפרוסות בצלחת ש( 3 פרוסות לכל הכנס = 21 פרוסות לכל צלחת), כך שפרוסות אינן שקועים באו מוקפת בברכה של מדיום לנתיחה.
- לבצע את זה הוא עם שלא נחתך, אבל פיפטה פסטר אש מלוטשת. לאפשר הפרוסה להתיישב ולדבוק בקרום לרגע לפני pipetting. יש להיזהר שלא להתחנף לפיפטה פרוסה. לבצע הסרת נוזל למוסיף שהם מצופים ראשון, כדי לאפשר מספיק זמן לפרוסות להתיישב.
- Slice אחסון
- תרבויות פרוסה חנות ב.5.0% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. שים לב להסדר הסופי של התרבויות באיור 1E. פרוסות בודדות נשענות על הוספת צלחת התרבות שבה יש קרום נקבובי לתחתית, ועלון זה מתאים בתוך צלחת פטרי מלאה עם כמות קטנה של מדיום; על ידי זה אומר, פרוסות לא שקועים ביdium, אבל יש להם גישה אליו רק דרך הקרום בתחתית להוסיף צלחת התרבות.
- לחלופין, להסיר את הפרוסות רשאית למחקר או על ידי הסרת להוסיף צלחת התרבות או על ידי חיתוך קטע של קרום להכניס מכיל פרוסה.
- מניחים את הפרוסות בודדות על מוסיף מסנן קרום. בעזרת פיפטה פסטר מנותק ואש מלוטשת לתת משעמם גדולה יותר, באופן אישי להעביר את הפרוסות לתרבות מוסיף.
- תחזוקה
- להחליף הבינוני בצלחות פטרי ביום שאחרי מה שהופך את התרבויות. העבר את הכנס צלחת התרבות לצלחת פטרי חדש המכילה 1 מ"ל של מדיום תרבות הטרי שequilibrated בחממה במשך שעה לפחות לפני ההעברה.
- לשנות את המדיום שוב באותו אופן ביום השלישי לאחר ביצוע תרבויות. ביום השלישי, להעביר את התרבויות לחממה שנקבעה ב34 ° C. לשנות את המדיום פעמיים בשבוע (כל 3-4 ימים).
- לזהות תרבויות בריאים. בחר תרבויות בריאים להקלטות תא כל לזווג.
הערה: יש לי תרבויות בריאים קצה מוגדר היטב ושכבת תאי פירמידה ברורה. שנינות תרבויותכהה שעות (סביר להניח נימקי) אזורים בהווה או במראה vacuolated עם גבולות שטוחים נדחים. העסקת הקריטריונים אלה, בדרך כלל שני שלישים מתרבויות פרוסה הם מספיק בריאים להקלטה. - לנצל תרבויות אלה בתוך חלון קטן למדי של זמן. האם לא נעשה שימוש ברקמות שנמצאות בתרבית למשך יותר משבועיים מאז הנוירונים מתחילים להציג התנהגות מעט epileptiform שמחמירה לאט עם זמן. מדויק הגבול העליון של הישרדות עצבית אינו ידוע, אך ניתן להקליט מתפקוד תאים פירמידליים מאוחר ככל 16 שבועות בתרבות.
2 הקלטות תא כל מותאמים
- ACSF ופתרונות תאיים
- הכן פתרון אלקטרודה presynaptic על ידי ערבוב (במ"מ) גלוקונאט 120 אשלגן, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, ו0.3 NaGTP (pH 7.2 עם KOH; osmolarity: 290 mOsm). בעוד אותו פתרון האלקטרודה משמש לנוירונים postsynaptic, גלוקונאט צזיום (120 מ"מ) משמש בדרך כלל כמלח הגדול באלקטרודה postsynaptic, בתוספת 5 מ"מ QX314.
הערה: זה מאפשר הידוק מתח יציב בפוטנציאל חיובי להקליט זרמים בתיווך NMDAR postsynaptic 8-10,13. זה גם מונע את רגשנות היתר נגרם על ידי אשלגן של נוירון presynaptic ידי הפתרון הפנימי זורם מן האלקטרודה הקלטת postsynaptic לפני חותם אוהם גיגה הוא עשה. - הכן פתרון postsynaptic אלקטרודה הלחנה (מ"מ) 120 גלוקונאט צזיום, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, ו0.3 NaGTP (pH 7.2 עם CsOH; osmolarity: 290 mOsm). משוך microelectrodes הזכוכית ב5-10 התנגדות MΩ ולמלא עם פתרון פנימי מסונן.
- הכן נוזל המוח והשדרה מלאכותי (ACSF) הלחנה (מ"מ) 119 NaCl, KCl 2.4, 1.3 MgSO 4, 2.4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 3 NaHCO, גלוקוז 11, pH 7.4, רווי ב95% O 2, 5 % CO 2. הערה: אם AMPAR בתיווך responses צריך להיות חסום לבדיקה של NMDAR EPSCs, כולל 10 מיקרומטר CNQX או NBQX בACSF.
- הכן פתרון אלקטרודה presynaptic על ידי ערבוב (במ"מ) גלוקונאט 120 אשלגן, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, ו0.3 NaGTP (pH 7.2 עם KOH; osmolarity: 290 mOsm). בעוד אותו פתרון האלקטרודה משמש לנוירונים postsynaptic, גלוקונאט צזיום (120 מ"מ) משמש בדרך כלל כמלח הגדול באלקטרודה postsynaptic, בתוספת 5 מ"מ QX314.
- להשיג הקלטות ניידים המותאם שלמות
- כדי לבחון שידור סינפטי בין שני נוירונים בודדים, לייעד נוירון אחד כנוירון presynaptic ולהחזיק במהדק נוכחי כדי לגרום לפוטנציאל פעולה וליזום שידור סינפטי.
- לייעד את הנוירון השני, כנוירון postsynaptic, ולהחזיק אותו במהדק נוכחי או מתח בהתאם למידע הנדרש על ידי החוקר. להשיג בחינה מפורטת של זרמי glutamatergic, עם EPSCs תיווך AMPAR נבדק ב-65 mV וEPSCs בתיווך NMDAR נבדק ב+30 mV 6-16 ידי החזקת נוירון postsynaptic במהדק מתח
- להקים הקלטה לזווג. להקים הקלטה לזווג, הקלטת כל תא presynaptic הוא מתקבל תמיד ראשון, מה שמאפשר נוירונים postsynaptic רציפים מרובים שיתקבל עד אחד שהוא synaptically connecteד מתקבל. אם ביצוע ניסויי פלסטיות הסינפטית, זה קריטי במיוחד כדי לקבל את נוירון presynaptic הראשון כאינדוקציה של LTP בנוירון postsynaptic חייב להיות יזם בתוך 10 דקות של קבלת הקלטות תא כל כדי למנוע סחף של גורמי cytoplasmic נדרשים לLTP 8,19.
- למנוע אובדן תא מושרה תנועה. אתגר גדול בעת ביצוע הקלטות תא כל לזווג הוא הימנעות רטט ושיבוש מושרה תנועה של הקלטת התא השלמה הראשונה תוך קבלת ההקלטה השנייה.
- להשיג את הקלטת התא השלמה הראשונה ולאחר מכן להעביר את מיקרומטר עדשת 10-200 מיקרוסקופ בציר X כך שההקלטה שהוקמה ממוקמת בקצה השטח נראה על הצג (איור 2 א).
- הרם את העדשה של מיקרוסקופ ~ 5-10 מ"מ תוך הבטחה כי ACSF עדיין שומר על קשר עם העדשה. הר האלקטרודה השנייה ולהדריך למניסקוס הנוזל (איור 2
- הזז את האלקטרודה במישור XY עד שהוא ישירות תחת נתיב האור דרך העדשה, אבל עדיין משמעותית מעל האלקטרודה ההקלטה הוקמה. ברגע שהאלקטרודה גלויה מתחת למיקרוסקופ, להבטיח את הקצה הוא בקצה הרחוק של הצג מהאלקטרודה הראשונה.
- הזז את האלקטרודה השנייה למטה ברצף עם פוקוס מיקרוסקופ עד ששני אלקטרודות נמצאות באותו מישור המוקד. חשובה שרמת לחץ חיובי היא חזקה מספיק כדי למנוע סתימת קצה, אבל לא חזקה מדי, כדי לשבש את הקלטת התא השלמה הראשונה. זה מתורגם ללחץ החיובי גרימת תנועה ב2-3 תאי עצב מן האלקטרודה בעת כניסת הפרוסה ראשונה.
- אתר שותף postsynaptic במישור מוקד דומה להקלטת presynaptic הראשונה (איור 2 ג). הקלטה בדרך כלל להשיג לזווג הקלטות בין נוירונים פירמידה CA3 כל התא השני מתא עצב 0-200 מ"מ של r הראשוןecording (2C דמויות, D).
הערה: שידור Synaptic בין זוגות נוירונים יציב לאורך תקופות של עד 3-4 hr זמן בעת שימוש בטכניקות הקלטת תא שלמים סטנדרטית אלה.
- פלסטיות הסינפטית: Once Upon להשיג זוג תא הפירמידה synaptically המחובר מוצלח (איורים 3 א ', ב'), לבחון את המאפיינים של שידור ופלסטיות הסינפטית.
- האינדוקציה LTP.
- לגרום LTP על ידי זיווג פוטנציאלי presynaptic פעולה (1 הרץ) עם שלילת קוטביות postsynaptic ל-10 עד 0 mV דקות 1 (איור 3 ג) 7-9,12-14. ליזום זיווג בתוך 10 דקות של פריצה לתא עצב postsynaptic.
הערה: LTP יכול גם להיות מושרה עם שני נוירונים שנערכו במהדק נוכחי על ידי זיווג פוטנציאל פעולת presynaptic וpostsynaptic ברץ 1 דקות 1, עם פוטנציאל פעולת postsynaptic עורר 10 אלפיות שניים לאחר הזרקה של זרם לתוך תא עצב presynaptic 8
- לגרום LTP על ידי זיווג פוטנציאלי presynaptic פעולה (1 הרץ) עם שלילת קוטביות postsynaptic ל-10 עד 0 mV דקות 1 (איור 3 ג) 7-9,12-14. ליזום זיווג בתוך 10 דקות של פריצה לתא עצב postsynaptic.
- בהמשך לגרום בע"מ על ידי גירוי בתדר נמוך (LFS) בשעה 1 הרץ בשילוב עם שלילת קוטביות קלה של נוירון postsynaptic ל-55 mV ל5-10 דקות (איור 3 ג) 9.
- האינדוקציה LTP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קישוריות הסינפטית ניכרה על ידי גירוי תא עצב presynaptic לירות פוטנציאל פעולה על ידי העברת דופק depolarizing נוכחי (בדרך כלל 20-50 הרשות הפלסטינית ל20 אלפית שני) באמצעות אלקטרודה ההקלטה. העקבות הנוכחיות postsynaptic לאחר מכן נבדקו לנוכחות של EPSC monosynaptic עוררו ב( <אלפיות 5) קצרים, וזמן התגובה עולה בקנה אחד לאחר השיא של פוטנציאל סינפטי הפעולה (איור 3 א). ברוב ניסויי נוירונים postsynaptic מרובים נבדקים לפני ניתן להשיג זוג המחובר synaptically. בסך הכל, ~ 1/3 של תאי CA3 presynaptic הם monosynaptically מצמידים את תא CA3 postsynaptic על ידי חיבורים פעילים הסינפטי (איור 3 א), וכ 20% מתאי עצב CA3 מחוברים על ידי קשרים סינפטיים כל שקטים 6,8.
המשרעת של זרמי קולטן AMPA תחילת המחקר בתיווך משתנה ממשפט למשפט בתוך הקלטה לזווג, וגם בין פאי העצמאיהקלטות אדומות (איור 3 ב) 6,8. משרעת AMPAR EPSC הממוצע נע בין <10 הרשות הפלסטינית ל> 800 הרשות הפלסטינית, וסביר להניח נובע מהבדלים במספר הסינפסות פונקציונלית בין הקלטות לזווג. שיעורי כישלון גם נצפו למשתנים באופן משמעותי בין ההקלטות לזווג 6,7, הנעים בין שיעורי כישלון AMPAR EPSC 100% בסינפסות שקטה, לשיעורי כישלון 0-95% בזוגות המחוברים על ידי סינפסות הפעילה 6,7. בתוך הקלטות לזווג בודדות, כישלונות סינפטיים התרחשו, במיוחד בהקלטות עם אמפליטודות AMPAR EPSC קטנות יותר. ההשתנות במשרעת AMPAR EPSC ניכרה ממשפט למשפט בנתונים הגולמיים (איור 3 ב) הוא סביר בשל תנודות במספר quantal שוחרר ממשפט למשפט, כפי שקורים בסינפסות אחרות 6.
הקלטות תא כל כפולה גם מספקות גישה ישירה לשתי לפני וציטופלסמה העצבית postsynaptic, המאפשרות manipulat התרופתייון של או שני התאים presynaptic וpostsynaptic / באמצעות אלקטרודות הקלטת 6. בדרך כלל, מניפולציות תרופתי presynaptic הן מהירות מאוד (תוך 10 דקות). זו אינה מוגבלת למולקולות קטנות (לדוגמא, BAPTA), כdextrans שכותרתו fluorescently יכול לגשת מסופי presynaptic ≤200 מיקרומטר הרחק מהאלקטרודה ההקלטה. לכן ניתוח דומה לזה שבוצע בסינפסה ענקית דיונון 25 ניתן יהיה להאריכו ללימודים של מכונות שחרור שלפוחית הסינפטית בפרוס בהיפוקמפוס. העמדה של סינפסות הספציפיות שנמדדו בהקלטות לזווג אינן מזוהות בתהליך ההקלטה. לכן הפרוקסימלי לעומת אתרים הדיסטלי של סינפסות לא ניתן להעריך באותה קלות כמו גירוי מקומי עם אלקטרודות מגרה תאית או יישום גלוטמט מוקדי. עם זאת, מילוי צבע של כל נוירון במהלך ההקלטה לזווג יכול לאפשר שיקום המורפולוגי של סוכות axonal ואתרים הסינפטי פוטנציאל LTP ו LTD מושרים באופן מהימן בסינפסות CA3-CA3 במערכת זו התרבות (איור 3 ג), ושני הצורות של הפלסטיות האחרונה למשך הקלטות תא כולו (מעל 2 hr). פרדיגמות LTP ואינדוקצית בע"מ מנוצלות זהות לאלו שבוצעו בפרוסות וLTP ותערוכת בע"מ המאפיינים של NMDAR תלות, אסוציאטיבי ועצמאות מסלול, ולכן השילוב הזה של מערכת התרבות חריפות והקלטות לזווג מספקת מערכת מודל יקרת ערך כדי לבחון הסינפטי פלסטיות 7. אירועים מעכבים Polysynaptic לעתים קרובות הם נצפו בהקלטות לזווג בין זוגות תאי הפירמידה CA3 (איור 3D). אנחנו לא פרמקולוגית לחסום עיכוב GABAergic זה כמו זה מייצר היפראקטיביות מפריעה מאוד. עם זאת, בשל זמן האחזור הארוך יותר של אירועים המעכבים polysynaptic אלה, שהם בדרך כלל אינם מונעים מדידה של excitato monosynapticנוכחי ר"י. אם האירועים המעכבים polysynaptic נצפו להתערב עם זרם monosynaptic, טשטוש השיא של נוכחי monosynaptic, זוגות אלה צריכים להיות נכללים בניתוח. קשרים מעוררים Polysynaptic גם לפעמים שנצפו, אבל באופן משמעותי פחות נפוצים וגם אינם נכללים בניתוח. לעיתים נדירות, נוכחי הסינפטי מעכבת monosynaptic מתקבל עקב נוירון presynaptic להיות interneuron מעכב. זה מזוהה בקלות על ידי חוסר ההתאמה של ירי פוטנציאל פעולה בתגובה להזרקה נוכחית (סעיף 1) עוד. זה לא אפשרי בנוירונים postsynaptic הבמבוסס-גלוקונאט צזיום הפתרון הפנימי. עם זאת, כפי שנוירונים מזוהים מבחינה ויזואלית לפני ההקלטה, בניסיון שלנו זה מתרחש <1% מהזמן. Interneurons בתוך פרוסות בהיפוקמפוס organotypic בקלות לזהות בעין על ידי גוף התא שאינה הפירמידה שלהם, במיוחד בradiatum שכבה ואוריין. לכן יחסי ציבור זהeparation גם מאפשר הקלטות של מעורר interneuron וזרמים מעכבים. עם זאת, מעט מאוד ידוע על הרשתות המעכבות בפרוסות organotypic, והאם הם שומרים על קישוריות דומה לזה במוח לא ברור. 
הכנת .1 איור של תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס organotypic. () היפוקמפוס, באתרו, שתואר על ידי הקו המקווקו. כדי להסיר את ההיפוקמפוס, החיבורים לfornix, נותקו וההיפוקמפוס התגלגל בעדינות אל מחוץ למוח. (B) hippocampi ממוקמות על הבמה של מבצעה על גבי נייר סינון. פרוסות בהיפוקמפוס (C) מועברות דרך רחב נשא של פיפטה פסטר כדי למנוע נזק. דוגמאות (D) של פרוסות "טובות" מול "רעות".(E) קריקטורה של התקנה פרוסה על ממברנות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור .2 קבלת לזווג הקלטות תא כל מתאי העצב בהיפוקמפוס CA3. תמונות רציפים להשגת הקלטה לזווג, מראה אלקטרודה אופטימלית ומיקום עצבי. () לאחר קבלת כל התא הראשון הקלטת מיקרוסקופ מועבר 10-200 מ"מ באקס ציר כך שההקלטה שהוקמה (חץ) ממוקמת בקצה האזור הגלוי על המסך. סרגל קנה מידה:. 25 מיקרומטר (ב ') על מנת לאפשר מקום לאלקטרודה השנייה, העדשה של מיקרוסקופ ואז הרימה את ~ 5-10 מ"מ, על מנת להבטיח כי ACSF עדיין שומר על קשר עםהעדשה. כדי להבטיח את האלקטרודה השנייה לא להקפיץ את האלקטרודה הקלטה אחרת, את האלקטרודה השנייה היא עברה בציר x עד שהוא ישירות תחת נתיב האור דרך העדשה, אבל עדיין משמעותית מעל האלקטרודה ההקלטה הוקמה. הוקם מראה הקלטה לזווג (C) שני אלקטרודות (חיצים) באותו מישור המוקד. סרגל קנה מידה: 25 מיקרומטר הקלטה (ד) מותאם מתא העצב סמוך CA3 בבעלי חיים מהונדסים, המראה את הנוירונים EGFP חיובי על RHS.. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3 הילוכים Synaptic ופלסטיות בין זוגות תאי הפירמידה CA3-CA3. (א) דוגמא של pמחדש ועקבות postsynaptic מהקלטה לזווג בין שני נוירונים הפירמידה CA3. בתגובה לדופק נוכחי 20 שניות כדי לגרום לירי פוטנציאל פעולת presynaptic, (הוקלט ב-65 mV) מתרחש בתגובה ישירה לפוטנציאל הפעולה (B) שמאל הנוכחית בתיווך AMPAR postsynaptic:. המשרעת של EPSCs תיווך AMPAR משתנה לא רק בין הקלטות לזווג, אלא גם ממשפט למשפט בתוך הקלטה לזווג. כל ניסוי מייצג את המשרעת של EPSC נמדד ב0.1 הרץ. בדוגמא זו, משרעת AMPAR EPSC נע בין 5 הרשות הפלסטינית ל> 60 הרשות הפלסטינית. מימין: אמפליטודות NMDAR EPSC נמדדת ב+40 mV בנוכחות 10 מיקרומטר CNQX. אמפליטודות NMDAR EPSC היא בדרך כלל קטנה יותר באופן משמעותי במשרעת שAMPAR EPSCs, אבל עדיין מראה שונות משמעותי. משרעת NMDAR EPSC בדרך כלל ממוצעים בין 10-20 הרשות הפלסטינית בהקלטות לזווג בין תאים פירמידליים CA3, מה שהופך את הכישלונות לזיהוי בקלות (C) משמאל:. זוגות תא פירמידה CA3 להביע LTP שנמשך לכל האורך של ההקלטה לזווג. LTP ניכר בקלות על ידי עלייה במשרעת של AMPAR EPSCs. השתנות משפט למשפט משמעותית במשרעת AMPAR EPSC נשארה אחרי הגיוס של LTP. מימין: ביטוי של דיכאון לטווח ארוך (בע"מ) בין תאי עצב הפירמידה CA3. שים לב לירידה במשרעת ממוצעת של EPSC AMPAR וירידה במקביל בניסוי לשונות משרעת משפט. דוגמא (ד) של זרמי postsynaptic polysynaptic מעכבים, אשר מתרחשים בזמן אחזור ארוך יותר בהשוואה לmonosynaptic AMPAR EPSC. כאשר נוירון postsynaptic הוא המתח מהודק ב-65 mV, זרמי polysynaptic נראים כשיא שני בהשהיה של> 5 אלפיות שניים לאחר השיא של פוטנציאל פעולת presynaptic. מחזיק נוירון postsynaptic ב-30 mV מאשר כי הנוכחי polysynaptic הוא מעכב בשל ההיפוך של הכיוון הנוכחי."Target =" es.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
טבלה 1 בעיות פוטנציאליות הנובעות בהקלטות והכנת התרבויות פרוסה organotypic לזווג. זה מפרט את בעיות פוטנציאליות שמבוצעות עם הקלטות תא כל לזווג בתרבויות פרוסה organotypic. בנוסף, אנחנו גם מייעצים מה שנדרש זמן משמעותי שבילה 'נהיגה' התקנת אלקטרופיזיולוגיה להקלטות לזווג, מכיוון שרוב הבעיות הקשורות לשיבושי תנועה שיכולה בקלות להיות דמיינו ולתקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן יש לנו תיארנו את הדרישות להקמת הקלטות תא מוצלחות לזווג כל בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס organotypic. יכולות גם להתבצע הקלטות מותאמים בהכנות מרובות, כוללים פרוסות חריפות ומערכות תרבות ניתקו 26,27. למרות ההתמקדות כאן הייתה על הגיוס של צורות ארוכות יותר של פלסטיות הסינפטית (כלומר LTP ו LTD), חשוב להדגיש כי הקלטות תא כל לזווג בorganotypic, פרוסה חריפה וניתקו הכנות תא סיפקו תובנות חשובות גודל quantal, קצר פלסטיות -term, פונקצית presynaptic, כמו גם LTP ו LTD 2,4,8,26,27.
היתרון העיקרי של המערכת הפרוסה organotypic הוא הקישוריות המוגברת בין נוירונים. קישוריות הסינפטית בהכנת פרוסה החריפה היא נמוכה בשל ניתוק קשרי axonal במהלך הכנת פרוסה. מניסיוננו, לזווג הקלטות מconnecte synapticallyנוירונים CA3 ד בפרוסות חריפות היו אפשריים רק ב~ 5% מהקלטות לזווג הושגו. כלומר, 95% מהקלטות לזווג היו קשורים. אלטרנטיבה היא להשתמש ראשי ניתק תרבויות בהיפוקמפוס שבו הקישוריות הסינפטית היא גבוהה יותר באופן משמעותי 26. עם זאת, בהכנות בתרבית ניתק לבוא שאלות בנוגע לזהות נוירון והאם תכונותיהם דומות לאלה של סינפסות הבוגרת ברקמות מקומיות. השימוש בתרבויות הפרוסה בהיפוקמפוס organotypic באופן חלקי מהקילה את החששות האלה כי תת עצביים בקלות על ידי יכול לזהות, והתאים לשמור על מורפולוגיה וקישוריות דומות לרקמת מוח ילידי 20. עם זאת, כפרוסות נשמרות במבחנה במשך יותר משבוע, זה חשוב לציין כי צמיחת axonal משמעותית מתרחשת בתקופה זו. הגידול וכתוצאה מכך הקישוריות הוא מועיל מאוד לביצוע הקלטות לזווג הבוחנות פונקציה ופלסטיות הסינפטית, עם זאת ישיש לציין, כי מחקרים שבחנו את קישוריות לרשת עשויים שלא להיות מתאימים להכנה זו.
בעוד רוב ההקלטות לזווג שלנו שנערכו על זוגות תא הפירמידה CA3-CA3, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות לCA3-CA1 והמשונן gyrus-CA3 לזווג הקלטות. השכיחות של קישוריות הסינפטית בין תאי עצב gyrus ופירמידת CA3 המשונן במערכת זו היא נמוכה באופן משמעותי. עם זאת, קשרים מעוררים monosynaptic בין CA3 וCA1 במערכת זו כבר דיווח להיות גבוהה ככל 76% 28.
בנוסף, הקלטות תא כולו לזווג מבוצעות באופן שיגרתי ברקמה בהיפוקמפוס העכבר, כוללים עכברים הטרנסגניים (איור 2 ד) 29-31. הטכניקה יכולה להיות מעודנת יותר כדי להקליט שידור סינפטי ופלסטיות בין נוירונים עם ביטוי גני פסיפס 30. תיוג GFP של נוירונים wild-type מאפשר ממוקד לזווג הקלטות תא שלמות בנוירונים of ידועה גנוטיפ. ניסויים אלה זיהו שינויים בקישוריות הסינפטית בין תאי עצב בודדים, כולל ההיפר-קישוריות או תפקוד סינפטי סימטרי 30,31 שעשויות לתרום לגירעונות התנהגות שנצפו בבעלי חיים אלה.
לסיכום, הקלטות תא כולו לזווג להגדיל את היכולת לפרש תכונות סינפטי אלקטרו ולקבוע מנגנוני subcellular שנוירונים להעסיק לשנות כוח הסינפטי. שימוש בטכניקה זו אפשרה את התחזיות של מודלים טרום postsynaptic של פלסטיות הסינפטית להיבדק באופן ישיר. בנוסף, את הפנוטיפ של סינפסות השקטה, ותפקידים ספציפיים של פעילות אזור וחלבונים PSD יש גם תואר בהכנה זו 6-16. זה גם אפשר את הגילוי שסינפסות קיימות במדינות electrophysiologically מוגדרים שונות, וכי במהלך סינפסות פלסטיות הסינפטית לעבור בין המדינות אלה 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
