Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

doi: 10.3791/51958 Published: September 28, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рецепторы глутамата посредником большинство возбуждающей синаптической передачи в центральных синапсах нервной системы. Две основные подтипы ионотропных глутаматных рецепторов, локализованных на позвоночнике головки постсинаптической мембраны являются N-метил-D-аспартата (NMDA) и α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМРА) рецепторов. В отдыхает мембранных потенциалов, АМРА-рецепторы несут большую часть постсинаптической тока во время синаптической передачи. В гиппокампе, рецептор NMDA играет ключевую роль в запуске изменения в ряде АМРА-рецепторов в постсинаптической мембраны: выступая в качестве "детектора совпадений" 1 инициировать изменения в синаптической силы 1, рецептор NMDA участвует в синаптических механизмов что, как полагают, лежат в основе обучения и памяти на субклеточном уровне. В ответ на деполяризации постсинаптического нейрона параллельно с пресинаптической выпуска передатчика, кальций входит через NMDAрецепторов инициировать введение рецептора АМРА или удаление 2. Такая динамика рецепторов лежат синапса пластичность: увеличение синаптической силы является долгосрочное потенцирование 2,3 (LTP), в то время как снижение синаптической силы является долгосрочной депрессии 4 (ООО). Поэтому движение рецептора АМРА, как полагают, несет ответственность за синаптической пластичности выражения, в то время как рецепторы NMDA, как полагают, контролировать его индукции.

Определение точных механизмов, лежащих передачу синаптическую пластичность и требует изучения малых популяций синапсов, в идеале одиночные синапсы. В то время как некоторые синапсы хорошо подходит для изучения на этом уровне, например, чашечки, удерживаемых 5, для наиболее синаптических населения это крайне сложно вследствие малого и диффузного характера синаптических связей. Две основные методы электрофизиологии были разработаны для изучения одиночных синаптических связей: Первый минимальна стимуляция, порогае один пресинаптический волокна Предполагается стимулировали внеклеточно. Второй метод работает в паре записи, где два одновременных целые клеточные записи с синаптически связанных нейронов выполняется. Основным преимуществом минимальной стимуляции является то, что быстрое и относительно прост в исполнении, с участием размещение внеклеточного стимулирующего электрода в аксонов-кишечного тракта, одновременно записи с постсинаптического нейрона. Главной задачей при использовании этого метода является то, что надежным стимуляция одной клетки редко может быть гарантирована суда после судебного разбирательства.

За последние пятнадцать лет мы регулярно использовали в паре цельноклеточная записи с двух синаптически связанных пирамидальных нейронов 6-17. Основным преимуществом этого метода является то, что только один пресинаптический нейрон последовательно и надежно стимулировали. Она также позволяет не только электрофизиологические характеристики, но и фармакологической манипуляции пресинаптической нейрон 6,18 </ SUP>. Тем не менее, вероятность синаптической связи между нейронами низка, что делает подключенные пары трудно получить 19. Использование органотипических культур мозга срезов обходит это препятствие, как синаптической связи может восстановить в пробирке и тому природа полученного соединения аналогична в основном мозговой ткани 20. Кроме того, органотипической культуры выразить LTP, ООО 7-10,12-15,21 и дополнительные формы краткосрочного синаптической пластичности в том числе содействия в паре-импульса (PPF) и депрессии (PPD) 6,22,23, позволяя механизмы пластичности в быть изучены в пар нейронов. Здесь мы опишем детальную методику, участвующих в успешно достижения парные записи в этой системе в пробирке. Эта информация может быть легко адаптированы к другим экспериментальных системах, в том числе острых срезов и других областях головного мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

О себе животных Этика:

Протоколы, описанные в этой рукописи следовать указаниям по уходу за животными, установленные Университета Окленда и Стэнфордский университет. P7 крысята были подвергнуты эвтаназии быстрым обезглавливание. Гиппокампа рассечение затем немедленно проводили, как описано ниже.

1 Органотипической гиппокампа ломтик Культура

  1. Подготовка
    1. Подготовьте рассечение Средний (используется только для рассечения мозга). Объединить 200 мл минимальной основной среде, 2 мл пенициллина-стрептомицина раствора (10000 единиц каждого из них, в 0,85% NaCl), 5 мл буферного раствора HEPES, 2 мл 1 М раствор трис (рН 7,2), и фильтр стерилизуют при 0,22 мкм фильтр . Провести гиппокампа рассечение в ледяной рассечение среды.
    2. Охладите рассечение среды. Поместите рассечение СМИ в морозильнике примерно 1 час до начала рассечение, пока жидкость не очень холодно. Не допускайте большого льда крystals сформировать. Храните на льду, пока не требуется.
    3. Подготовка питательной среды (используется для всего, кроме рассечения гиппокампе). Зерноуборочные 100 мл минимально необходимой среды, (концентрационные 1x, жидкость) ж / солей Хэнка, ж / L-глутамина, 2 мл пенициллина-стрептомицина решения (жидкого, 10000 единиц каждого, в 0,85% NaCl), 2,5 мл HEPES 1 М буфера Раствор 50 мл Хэнка сбалансированный солевой раствор, 50 мл лошадиной сыворотки (определяется, инактивированной нагреванием), и фильтр стерилизуют при 0,22 мкм фильтр.
    4. Подготовьте чашки для культивирования. Поместите 1 мл культуральной среды на 35 мм блюдо культуры, и добавьте мембранный вкладыш к каждому блюду. Положите до семи из этих блюд в один 150 мм чашки Петри (далее обозначается как 'тарелки'). Место пластины в CO 2 инкубаторе в течение по крайней мере часа перед рассечение начинается так, что культурная среда в блюдах достигает нужной температуры и рН.
  2. Рассечение гиппокампы от крысят в постнатальном День 7 (P7)
    1. Предварительно стерилизовать все рассечение инструментов под ультрафиолетовым светом перед процедурой.
    2. После быстрого обезглавливания, извлечь мозг и место в охлажденный среды в одном блюде, а затем удалить его с куском влажной фильтровальной бумаге для вскрытия. Дразнить кору от мозга тупыми гладкими пластмассовыми миниатюрные шпатели, подвергая гиппокамп. Разрежьте свода, а затем аккуратно работать лопаточку под гиппокампе, чтобы перевернуть его (рисунок 1а).
      Примечание: Успешное срез культуры могут быть получены с использованием животных до Р10.
    3. Обрежьте изолированный гиппокамп от остальной части головного мозга. Трансфер гиппокампа в новую чашку, содержащую охлажденный рассечение СМИ с помощью увлажненной мягкой кистью (например, белый соболь № 4).
    4. Почистите нижнюю (т.е. плоский сторона) гиппокампе сосудистого сплетения во время вскрытия, так как эти губчатые, meninge-как ткани сделать его трудно отделить гиппокампаломтики друг от друга в дальнейшем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте эти ткани на месте, если они не могут быть дразнили от нежно.
    5. Выполните всю рассечение как можно быстрее, не повреждая гиппокампа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При внимательном рассечение важнее быстрого один, пока экспериментальные условия охлажденным. Нарежьте гиппокампа от одновременно трех крыс. Здоровья срез не зависит тех пор, пока общее время от начала до когда покрытием ломтики войти в инкубаторе при 30 мин.
  3. Нарезки
    1. Нарежьте гиппокампа в поперечном направлении в 400 мкм сечений с использованием ручного ткани слайсер. Метод, с помощью которого нарезки проводится не важно, пока это не чрезмерно вредно для ткани и производит ломтики одинаковой толщиной с хорошо видимом ламинарного архитектуры (т.е. Рог Аммона, как легко видеть сохраняется в ткани).
    2. Ли гиппокампа на этапе тканиИзмельчитель сверху тройной толщины # 2 фильтровальной бумаги. Гиппокамп нарезаны полностью не снимая ломтики индивидуально (т.е. весь гиппокамп остается на стадии вертолета, пока все порезы не были сделаны, скорее, как буханки нарезанный хлеб в этой точке; рисунке 1b).
    3. Трансфер гиппокампа в рассечение среды, используя мягкую кисть положил рядом с каждым гиппокампе (белый соболь # 2). Аккуратно вставьте каждый гиппокамп в сторону, чтобы разорвать сцепление между гиппокампе и подстилающей фильтровальной бумаги. Раскатайте кисть под каждым гиппокампе, чтобы поднять его со сцены. Поместите все гиппокампа в то же 35 мм чашки Петри охлажденной рассечение среды. Отделите гиппокампа на отдельные кусочки вручную перемешивания блюдо попеременно по часовой стрелке и против часовой стрелки движения.
    4. Осмотрите ломтики под микроскопом рассекает и отбросить любые, которые повреждены, маленький, или которые не обладают четко видимый ячейкуслои тела.
      Примечание: Это часто будет тот случай, когда не все кусочки успешно отделены от их братьев в этой манере. В этом случае, они могут быть разделены путем поворота их на краю, и подталкивает их кончиками тонких щипцов. "Хорошие" ломтики, которые затем передаются в другую чистую чашку Петри, содержащую охлажденный рассечение среды с использованием отсечения и огневой полировкой пипетки Пастера (Цифры 1С-E).
  4. Хранение
    1. Поместите отдельные кусочки на мембранный фильтр вставками. С помощью пипетки Пастера отрезать и огонь полированной дать более крупный канал, индивидуально передать ломтики к культуре вставками.
      Примечание: размер отверстия, созданного при резке и противопожарной полировки пипетку имеет важное значение. Слишком мала, и части не будет легко выйти из пипетки на мембране. Слишком большой избыток жидкости и помещают на поверхности мембраны вместе с кусочком. Лучший диаметр отверстия обычно составляет около половины диаметрметра ствола пипетки. При резке, этот диаметр может быть выбран путем разрезания на должном месте на конус пипетки.
    2. Slice Передача
      1. Заполните пипетку со средой, а затем сосать одну кусочек с небольшими всасывающих сил. Это удерживает кусок вблизи отверстия пипетки, предотвращает слишком много среднего изгнание во вкладыш, чтобы поместить кусочек.
      2. Нанесите небольшое давление на луковице сформировать небольшой висячий капельку, позволяют срез, чтобы обосноваться в этой капле, а затем нажмите эту капельку к мембране и пусть срез "падения" на мембрану. Вообще три ломтика помещаются на каждой мембранной вставкой.
        Примечание: Если капли жидкости слишком большие, капли из трех кусочков, как правило, сливаются на поверхности мембраны, и, таким образом, ломтики будут все собираются в центре мембраны, что делает его более трудно отделить их электрофизиологические записи позже.
    3. Жидкость Removаль
      1. Аспирируйте любой избыток среды из верхней части культурального планшета вставкой для всех срезов в этой пластине (3 ломтиков в вставкой = 21 ломтиков в пластине), так, чтобы кусочки не погружена в или в окружении пула рассечение среды.
      2. Выполните это с режиссерский, но огневой полировкой пипетки Пастера. Разрешить ломтик урегулировать и придерживаться мембраны за минуту до пипетки. Будьте осторожны, не сосать кусочек внутрь пипетки. Провести удаление жидкости для вставок, которые высевали первой, чтобы обеспечить достаточное время для ломтики урегулировать.
    4. Slice хранения
      1. Магазин срез культуры в 5,0% CO 2 инкубаторе при 37 ° С. Соблюдайте окончательное расположение культур в фиг.1Е. Отдельные ломтики опираться на культуральном планшете вставки, который имеет пористую мембрану, на дно, и эта вставка устанавливается внутри чашки Петри, наполненную небольшим количеством среды; Посредством этого ломтики не погружен в меняDIUM, но есть доступ к ней только через мембрану в нижней части культурального планшета вставки.
      2. При желании, удалить ломтики может для изучения либо путем удаления пластины культуры вставку или вырезанием раздел вставки мембраны, содержащей кусочек.
  5. Техническое обслуживание
    1. Замените среду в чашках Петри на следующий день после принятия культур. Перенести культуры пластины вставку на новую чашку Петри, содержащую 1 мл свежей культуральной среде, которая находится в равновесии в инкубаторе в течение по крайней мере часа до передачи.
    2. Изменение среды вновь таким же образом, на третий день после внесения культуры. На третий день, передать культуру в инкубатор при 34 ° C. Измените среду дважды в неделю (каждые 3-4 дня).
    3. Определить здоровых культур. Выберите здоровые культур для парных целых записей клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровые культуры имеют четко выделенный край и четко определенной пирамидальную слоя клеток. Культуры остроумиеч темно (вероятно, некротический) области присутствует или вакуолизированных внешний вид с плоскими границами отвергаются. Используя эти критерии, как правило, две трети срез культуры достаточно здоровым для записи.
    4. Использование этих культур в довольно небольшой промежуток времени. Не использованные салфетки, которые культивировали в течение более двух недель, так как нейроны начинают показывать немного эпилептиформной поведение, которое медленно ухудшается со временем. Точная верхняя граница выживание нейронов не известно, но можно записать функционировать пирамидальных клеток, как в конце 16 недели в культуре.

2. Парные Целые Записи Сотовые

  1. ACSF и внутриклеточные Решения
    1. Готовят раствор пресинаптического электрода путем смешивания (в мм) глюконат калия 120, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP и 0,3 NaGTP (рН 7,2 с помощью КОН; осмолярность: 290 мОсм). Хотя тот же раствор электрод используется для постсинаптических нейронов, цезий глюконата (120 мМ) Обычно используется в качестве основного соли в постсинаптической электрода, плюс 5 мМ QX314.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет стабильную фиксацию напряжения на положительных потенциалов для записи постсинаптические NMDAR опосредованного токи 8-10,13. Это также предотвращает возбудимость калия, вызванной из пресинаптической нейрон внутренним раствора, вытекающей из постсинаптической электрода записи, прежде чем уплотнение Giga Ом изготовлен.
    2. Готовят раствор постсинаптической электрода композиции (в мм) 120 цезия глюконат, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP и 0,3 NaGTP (рН 7,2 с CsOH; осмолярность: 290 мОсм). Потяните стеклянные микроэлектродов на 5-10 сопротивления МОм и залейте фильтрованной внутреннего решения.
    3. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) композиции (в мм) 119 2,4 NaCl, KCl, 1,3 MgSO4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, NaHCO 3 26,2, 11 глюкозы, рН 7,4, насыщают 95% O 2, 5 % CO 2. ПРИМЕЧАНИЕ: Если Ампар опосредованного гesponses нужно быть заблокирован для рассмотрения NMDAR EPSCs, включают 10 мкм CNQX или NBQX в ACSF.
  2. Получить Парные всей клетки Recordings
    1. Чтобы изучить синаптическую передачу между двумя отдельными нейронами, назначить одного нейрона как пресинаптической нейрон и удерживайте в токовых клещей, чтобы вызвать потенциал действия и инициировать синаптическую передачу.
    2. Назначить второй нейрон, как постсинаптического нейрона, и держать его в тока или напряжения зажим в зависимости от информации, требуемой исследователем. Получить подробную экспертизу глутаматергических токов, с Ампар-опосредованных EPSCs обследованных при -65 мВ и NMDAR опосредованного EPSCs рассмотренных на 30 мВ 6-16, удерживая постсинаптического нейрона в зажим напряжения
    3. Установите в паре запись. Для установления парного запись, запись пресинаптический целая клетка всегда получается первое, что позволяет нескольким последовательные постсинаптические нейроны не должны быть получены до одного, который синаптически connecteд получается. При выполнении синаптической пластичности эксперименты, это особенно важно для получения пресинаптического нейрона сначала индукции LTP в постсинаптического нейрона должны быть начаты в течение 10 мин получения записей целые клеточные для предотвращения вымывания цитоплазматических факторов, необходимых для LTP 8,19.
    4. Избегайте движения, вызванного потерю клеток. Одна из основных задач при выполнении парных целые записи клеток избегает вибрации и движения, вызванного нарушение первого всей записи клеток в то время как получение второго запись.
      1. Получение первой записи целой клетки, а затем переместить линзы микроскопа 10-200 мкм в х-оси, так что установлено записи находится на краю области, видимой на мониторе (фиг.2А).
      2. Поднимите объектив микроскопа ~ 5-10 мм, обеспечивая при этом ACSF еще поддерживает контакт с линзой. Подключите второй электрод и направлять в мениска жидкости (Рисунок 2B
      3. Перемещение электрода в плоскости, пока не находится непосредственно под светового пути через объектив, но по-прежнему значительно выше установленного записи электрода. После того, как электрод видна под микроскопом, обеспечить верхушка в дальнем краю монитора от первого электрода.
      4. Перемещение второй электрод вниз в последовательности с акцентом микроскопа, пока оба электрода не находятся в той же фокальной плоскости. Важно, что уровень положительного давления является достаточно сильным, чтобы избежать закупорки наконечника, но не слишком сильно, чтобы нарушить первую запись целой клетки. Это приводит к положительным давлением, вызывающего движение в течение 2-3 нейронов от электрода, когда он впервые попадает в срез.
      5. Найдите постсинаптическую партнера в подобной фокальной плоскости к первому пресинаптической записи (Рисунок 2C). Запись, как правило, Obtain паре записи между CA3 пирамидальных нейронов второй одноклеточные от 0-200 мм нейрона первого гапись (Цифры 2C, D).
        ПРИМЕЧАНИЕ: синаптической передачи между нейронными пар стабильны в течение периодов времени до 3-4 ч при использовании этих стандартных целые методы записи клеток.
  3. Синаптической пластичности: Однажды получения успешным синаптически-подключен пара пирамидальные клетки (3А, Б), изучить характеристики синаптической передачи и пластичности.
    1. LTP индукции.
      1. Вызвать LTP путем спаривания пресинаптические потенциалы действия (1 Гц) с постсинаптической деполяризации до -10 0 мВ в течение 1 мин (Рисунок 3C) 7-9,12-14. Запустить процесс подключения пределах 10 минут взлома к постсинаптического нейрона.
        Примечание: LTP также может быть индуцирован с обеих нейронов, проведенных в текущем зажима путем спаривания пресинаптические и постсинаптические потенциалы действия с частотой 1 Гц в течение 1 мин, при постсинаптических потенциалов действия вызвали 10 мс после инъекции тока в пресинаптической нейрон 8
    2. Кроме того побудить ООО низкой частоты стимуляции (LFS) с частотой 1 Гц в сочетании с небольшим деполяризации постсинаптического нейрона к -55 мВ в течение 5-10 мин (Рисунок 3C) 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Синаптические связи очевидно, стимулируя пресинаптическое нейрон стрелять потенциал действия, передавая деполяризующего импульса тока (обычно 20-50 Па в течение 20 мс) с помощью регистрирующего электрода. Постсинаптической, ток затем исследовали на присутствие моносинаптического EPSC вызывали на короткое (<5 мс) и соответствуют задержки после пика пресинаптического потенциала действия (фиг.3А). В большинстве экспериментов несколько постсинаптические нейроны испытан перед пара-синаптически подключен могут быть получены. В целом, ~ 1/3 пресинаптических СА3 клеток моносинаптически соединен с постсинаптической клетке СА3 активными синаптических соединений (фиг.3А), и примерно 20% СА3 нейронов соединены все молчащих синаптических соединений 6,8.

Амплитуда базовых АМРА рецепторов опосредованных токов меняется от испытания к испытанию в парном записи, а также между независимой пайкрасные записи (Рисунок 3B) 6,8. Средняя амплитуда Ампар EPSC варьировались от <10 Па до> 800 мкА, и, вероятно, является результатом различий в количестве функциональных синапсов между парными записями. Интенсивность отказов также наблюдались значительно различаться между парными записями 6,7, от 100% Ампар EPSC отказов в тихих синапсов, чтобы 0-95% отказов в пар, соединенных активных синапсов 6,7. В отдельных парных записей, произошло синаптические неудачи, особенно в записях с меньшими амплитудами Ампар EPSC. Изменчивость амплитуды Ампар EPSC видно из суда в суд в сырых данных (3В), вероятно, объясняется колебаниями квантового числа освобожден от испытания к испытанию, как это происходит в других синапсов 6.

Двойные записи всего сотовые обеспечить прямой доступ как к пред-и постсинаптического нейронов цитоплазме, что позволяет фармакологической manipulatион или / обоих пресинаптических и постсинаптических клеток через записывающих электродов 6. Как правило, пресинаптические фармакологические манипуляции очень быстрое (в течение 10 мин). Это не ограничивается малыми молекулами (например, BAPTA), а флуоресцентно меченных декстранов может получить доступ к пресинаптических окончаний ≤200 мкм от регистрирующего электрода. Поэтому анализ, аналогичные выполняемым на кальмара гигантского синапса 25 может быть продлен до исследований синаптических везикул выпуска машин в гиппокампа ломтик. Положение конкретных синапсов, измеренных в парных записей не определены в процессе записи. Поэтому ближний против дистальных участках синапсов не может быть оценена так легко, как местного стимуляции внеклеточных электродов стимулирующих или фокальной применения глутамата. Однако заполнение краситель каждого нейрона во время парного записи можно включить морфологический реконструкцию аксонов беседок и потенциальных мест синаптических

LTP и LTD надежно индуцированного в СА3-СА3 синапсов в этой системе культуры (рис 3C), и обе формы пластичности в прошлом в течение всего срока целых клеток записи (более 2 часов). В LTP и индукционные ООО парадигмы, используемые идентичны тем, которые выполняются при острых ломтиками и LTP и LTD проявлять свойства NMDAR-зависимости, ассоциативности и путей распространения независимости, и, следовательно, этой комбинации системе культуры и парные записи предоставляет ценную модельную систему для изучения Synaptic пластичность 7.

Полисинаптических ингибирующие события часто наблюдаются в парных записей между CA3 пирамидальной клеточных пар (Рисунок 3D). Мы не фармакологически блокировать это ингибирование GABAergic как это производит очень разрушительное гиперактивность. Однако в связи с более длинной задержки этих ингибирующих полисинаптических событий, они, как правило, не препятствуют измерение моносинаптического excitatoры тока. Если полисинаптические ингибирующие события наблюдались вмешиваться моносинаптического тока, заслоняя пик моносинаптического тока, эти пары должны быть исключены из анализа. Полисинаптического возбуждающие соединения также иногда наблюдалось, но значительно реже, а также исключены из анализа. Редко, моносинаптического тормозной синаптической тока получается за счет пресинаптической нейрон быть тормозящим интернейрон. Это легко определить по отсутствия размещения потенциала действия стрельбы в ответ на более длительный (1 сек) инжекции тока. Это не возможно в постсинаптических нейронов, в которых цезия глюконат основе внутреннее решение. Однако, как нейроны выявляются визуально до записи, в нашем опыте это происходит <1% времени. Интернейроны пределах органотипических срезов гиппокампа легко идентифицируются визуально их не-пирамидальной тела клетки, особенно в роговом radiatum и Oriens. Поэтому это прeparation также позволяет записи интернейронов возбуждающих и тормозных токов. Тем не менее, очень мало известно о тормозящих сетей в органотипических ломтиками, и поддерживать ли они связь, аналогичную в мозге не ясно.

Рисунок 1
Рисунок 1 Подготовка органотипических гиппокампа культур срез. () Гиппокамп, на месте, очерчены пунктиром. Для удаления гиппокамп, соединения с свода порваны и гиппокамп мягко выкатил из мозга. (B) Гиппокамп расположены на сцене ломтерезки сверху фильтровальной бумаги. (C) срезов гиппокампа передаются через широкий отверстие пипетки Пастера, чтобы предотвратить повреждение. (D) Примеры 'хороших' против «плохих» ломтиками.(E) Мультфильм установки среза на мембранах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2 Получение паре целые записи клеток от нейронов гиппокампа СА3. Последовательных изображений достижения в паре запись, показывающий оптимальную электрод и нейронов позиционирование. (А) После получения первого всю ячейку записи микроскопа перемещается 10-200 мм в x- Ось так, что создана запись (стрелка) расположен на краю области, видимой на мониторе. Шкала бар:. 25 мкм (B) Для включения места для второго электрода, объектив микроскопа затем поднял ~ 5-10 мм, гарантируя, что ACSF еще поддерживает контакт собъектив. Для того чтобы обеспечить второй электрод не врезаться в другую электрод записи, второй электрод перемещают в х-оси, пока она не находится непосредственно под пути света через линзу, но все еще ​​значительно выше установленного записи электрода. (С) Основанная в паре записи, показывающий оба электрода (стрелки) в той же фокальной плоскости. Шкала бар:. 25 мкм (D) Парные записи из соседних СА3 нейронов в трансгенного животного, показывающих EGFP-позитивных нейронов в правой. Шкала бар:. 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 передачи Synaptic и пластичность между CA3-СА3 пар пирамидальные клетки. (А) Пример рповторно и постсинаптические следы от сопряженного записи между двумя пирамидальных нейронов СА3. В ответ на импульса тока 20 сек, чтобы побудить пресинаптическое потенциала действия стрельбу, постсинаптический Ампар опосредованного тока (записан в -65 мВ) происходит непосредственно в ответ на потенциал действия (B) Слева:. Амплитуда Ампар-опосредованных EPSCs меняется не только между парными записями, но и от суда-к-судебное разбирательство в паре записи. Каждое испытание представляет собой амплитуду EPSC, измеренной при 0,1 Гц. В этом примере, амплитуда Ампар EPSC колеблется от 5 Па до> 60 Па. Справа: NMDAR EPSC амплитуды оцениваются по 40 мВ в присутствии 10 мкМ CNQX. NMDAR EPSC амплитуды, как правило, значительно меньше по амплитуде, что Ампар EPSCs, но до сих пор показывают значительное изменчивость. NMDAR EPSC амплитуда обычно в среднем составляет 10-20 годовых в парных записей между CA3 пирамидальных клеток, что делает неудачи легко идентифицировать (C) Слева:. СА3 пары пирамидальные клеток выразить LTP, которая сохраняется в течение продолжительности парного записи. LTP легко видно по увеличению амплитуды Ампар EPSCs. Значительное проб для суда изменчивость амплитуды Ампар EPSC остается после индукции LTP. Справа: Выражение длительная депрессия (ООО) между CA3 пирамидальных нейронов. Обратите внимание на снижение средней амплитуды Ампар EPSC и сопутствующим снижением суда к изменчивости суд амплитуды. (D) Пример постсинаптических полисинаптических ингибирующих токов, возникающих при более длинной задержкой по сравнению с моносинаптических Ампар EPSC. Когда постсинаптического нейрона является напряжение фиксируется на -65 мВ, полисинаптического токи могут видеть в качестве второго пика на латентности> 5 мс после пика пресинаптического потенциала действия. Держа постсинаптического нейрона в -30 мВ подтверждает, что полисинаптического ток ингибирующее связи с разворота направления тока.ES.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1 Потенциальные проблемы, возникающие в парных записей и подготовки органотипических культур срез. В этом списке перечислены общие потенциальные проблемы, которые возникают с парными целых записей клеток в органотипических культур срез. Кроме того, мы также советуем, что значительное время требуется, чтобы быть потрачены "вождения" настройку электрофизиологии для парных записей, так как большинство проблем, связанных с движением сбоев, которые легко могут быть визуализированы и выпрямленных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы описали требования по созданию успешных парные целые записи клеток в органотипических гиппокампа культур срез. Парные записи также может быть выполнена в нескольких препаратов, в том числе острых ломтиками и диссоциированных культур систем 26,27. Хотя основное внимание здесь уделялось индукции более форм синаптической пластичности (а именно LTP и LTD), важно подчеркнуть, что парные целые записи клеток в Органотипической, острый срез и диссоциированных клеток препараты, стал важным вкладом в квантовом размера, короткая -term пластичность, пресинаптического функции, а также LTP и LTD 2,4,8,26,27.

Основным преимуществом системы Органотипической среза является повышенная соединения между нейронами. Синаптические связи в острой подготовки среза является низкая вследствие разъединения аксонов соединений во время подготовки среза. По нашему опыту, в паре записи с синаптически connecteд CA3 нейронов в острых срезов было возможно только в ~ 5% парных записей, полученных. То есть, 95% от парных записей были не связаны. В качестве альтернативы можно использовать первичный диссоциирован гиппокампа культур, где подключение синаптической значительно выше 26. Тем не менее, с диссоциированных культивируемых препаратов приходят вопросы относительно нейронов идентичность и является ли аналогичны тем, которые зрелых синапсов в нативной ткани их свойства. Использование органотипических культур гиппокампа ломтик частично улучшает эти проблемы, потому что нейронные подтипы могут легко идентифицированы, и клетки поддерживать морфологию и соединения, которые похожи на родном мозговой ткани 20. Однако, как ломтики поддерживаются в пробирке в течение более одной недели, важно отметить, что существенным рост аксонов происходит в течение этого времени. В результате увеличение связности является очень полезным для выполнения парных записей, посвященных изучению синаптической функции и пластичность, однако он долженСледует отметить, что исследования, посвященные изучению подключение к сети не могут быть пригодны для этого препарата.

В то время как большинство наших парных записей были проведены на CA3-СА3 пар пирамидальной клеток, эта техника может быть легко адаптирована к СА3-СА1 и зубчатой ​​извилине-СА3 паре записи. Заболеваемость синаптической связи между зубчатой ​​извилине, а СА3 пирамидальных нейронов в этой системе значительно ниже. Тем не менее, моносинаптические возбуждающие связи между СА3 и CA1 в этой системе, как сообщается, будет выше, чем 76% 28.

Кроме того, регулярно проводится парные вся сотовые записи в мышь ткани гиппокампа, в том числе трансгенных мышей (Рисунок 2D) 29-31. Методика может быть доработан для записи синаптическую передачу и пластичность между нейронами с выражением мозаика генов 30. GFP маркировки нейронов дикого типа позволяет целенаправленное паре целые записи клеток в нейроны ое известно генотип. Эти эксперименты выявили изменения в синаптической связи между отдельными нейронами, в том числе гиперподключенности или асимметричной пресинаптической функции 30,31, которые могут способствовать поведенческих дефицитов, наблюдаемых в этих животных.

Таким образом, в паре вся сотовые записи увеличить способность интерпретировать электрофизиологические синаптические свойства и определять субклеточные механизмы, что нейроны использовать, чтобы изменить синаптическую силу. Используя эту технику позволило предсказания до и постсинаптических моделей синаптической пластичности быть непосредственно проверить. Кроме того, фенотип молчащих синапсов, и конкретные роли активного зоне и PSD белков также были описаны в данном препарате 6-16. Это также позволило открытие, что существует синапсы в различных электрофизиологически определенных государств, и что во время синаптической пластичности синапсов перемещаться между этими государствами 9,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium Stable motorized micromanipulators 
Penicillin-Streptomycin solution  Shallow tissue bath
HEPES buffer solution DIC camera
1 M Tris stock solution Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution Computer
Horse Serum  Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas Upright microscope
Soft paintbrush Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper Electrode puller
#2 Filter paper Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
  2. Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
  3. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
  4. Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
  5. Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
  6. Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
  7. Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20, (12), 4497-4505 (2000).
  8. Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
  9. Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
  10. Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
  11. Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29, (14), 4332-4345 (2009).
  12. Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
  13. Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
  14. Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33, (10), 1761-1770 (2011).
  15. Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
  16. Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32, (43), 14966-14978 (2012).
  17. Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27, (12), 744-750 (2004).
  18. Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6, (3), 387-394 (1996).
  19. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252, (5006), 722-724 (1991).
  20. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20, (10), 471-477 (1997).
  21. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, (2), 173-182 (1991).
  22. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
  23. Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93, (20), 11225-11230 (1996).
  24. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, (6280), 177-180 (1990).
  25. DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373, (6515), 626-630 (1995).
  26. Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
  27. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
  28. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73, (3), 1282-1294 (1995).
  29. Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
  30. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27, (15), 4014-4018 (2007).
  31. Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).More

Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter