Summary
يعرض هذا البروتوكول وسيلة فعالة وموثوق بها لبالنقل الإنسان THP-1 الضامة مع سيرنا أو DNA البلازميد بواسطة Electroporation للمع ارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن عالية مع الحفاظ على حيوية الخلية والقدرة بلعم الكاملة عن التمايز والاستقطاب.
Abstract
الضامة، واللاعبين الرئيسيين من الاستجابة المناعية الفطرية، هي في محور الأبحاث التعامل مع توازن الأنسجة أو مختلف الأمراض. ترنسفكأيشن مع سيرنا وبلازميد الحمض النووي هو أداة فعالة لدراسة وظيفتها، ولكن ترنسفكأيشن الضامة ليست مسألة تافهة. على الرغم من أن العديد من المناهج المختلفة لترنسفكأيشن من الخلايا حقيقية النواة هي المتاحة، وعدد قليل فقط تسمح ترنسفكأيشن موثوقة وفعالة من الضامة، ولكن انخفاض حيوية الخلايا وسلوك الخلية غيرت بشدة مثل القدرة المتضائلة للتمايز أو الاستقطاب لوحظ في كثير من الأحيان. ولذلك بروتوكول ترنسفكأيشن يتطلب قادرة على نقل سيرنا وDNA البلازميد في الضامة دون التسبب في آثار جانبية خطيرة مما يسمح للتحقيق في تأثير سيرنا أو بلازميد في سياق السلوك الطبيعي للخلايا. بروتوكول المعروضة هنا يوفر طريقة لموثوق وفعال transfecting الإنسان THP-1 الضامة وموnocytes مع خلية حيوية عالية، عالية الكفاءة ترنسفكأيشن، والحد الأدنى من آثار على سلوك الخلية. ويستند هذا النهج على Nucleofection وقد تم تحسين بروتوكول للحفاظ على أقصى قدر من القدرة على تنشيط الخلايا بعد ترنسفكأيشن. بروتوكول كاف لخلايا ملتصقة بعد انفصال وكذلك الخلايا في تعليق، ويمكن استخدامها للمشاريع الصغيرة والمتوسطة أرقام العينة. وهكذا، فإن طريقة عرض مفيد للتحقيق في الآثار التنظيمية الجين خلال التمايز بلعم والاستقطاب. وبصرف النظر عن تقديم النتائج التي تميز الضامة transfected وفقا لهذا البروتوكول بالمقارنة إلى أسلوب الكيميائية البديلة، ويناقش أيضا تأثير الثقافة خلية اختيار المتوسطة بعد ترنسفكأيشن على سلوك الخلية. وتشير البيانات المعروضة على أهمية التحقق من صحة اختيار إعدادات التجريبية المختلفة.
Introduction
من بين المكونات الخلوية من جهاز المناعة البشري، الضامة هي ذات أهمية كبيرة بالنسبة للاستجابة المناعية الفطرية. مهامها هي متنوعة؛ أنهم متورطون في البلعمة من مسببات الأمراض والمواد الميتة، وأنها تلعب دورا هاما في توازن الأنسجة وتنتج وتفرز عدد كبير من السيتوكينات لتنظيم والانسجام في الاستجابة المناعية 1. ولذلك الضامة مشاركة كاملة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض الظروف. نظرا لتنوع مهامها، الضامة هي نوع من الخلايا غير متجانسة جدا ومتعدد الأوجه. ويتحقق ذلك من خلال الاستقطابات مختلفة؛ يمكن اعتمادا على الضامة مؤثرات الخارجية تتطور إلى الظواهر المختلفة 2. تقلب الضامة وأثرها على الاستجابة المناعية جعلها مثيرة جدا للاهتمام بحث الموضوع. من أجل توضيح الأيضية المعقدة والمهام التنظيمية، بلعم المناسب في نماذج المختبر ومساuired التي تعكس عدم التجانس بشكل صحيح البلاعم وتقلباته.
أصبح ترنسفكأيشن من الخلايا مع ناقلات DNA البلازميد أو الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) من أجل تغيير الخلوي التعبير الجيني أداة تستخدم على نطاق واسع وقوي في بيولوجيا الخلايا عن التحقيق في كل من تنظيم الجينات وظيفة الجين. هناك حاليا مجموعة كبيرة من الأدوات المختلفة المتاحة لترنسفكأيشن من الخلايا حقيقية النواة. وتشمل هذه الأدوات تطبيق ناقلات فيروسية، الطرق الميكانيكية (مثل البنادق الجينات)، والنهج الكيميائية (التي تعتمد على البوليمرات أو الدهون التي يمكن أن تشكل مجمعات مع الأحماض النووية)، و electroporation الخلايا 3. كل من هذه الطرق لها مزاياها وعيوبها، ويمكن اختيار الأنسب من هذه المجموعة الواسعة لنوع خلية معينة وتطبيقها يكون عملية صعبة ومضيعة للوقت.
الضامة يصعب المعروف أن بالنقل حوالة تقريبا كل راسخةالنهج ction يقلل بشكل كبير جدوى الضامة "أو تتداخل مع سلوكهم، أي في التمايز والاستقطاب معين. ولذلك، فإننا نقدم هنا على كفاءة، بروتوكول غير الفيروسي لبالنقل الإنسان THP-1 الضامة باستخدام التكنولوجيا Nucleofector القائم على Electroporation لل، وهو ما يمثل النهج الأمثل Electroporation للتتطلب خفض كميات من الحمض النووي. ومناسبة تماما Nucleofection للخلايا حساسة مثل وحيدات الضامة. هذا البروتوكول هو التكيف من الإصدارات المنشورة سابقا 4،5.
باختصار، يتم استخدام phorbol 12-13-ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لتمييز الإنسان THP-1 حيدات لمدة 48 ساعة في الضامة المبكرة قبل ترنسفكأيشن مع سيرنا أو DNA البلازميد. لترنسفكأيشن يتم فصل الضامة predifferentiated إنزيمي بواسطة Accutase أنا العلاج. يتم تنفيذ ترنسفكأيشن باستخدام جهاز 2B Nucleofector ل electroporation من الخلايا. بعد ترنسفكأيشن، تختلفواستمر entiation لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى على النحو المطلوب. وأخيرا، يتم تحضين الضامة transfected ناضجة مع أنواع مختلفة من المركبات للدراسات وظيفية.
هذا النهج يسمح للترنسفكأيشن من خطوط الخلايا مثل الإنسان THP-1 وحيدات الضامة وطبقت بنجاح في الماضي 6-10. وعلى النقيض من معظم النهج ترنسفكأيشن الكيميائية، لدينا إجراءات Nucleofection تعديلها باستخدام الضامة المبكرة غلة عالية الكفاءة ترنسفكأيشن في تركيبة مع بقاء الخلية دون عوائق، دون الحاجة إلى استخدام ناقلات فيروسية أو إضافة المزيد من المركبات الناقلة مع آثار جانبية غير معروفة. بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الضامة الإمكانات الكاملة من أجل التمايز وكذلك الاستقطاب مما يسمح التحقيقات وظيفية دون عوائق التالية ترنسفكأيشن 11.
علاوة على ذلك، خلية ثقافة المتوسط بعد تطبيق Nucleofection تؤثر تأثيرا قويا الدراسات الوظيفية تران التاليةsfection. على وجه الخصوص، قدرة الضامة "لاستقطاب يمكن أن تتأثر تبعا لمستنبت التطبيقية. هنا أربعة أنواع مختلفة من وسائل الإعلام ثقافة الخلية (IMDM، X-VIVO 20، LGM3 وماوس T خلية Nucleofector المتوسطة) تم اختبارها تحت ظروف عدم تفعيل استخدام انترلوكين (IL) 10. عن طريق THP-1 الضامة، لاحظنا أن استجابة الخلية لIL10 هي أقوى عند استخدام الماوس T خلية Nucleofector المتوسطة بالمقارنة مع وسائل الإعلام ثقافة الآخرين المذكورة أعلاه. هذه النتائج تثبت أن الأمثل المناسب لجميع الظروف ثقافة الخلية ضروري لنجاح ترنسفكأيشن الدراسات اوند الوظيفية اللاحقة لأنها قد تحسن إلى حد كبير النتائج التجريبية.
كما تشارك الضامة في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان، وتركز الكثير من البحث على توضيح سلوك البلاعم وكذلك الآليات التنظيمية التي تؤثر بدورها الضامة أو تسيطر عليها الضامة. لذلك، هذا البروتوكول هو ذات الصلة فيالعديد من المجالات البحثية المختلفة.
Protocol
1. Predifferentiation من THP-1 الضامة
- زراعة THP-1 الخلايا في المتوسط RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS) و 1٪ (V / V) البنسلين / الستربتومايسين / L-glutamin (باريس سان جيرمان) في CO 2 (5٪ ) حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- قبل ترنسفكأيشن، وخلايا تقسيم ونقلها إلى الطازجة المتوسطة RPMI كما كان من قبل. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.
- البذور 1.0-1.5 × 10 7 الخلايا في 75 سم ² زراعة الأنسجة قارورة أو 2.5 × 10 7 الخلايا في 150 سم ² الأنسجة قارورة الثقافة في المتوسط RPMI-1640 وإضافة 10٪ (V / V) FCS، 1٪ (V / ت) باريس سان جيرمان، 1٪ (V / V) البيروفات الصوديوم، 1٪ (V / V) الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية، و 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول لمدة 48 ساعة.
2. إعداد Nucleofection
- وضع Accutase أنا وجميع وسائل الاعلام الى حمام الماء عند 37 درجة مئوية.
- نضح مستنبت من القارورة واستبدال مع 6 مل (75 سم ² قارورة) أو 12 مل (150 سم ² قارورة) منAccutase الأول واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة انفصال كامل للخلايا. مراقبة مورفولوجيا الخلية بعد Accutase أنا العلاج لضمان أن الخلايا لها مظهر جولة. إذا كانت لا تزال تظهر بعض الخلايا لتركيبها، وشطف بعناية القارورة مع micropipette أو اضغط عليها بلطف لاستكمال مفرزة. لا تستخدم كاشطات خلية، وهذا سيكون له تأثير سلبي على حيوية الخلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
- خلال Accutase أنا العلاج، وإعداد وسائل الإعلام التالية:
- إعداد ترنسفكأيشن المتوسطة: ملحق زراعة الخلايا المتوسطة مع 1٪ (V / V) مع باريس سان جيرمان، 1٪ (V / V) من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ (V / V) البيروفات الصوديوم، و 5٪ (V / V) مصل الدم البشري (لسيرنا) أو 20٪ (V / V) المصل البشري (DNA البلازميد ل). إعداد الحجم النهائي إما 3 مل / عينة واحدة لوحة 6 جيدا أو 4 مل / عينة لمدة 12 لوحات جيدا.
- تعد زراعة المتوسطة: ملحق الثقافة المتوسطة مع 1٪ (V / V) مع باريس سان جيرمان، 1٪ (V / V) من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ (V / V) البيروفات الصوديوم، و 5٪ (V / V) هو جين تاومصل الرجل (لسيرنا) أو 20٪ (V / V) المصل البشري (للبلازميد)، 2.5 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية، و 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول. إعداد الحجم النهائي إما 3 مل / عينة واحدة لوحة 6 جيدا أو 4 مل / عينة لمدة 12 لوحات جيدا.
- تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG في درجة حرارة الغرفة.
- نضح خلايا Accutase الأول وresuspend في 1 مل من RPMI المتوسطة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية؛ عد الخلايا لتحديد عدد الخلايا.
ملاحظة: عندما تستخدم آلية إجراءات العد خلية سريعة، خطوات 2.4 و 2.5 قد يتم حذف خلايا ويمكن عدها على الفور بعد قدمت مفرزة أن التعرض لفترات طويلة للAccutase أنا وتجنبها. - لكل عينة ترنسفكأيشن إعداد مأخوذة في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي 2.0-2.5 × 10 6 خلايا.
3. Nucleofection من THP-1 الضامة
- جميع مأخوذة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 250 XG في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع DNA البلازميد أو سيرنا في nuclease خالية المياه أو وجود مخزن مؤقت المناسب. الحفاظ على حجم المطلوب من DNA البلازميد أو سيرنا صغيرة بقدر الإمكان.
- تعد واحدة كوفيت Nucleofector مع إما 1 ميكروغرام من سيرنا أو 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد لكل ترنسفكأيشن.
- أداء ترنسفكأيشن في وقت واحد. نضح طاف من قسامة الخلية.
- الخلايا resuspend مكعبات في حل Nucleofector أن تسفر عن إجمالي حجم 100 ميكرولتر من الحمض النووي / سيرنا والحل Nucleofector. الحفاظ على وقت التعرض إلى حل Nucleofector النقي إلى أدنى حد ممكن وضمان أن زمن التعرض لا تتجاوز 15 دقيقة.
- مزيج معلق خلايا والحامض النووي / سيرنا في كوفيت Nucleofector بواسطة التنصت لطيف.
- خلايا بالنقل عن طريق تنفيذ برنامج Y-001 في Nucleofector جهاز 2B.
- نقل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى قارورة رد الفعل استخدام البلاستيك القابل للتصرف ماصات باستور.
- إضافة على الفور 500 ميكرولتر من استعداد المتوسطة ترنسفكأيشن.
- كرر الخطوات من 3،4-3،9 لكل عينة ترنسفكأيشن.
معشوقة = "jove_title"> 4. بعد Nucleofection العناية
- 6 إعداد إما جيدا أو 12 جيدا لوحات لالخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. ماصة 2.5 مل من ترنسفكأيشن المتوسطة في كل بئر من لوحة 6 جيدا (1 جيدا / ترنسفكأيشن) أو 1.75 مل من ترنسفكأيشن المتوسطة في كل بئر من 12 لوحة جيدا (2 الآبار / ترنسفكأيشن).
- مزيج تعليق خلية تماما مع micropipette.
- نقل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في الآبار المعدة (إما بئر واحدة في لوحة 6 جيدا أو اثنين في 12 لوحة جيدا).
- احتضان لوحات لمدة 4 ساعة في حاضنة ترطيب (5٪ CO 2، 37 ° C).
- تحقق إعادة المرتكز الخلايا مجهريا.
ملاحظة: يجب أن تكون غالبية الخلايا الملتصقة مرة أخرى. في بعض الأحيان، وتمتد فترة الحضانة من 1 ساعة يزيد من عدد الخلايا الملتصقة في حالة عدم كفاية إعادة المرتكز. - نضح بعناية ترنسفكأيشن المتوسطة مع micropipette واستبدالها مع كمية مساوية من زراعة المتوسطة. نضح بئر واحدة فقط في كل مرة. <لى> احتضان خلايا للفترة الزمنية اللازمة للتأثير الأقصى البلازميد أو سيرنا (24-72 ساعة). إذا فترات حضانة تتجاوز 48 ساعة، استبدل المتوسطة بعد 48 ساعة.
- لمزيد من المعالجة مع المستجيبات (على سبيل المثال، السيتوكينات، منبهات، الخصوم ومثبطات) استخدام مصل المتوسطة مجانا دون سلطة النقد الفلسطينية وβ-المركابتويثانول. وقت نهاية فترة الحضانة من المستجيب مع الوقت من تأثير القصوى من البلازميد أو سيرنا وتخطط التغيير المتوسطة واضافة المستجيب وفقا لذلك. لا تحتفظ الخلايا تحت ظروف خالية المصل لمدة أطول من 24 ساعة.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول لترنسفكأيشن من THP-1 الضامة مع سيرنا ونحن عادة تحقيق معدلات ترنسفكأيشن من فوق 90٪ دون انخفاض كبير في حيوية الخلية. الشكل 1 يظهر بيانات تمثيلية توصيف حالة الخلايا بعد 24 ساعة ترنسفكأيشن مع fluorescently المسمى سيرنا في مقابل untransfected السيطرة، والتي لم تعامل مع الكواشف Nucleofection والنبض أو سيرنا لكنها لم تتلق جميع التغييرات وسائل الإعلام الثقافة كعينات transfected. في الشكل 1A يظهر التشكل الخلوي وفقا لقياس تدفق cytometric. وتظهر الصور المجهرية في الشكل 1B 1C أرقام و1D تمثل معدلات منخفضة لموت الخلايا المبرمج (التحكم: 1.5٪، Nucleofection: 5.4٪). ونخر (التحكم: 2.0٪، Nucleofection: 3.2٪) مما يدل حيوية الخلية تتأثر. نخر وموت الخلايا المبرمج هي أعلى قليلا للعينة transfected كما transfected THP-1 الضامة هي أكثريصعب فصل من خلايا untransfected، وبالتالي فإن احتمال تلف الخلايا خلال زيادة مفرزة. أخيرا يرد كفاءة ترنسفكأيشن في الشكل 1E. كما تحول كامل السكان transfected ضد السيطرة، وهذا يشير إلى أن جميع الخلايا و transfected وهو ما تؤكده صور مجهرية مضان (الشكل 2B). كلا تدفق البيانات cytometric وكذلك صور مجهرية مضان تشير إلى أن جميع الخلايا و transfected باستمرار مع توزيع متجانس من سيرنا بين الخلايا وكذلك داخل الخلايا. هذا هو على النقيض من العديد من الكواشف ترنسفكأيشن الكيميائية لأرقام المقارنة 2A و 2B تظهر البيانات تدفق cytometric منها ومضان الصور المجهرية عن وكيل ترنسفكأيشن الكيميائية باستخدام النهج القائم على الدهون. وتشير هذه الأرقام إلى أن اثنين من السكان متميزة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يمكن الكشف عنها. السكان الأول يشبه الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل اتباعهالجناح Nucleofection. فهي تتميز منخفضة مضان العام وتوزيع متجانس من سيرنا داخل الخلايا. يتم وضع علامة السكان الثاني قبل أكثر كثافة مضان الذي ينبع من الكتل داخل الخلايا مشرقة جدا من سيرنا. يبقى التشكل الخلوي تتأثر لكلا النهجين ترنسفكأيشن كما يتضح من الفرق المقابل تدخل في الشكل 2C. Transfections باستخدام العائد DNA البلازميد بشكل فعال نتائج مماثلة، على سبيل الأمثلة، يرجى الرجوع إلى Robenek وآخرون (2009) 9 أو شيه وآخرون (2006) 7.
اختيار خلية ثقافة المتوسط بعد ترنسفكأيشن هو من أهمية كبيرة. لذا تم اختبار مختلفة وسائل الإعلام ثقافة الخلية في المقارنة. وسائل الإعلام المختارة هي كل مناسبة لزراعة THP-1 الخلايا وتم اختيارها وفقا لتوصيات ونزا وسائل الإعلام للتطبيق لمرحلة ما بعد زراعة Nucleofection الشكل 3 يمثل MEDIAT سيرناإد ضربة قاضية كفاءة استخدام سيرنا الموجهة ضد IL10RB (انترلوكين 10 مستقبلات سلسلة β) مرنا. لجميع وسائل الإعلام اختبارها تم تخفيض التعبير عن IL10RB بشكل كبير إلى حوالي 10 إلى 20٪ من مستوى التحكم (الشكل 3). إلا أن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تختلف تبعا لثقافة المتوسط في قدرتها على الاستقطاب. تم زراعة THP-1 الضامة transfected مع إما غير محددة سيرنا التحكم أو IL10RB محددة سيرنا في وسائل الإعلام المختلفة بعد ترنسفكأيشن وتعامل مع IL10. بعد ذلك تم قياس مستويات التعبير عن الجينات التي يسببها SOCS3 IL10 (القامع من إشارات خلوى 3) على مستوى مرنا بواسطة RT-QPCR. تحدث خلافات بين وسائل الإعلام والثقافة فيما يتعلق بمدى تحريض SOCS3 التعبير مرنا (الشكل 4)، والحث لكل وسائل الإعلام اختبار ماوس T خلية Nucleofector المتوسطة، LGM3، X-VIVO 20 و IMDM كانت 19.5 [17،7-21،5 ]، 11.5 [8،5 حتي 15،7]، 8.0 [4،6 حتي 14،2] و 7.2 [5،6-9،5] أضعاف، على التوالي. وتطبيق refore للماوس T خلية Nucleofector المتوسطة هو أمر حيوي. بالإضافة إلى ذلك، كانت الاختلافات في تأثير ضربة قاضية من IL10RB على SOCS3 التعبير بعد العلاج IL10 ملاحظتها، تم تخفيض مستويات التعبير عن SOCS3 مرنا إلى 9.5 [8،8 حتي 10،3] أضعاف في ماوس T خلية Nucleofector المتوسطة، 2.1 [1،1-4،1] أضعاف في LGM3، 4.8 [3،2-7،2] أضعاف في X-VIVO 20 و 3.3 [2،7-3،9] أضعاف في IMDM. هذه القيم تتوافق مع تخفيضات SOCS3 التعبير في وسائل الإعلام المختلفة إلى 49٪، 18٪، 60٪، و 45٪ على التوالي. تخفيض يسببها IL-10-SOCS3 التعبير بعد ترنسفكأيشن من IL10RB سيرنا يؤكد downregulation الناجح IL10RB من قبل ترنسفكأيشن.
الرقم 1. توصيف transfected THP-1 الضامة. مكانة مميزة من الخلايا لا يتأثر كما يتضح من المجهرية الضوء وتدفق cytometric يحلل المشترك untransfectedخلايا ntrol مقابل THP-1 الضامة transfected وفقا لبروتوكول المقدمة. وقد تختلف THP-1 الضامة مع 10 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية لمدة 48 ساعة وtransfected مع fluorescently المسمى (اليكسا 488) التحكم غير محددة سيرنا. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن إما واتخذت صورة من الخلايا الحية (B)، أو تم فصل الخلايا عن طريق Accutase أنا العلاج وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي (A). وقد أجريت موت الخلايا المبرمج ونخر تلطيخ باستخدام Annexin V-فيكوإيريترين (PE) (C) و 7 aminoactinomycin (7-AAD) (D). تم تحديد كفاءة ترنسفكأيشن (E) عن طريق التدفق الخلوي باستخدام التسمية مضان تعلق على سيرنا. يتم إظهار إشارة مضان من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (أسود) ضد إشارة التحكم (الرمادي). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت متباينة الشكل 2. مقارنة التوزيع داخل الخلايا سيرنا بعد Nucleofection مقابل lipofection. THP-1 الخلايا لمدة 48 ساعة وفقا لهذا البروتوكول وثم transfected إما عن طريق Nucleofection أو lipofection. تم الحصول على نتائج lipofection عرض استخدام عدة Xtremegene سيرنا وفقا لتوصيات الشركة الصانعة مع نسبة المكلف كاشف لسيرنا من 4: 1. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن تم فصل الخلايا إما مع Accutase أنا لتحليل تدفق cytometric أو تقييم المجهر مع الخلايا الحية. تم تحديد (A) كفاءة ترنسفكأيشن وتوزيع سيرنا لكل خلية داخل السكان التدفق الخلوي باستخدام التسمية مضان تعلق على سيرنا، وتظهر الضوابط دون transfected سيرنا في الرمادي، وأظهرت عينات transfected مع سيرنا في الأسود. (B) مضان المجهريالصور تظهر التوزيع داخل الخلايا fluorescently المسمى سيرنا (فلور اليكسا 488). يمثل شريط نطاق 40 ميكرون. (C) التفاضلية صورة التدخل النقيض المقابل لصورة مضان. يمثل شريط نطاق 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
بوساطة سيرنا الشكل 3. ضربة قاضية من IL10RB في transfected THP-1 الضامة. و transfected THP-1 الضامة وفقا لبروتوكول المبين. بعد ترنسفكأيشن الخلايا المزروعة في أربع وسائل الإعلام المختلفة والثقافة، وهي ماوس T خلية Nucleofector المتوسطة (A)، IMDM (B)، LGM3 (C)، وX-VIVO 20 (D)، على أن تستكمل كما هو موضح في قسم البروتوكول. Cو transfected ملتعلمي إما مع سيطرة غير محددة سيرنا (السيطرة) أو IL10RB محددة سيرنا (IL10RB). كما ضوابط إضافية شملت العينات التالية: التحكم في نبض، مثال. الخلايا التي خضع ترنسفكأيشن في غياب سيرنا (نبض)، والتحكم المتوسطة، مثال. الخلايا التي لم تتلق سوى التغييرات من وسائل الإعلام ثقافة لكنه بقي دون علاج خلاف ذلك. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن حضنت الخلايا في المصل خالية المتوسطة مع أو بدون 50 نانوغرام / مل IL10 لمزيد من 24 ساعة. وقد تم قياس التعبير IL10RB بواسطة RT-QPCR. تظهر الرسوم البيانية المتوسط من ثلاث تجارب مستقلة، أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. * P <0.05. ** P <0.01. *** ع <0.001 مقابل السيطرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تعتمد على IL10 تنظيم SOCS3 بعد ضربة قاضية من IL10RB في transfected THP-1 الضامة. و transfected THP-1 الضامة وفقا لبروتوكول صفها. بعد ترنسفكأيشن الخلايا المزروعة في أربعة مختلف وسائل الإعلام ثقافة ماوس T خلية Nucleofector المتوسطة (A)، IMDM (B)، LGM3 (C) وX-VIVO 20 (D) تستكمل كما هو موضح في قسم البروتوكول. و transfected الخلايا إما مع سيطرة غير محددة سيرنا (السيطرة) أو IL10RB محددة سيرنا (IL10RB). كما ضوابط إضافية شملت العينات التالية: التحكم في نبض، أي الخلايا التي خضع ترنسفكأيشن في غياب siNRA (نبض)، والتحكم المتوسطة، مثال. الخلايا التي لم تتلق سوى التغييرات من وسائل الإعلام ثقافة لكنه بقي دون علاج خلاف ذلك. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن حضنت الخلايا في مصل المتوسطة الحرة مع أو بدون 50 نانوغرام / مل IL10 لمزيد من 24 ساعة. SOCS3 expreوقد تم قياس ssion بواسطة RT-QPCR. تظهر الرسوم البيانية المتوسط من ثلاث تجارب مستقلة، أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. *، # P <0.05. **، ## P <0.01. ***، ### p <0.001 مقابل السيطرة ومقابل السيطرة + IL-10، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بروتوكول المذكورة هنا يقدم وسيلة موثوق بها وفعالة لبالنقل THP-1 الضامة التي عادة ما تكون صعبة نوعا ما لبالنقل. لا يمكن أن يتحقق مع الكفاءات ترنسفكأيشن ترنسفكأيشن من فوق 90٪ للسيرنا دون انخفاض كبير في حيوية الخلية. قد تكون أقل بسبب حجمها ولكن ترنسفكأيشن كفاءتها بحوالي 70٪ وعادة ما يمكن أن يتحقق من الكفاءة لالبلازميدات. كفاءة بوساطة سيرنا ضربة قاضية يمكن أن تصل إلى 80 إلى 90٪ اعتمادا على سيرنا التطبيقية. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه لا يتعارض مع تمايز الخلايا. بعد ترنسفكأيشن الخلايا لا تزال تستجيب عادة للعامل التمايز سلطة النقد الفلسطينية (الشكل 1A 1B لوالشكل 4) 12. وبالإضافة إلى ذلك الاستقطاب الخلوي بواسطة المحفزات خلوى مثل IL10 أو LPS / IFNγ لا يتأثر 12، على الرغم من أن هذا يعتمد أيضا بقوة على الوسيطة المحددة للزراعة بعد ترنسفكأيشن لق هو مبين في الشكل 4.
هناك عدة خيارات داخل الإجراء الذي يمكن تعديلها من أجل التكيف بروتوكول لمتطلبات محددة. كما هو مبين في الشكل 4 الخلايا تتفاعل بشكل مختلف لنفس التحفيز IL10 اعتمادا على مستنبت المحدد بعد ترنسفكأيشن. هذا يشير إلى أن تركيبة المتوسط لها تأثير قوي على السلوك الخلوي. كما أثر تفرضها المتوسطة قد تختلف لمختلف المحفزات التجريبية، فمن الممكن أن المتوسط الأمثل قد تتغير، وبالتالي هناك حاجة للتحقق من مدى ملاءمة وسيلة لتجارب مختلفة بشكل مستقل. لكن على المديين المتوسط RPMI-1640، وهو المتوسطة الافتراضية المستخدمة للزراعة THP-1 خلايا، أثبت أنه غير ملائم للزراعة بعد ترنسفكأيشن كما لوحظ وجود خسائر كبيرة في حيوية الخلية. وعلاوة على ذلك البروتوكول يمكن أيضا أن تطبق على THP-1 حيدات دون تمييز مسبق سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها هذا،من الواضح أن يزيل الحاجة إلى مفرزة خلية أثناء الإجراء ولكن كل الخطوات المتبقية لا بد من تعديلها. وحيدات THP-1 يمكن أن تكون متباينة بعد ذلك إذا لزم الأمر.
العناصر الأكثر أهمية للبروتوكول هي أولا وثانيا مفرزة الوقت اللازم لترنسفكأيشن. يجب إجراء مفرزة كما بلطف قدر الإمكان، من أجل الحفاظ على بقاء الخلية عالية. لذا نوصي مفرزة الأنزيمية خفيفة نسبيا قبل Accutase أنا على أساليب عدوانية تماما مثل trypsinization. تم العثور على طرق أخرى مفرزة مثل العلاج مع Lidocain أو إلغاء لتكون ضارة نوعا ما، ويجب عدم استخدامها. في حالة أن 30 دقيقة من العلاج Accutase أنا لا ينبغي أن تكون كافية لفصل كل الخلايا بشكل صحيح وهذا هو عادة مؤشرا على Accutase أنا حل المخزنة بطريقة غير صحيحة أو انتهت صلاحيتها أو من عدد كبير جدا من تجميد أذاب دورات. لقد حصلنا على نتائج جيدة عن طريق تخزين مأخوذة صغيرة من Accutase أنا في -20 °C للحد من عدد من دورات تجميد أذاب. ولكن عندما يكون هناك عدم كفاية مفرزة إما استبدال Accutase أنا مع Accutase جديدة أو زيادة فترة حضانة تصل إلى 1 ساعة. بالإضافة التنصت طيف أو الشطف من قارورة أو لوحة يمكن أن تساعد مفرزة. بخصوص الوقت اللازم لترنسفكأيشن قد حصلت على الوقت تعرض الخلايا إلى حل Nucleofector النقي تأثير كبير على بقاء الخلية، وبالتالي يجب أن تكون قصيرة قدر الإمكان. أفضل طريقة لتحقيق ذلك هو تنفيذ كل ترنسفكأيشن في وقت (الخطوات 2،10-2،15) وليس transfections متعددة في نفس الوقت.
إذا ضربة قاضية كفاءة منخفضة، وهذا عادة لا ينتج عن انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، ولكن هذا يمكن التحقق بسهولة باستخدام التدفق الخلوي أو مضان المجهري وfluorescently المسمى سيرنا أو البلازميد ترميز GFP. في الغالب السبب هو سيرنا أو بلازميد الحمض النووي غير فعال. في ظل هذه الظروف، ينبغي النظر إلى زيادة كمية سيرنا (تصل إلى 2-3 ميكروغرام) أوبلازميد الحمض النووي (تصل إلى 1-2 ميكروغرام) أو استخدام أو التعبير سيرنا ناقلات مختلفة إذا كانت متوفرة. بدلا من ذلك، يمكن تحقيق نتائج مرضية أيضا باستخدام مجموعة من عدة الرناوات siRNAs مختلفة موجهة ضد الهدف نفسه. وعلاوة على ذلك، قد يطلب وقت التجارب بالطبع لتحديد بدقة الفترة من تأثير القصوى، والتي عادة ما يتم التوصل بعد 24-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
وبصرف النظر عن ترنسفكأيشن بواسطة Electroporation للوهناك المزيد من تقنيات راسخة للترنسفكأيشن من خلايا الثدييات. في كثير من الأحيان تطبيق أنظمة وكلاء ترنسفكأيشن الكيميائية التي يمكن أن تشكل مجمعات مع الحامض النووي البضائع ومن ثم تسهيل النقل إلى الخلايا. وتستند الكواشف الأكثر شيوعا سواء على أنواع الدهون المختلفة أو يمكن اختيار من عدد من البوليمرات الموجبة 3. لكل نهج مجموعة متنوعة متاح تجاريا. هذه الكواشف ترنسفكأيشن توفر ميزة أنها عادة ما تكونسهلة الاستخدام، لا تتطلب الكثير من الوقت، والعمل مع الخلايا الملتصقة أيضا، وبالتالي إزالة الحاجة للانفصال. للأسف، الضامة هي صعبة نوعا ما لبالنقل من هذه الأساليب لأنها لا تتكاثر بشكل ملحوظ في المختبر، وامتلاك آليات الدفاع ضد DNA الأجانب عصاري خلوي 13-15. وبالتالي، يؤدي النهج ترنسفكأيشن الكيميائية في كثير من الأحيان إلى انخفاض حاد في بقاء الخلية. ولكن كما هو مبين في الشكل 2 هناك وكلاء ترنسفكأيشن الكيميائية التي يمكن نقل بنجاح سيرنا في الضامة، ولكن كما تدفق cytometric (الشكل 2A) والمجهرية الفلورسنت (الشكل 2B) يحلل تشير فشلوا في تحقيق نفس توزيع متجانس من سيرنا داخل الخلايا و حصلت عليها Nucleofection. في الواقع، فإن البيانات تشير إلى أن تدفق cytometric اثنين من مجموعات مختلفة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يحدث، أولا يبلغ عدد سكانها مع مضان مماثلة لخلايا بعد Nucleofectiتم الكشف عن وثانيا هناك عدد السكان مع أكثر كثافة مضان. ما زالت هناك حاجة تأكيدا واضحا لكننا نفترض أن عدد السكان هو الأول في مضان المجهري متطابقة مع تلك الخلايا التي تظهر توزيع متجانس من سيرنا الفلورسنت داخل العصارة الخلوية في حين من المرجح يتوافق السكان الثاني إلى الخلايا مع الكتل مشرقة جدا. البيانات تدفق cytometric هو مبين في الشكل 2A تشير إلى أن نتائج nucleofection في أقل سيرنا في كل خلية من النهج lipofection بديل. لكن البيانات في الشكل 3 يبين أنه حتى كمية صغيرة نسبيا من سيرنا أدرجت بواسطة Nucleofection هو بالفعل ما يكفي لمدة 80 إلى 90٪ ضربة قاضية من الجين المستهدف. وبالتالي فإن مبلغ إضافي قدره سيرنا أدرجت من قبل السكان الثاني بعد ترنسفكأيشن الكيميائي هو الفائض المحتمل جدا وبالتالي هو أكثر من المحتمل أن يسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها لمزيد من زيادة كفاءة ضربة قاضية. بغض النظر عن ذلك تشكيل الكتل داخل الخلايا بالفعل غير مرغوب فيه في حد ذاته منذ تلك الجزيئات سيرنا من المرجح يست وظيفية أو على الأقل أقل كفاءة من جزيئات حرة وسيرنا قد تسبب من آثار الهدف. وعلاوة على ذلك الطبيعة الحقيقية لهذه الكتل ليست واضحة بعد. فمن الممكن أن هذه النقاط المضيئة تمثل الإندوسومات مبينا أن سيرنا كان المنضوية بواسطة الخلايا ولكن في وقت لاحق إطلاق سراح من الإندوسومات فشلت وسيرنا يبقى المحاصرين، وبالتالي غير فعالة. بدلا من البقع يمكن أن تكون الكتل التي تتشكل داخل الخلية. التقييمات الوظيفية للترنسفكأيشن الكيميائية لا تزال معلقة، وبالتالي لا يوجد بيانات قاطعة على كفاءة ضربة قاضية يمكن إجراء حتى الآن، لا يزال وجود اثنين من السكان متميزة بالفعل غير المواتية وهذا يعني أن جميع نتائج تصف المتوسط من كلا الشعبين، وهذا لا بالتالي لا تتوافق مع أي من السكان. لهذا السبب Nucleofection هو النهج متفوقة.
الحمار = "jove_content"> ومع ذلك هناك أيضا قيود على إجراء ترنسفكأيشن المذكورة هنا. منذ الخلايا يجب أن تكون في تعليق لحاجة الخلايا الملتصقة Nucleofection لتكون منفصلة، الذي يعرض عامل ضغط إضافي للخلايا. وعلاوة على ذلك البروتوكول كله وليس مضيعة للوقت. منذ transfections لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد، ولكن يجب أن يؤديها بسرعة من أجل تجنب تلف الخلايا، وعدد العينات يقتصر على حوالي 8 - 10 في التجربة. وبالتالي، لا يناسب هذا البروتوكول لمشاريع فحص إنتاجية عالية. لتطبيقات إنتاجية عالية تتوفر أنظمة Nucleofector مختلفة. أولا، هناك نظام 4D-Nucleofector التي توفر شكل الشريط 16 أيضا. لإنتاجية أكبر حجما، وهناك نظام المكوك 96 جيدا وكذلك نظام HT 384 Nucleofector. ولكن كما تعمل هذه الأنظمة الجديدة مع أقطاب موصلة البوليمر بدلا من الألومنيوم، وبالتالي الظروف الكهربائية، أي البرامج وكومبوسition من الحل Nucleofector، تغيرت تبعا لذلك، لا بد من تحديد ما إذا كان يمكن نقل بروتوكول لدينا لتلك النظم.
ومع ذلك، على الرغم من هذه القيود بروتوكول المقدمة هنا لا تسفر عن ترنسفكأيشن موثوقة وفعالة من THP-1 الخلايا التي متفوقة على جميع النهج غير الفيروسية الأخرى. هذا البروتوكول تمكن التحقيق من آثار غيرت التعبير الجيني في خلايا THP-1 والتي تفرق في جميع الجوانب الأخرى واستقطاب بشكل طبيعي وبالتالي تظهر آثار جانبية أقل قدر من ترنسفكأيشن ممكن.
Disclosures
وترعى تكاليف النشر لهذا المقال الفيديو ونزا المجموعة المحدودة
Acknowledgments
نحن ممتنون لونزا المجموعة المحدودة لرعايتها هذا المنشور من خلال تغطية تكاليف النشر. نشكر دويتشه Infarktforschungshilfe، فيلهلم-فيلان شتيفتونغ، ارنست سولفاي شتيفتونغ، وTHÜRINGER Ministerium FÜR Bildung، Wissenschaft اوند راديو كولتور إلى الدعم المالي لSL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
- Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
- Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
- Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
- Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
- Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
- Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
