Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض، Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. اليرقية تربية من اثنين A. المجموعات الضنك إلى سن الرشد

  1. تعيين اثنين خزانات الضوئية مع الإضاءة القابلة للبرمجة في 21 درجة مئوية لمدة الأمثل السكون التعبير 16 والرطوبة النسبية حوالي 80٪.
    1. برنامج مجلس الوزراء واحد ل16L: ضوء 8D: دورة الظلام (غير السكون الذي يحفز LD الضوئية). تعيين مجلس الوزراء الثاني ل8L: 16D ضوء: دورة الظلام (السكون حمل) 13.
    2. "أضواء على 'برنامج في نفس الوقت في كل من خزائن لمزامنة الوقت الساعة البيولوجية بين الفترات الضوئية.
  2. حساب كمية من البيض اللازمة لأداء التجربة. تهدف ل300-500 بيضة في القفص. ما لا يقل عن ثلاثة تكرار أقفاص السكون وثلاثة تكرار هناك حاجة إلى أقفاص غير الكمون لتوليد RNA. هذه المجاميع إلى كاليفورنيا. 1،800-3،000 البيض في التجربة.
    1. يفقس البيض عن طريق غمر أوراق البيض في كاليفورنيا. 500 مل من H 2 O. منزوع الأيونات
    2. إضافة <م> كاليفورنيا. 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان كما هو موضح سابقا 24. تغطية الحاويات مع شبكة، والحفاظ على شبكة في مكان مع الشريط المطاطي.
    3. ضع في مجلس الوزراء LD الضوئية لكاليفورنيا 24 ساعة.
  3. نقل اليرقات إلى 10 × 10 × 2 سم بيتري أطباق مليئة كاليفورنيا 90 مل منزوع الأيونات H 2 O.
    1. الحفاظ كاليفورنيا 30 يرقات لكل طبق. نقل اليرقات لتنظيف الأطباق كل 48-72 ساعة، على سبيل المثال في أيام الاثنين والأربعاء، والجمعة (MWF) 24.
    2. تغذية كاليفورنيا 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان في المياه منزوع الأيونات كل MWF كما سبق وصفها 24.
  4. انشاء 03:57 أقفاص الكبار لكل معاملة الضوئية، حيث يضم كل قفص لتكرار البيولوجي.
    1. من جانبي 9.5 L الدلاء، وقطع واحد 10-ب-14 سم حفرة، وثقب آخر مع 15 سم القطر. شركةVER الأول مع شبكة. قطع ما يقرب من طول القدم لتخزين العظام، والغراء طرف واحد في جميع أنحاء داخل حفرة أخرى.
    2. قطع نهاية سفح تخزين وإيقاف عقدة مغلقة - مفتوحة فقط عند الحاجة الوصول إلى المناطق الداخلية من القفص. لغطاء القفص، وقطع من كل من الداخلية، ولم يتبق سوى الحافة، واستبدال البلاستيك الداخلية مع شبكة 24.
    3. لاحظ الضوئية، وتكرار العدد، قفص تاريخ البدء، وغيرها من المعلومات ذات الصلة إلى التجربة مع علامة دائمة على جانب القفص.
  5. تبطن الجزء السفلي من أقفاص الكبار مع ورق الترشيح الرطب. بلل ورقة الترشيح مع ما يكفي منزوع الأيونات H 2 O لزيادة الرطوبة المحلية في القفص، ولكن تجنب المياه الراكدة، والتي يمكن أن تحفز وضع البيض على ورقة الترشيح 24. تحقق من ورقة الترشيح يوميا لمدة التجفيف، وإعادة الرطب عند الضرورة.
  6. لإنتاج البيض كافية لمكتبة RNA، وتشمل على الأقل 100 إناث / 9.5 L كاليفورنياجنرال الكتريك، مع عدم وجود أكثر من 500 البعوض في القفص.
  7. جمع MWF الشرانق وضعها في كوب صغير من H 2 O نظيفة في كثافة لا يزيد عن 50 الشرانق في 25 مل H 2 O. نقل كوب الشرانق إلى قفص الكبار. مكان أقفاص في مجلس الوزراء الضوئية منها - A. الضنك الشرانق وحساس 15.
  8. ضمان اليومية ان H 2 O في أكواب غير نظيفة وواضحة، وإزالة الشرانق ميت، لأن تراكم الشرانق ميت يمكن أن يسبب النفوق الجماعي. إزالة H 2 O أكواب بعد ظهور كل الشرانق.
  9. وضع الزبيب العضوية على شبكة العليا من القفص لتوفير السكر للبالغين ظهرت. مراقبة الزبيب، وتغييرها كل 3-5 أيام لمنع تراكم العفن.

2. صيانة الكبار إلى السماح التزاوج وإنتاج البيض

  1. الحفاظ على أقفاص في الرطوبة العالية (حوالي 80٪) من بطانة أسفل القفص مع ورق الترشيح رطبة، وتوفير الوصول إلى الزبيب غير متعفن، كما هو موضح أعلاه (Sectiإضافات 1.5 و 1.9).

3. الدم التغذية

  1. الاستعداد للإناث الدم التغذية بين يومين إلى ستة أيام بعد eclosion لضمان أن الإناث قد تعرضت لثمانية أيام على الأقل قصيرة لا لبس فيها، قبل أن يبدأ وضع البيض لنحو 100 بيضة٪ السكون 14.
  2. إعداد نظام تغذية Hemotek غشاء. قم بتوصيل وحدة التغذية في امدادات الطاقة. ضبط درجة الحرارة كل وحدة إلى 37 درجة مئوية باستخدام المسمار تعديل. استخدام مقياس الحرارة الالكتروني والتحقيق لقياس درجة حرارة وحدة التغذية أثناء المعايرة.
  3. إعداد الخزان وجبة. تمتد مربع من غشاء الكولاجين التغذية خلال فتحة الخزان وجبة وضمان الحصول عليها مع يا الدائري. سحب بعناية الزوايا لإزالة التجاعيد. تقليم الغشاء الزائدة مع مقص.
    ملاحظة: غشاء الكولاجين قد لا تعمل بشكل جيد لجميع أنواع البعوض، وأنه قد يكون من الضروري محاولة عدة أنواع للعثور على غشاء الأمثل إذا كان يعمل معالأنواع الأخرى من A. الضنك. بارافيلم يعمل بشكل جيد مع بعوض الكيولكس.
    1. إذا تم تخزين الدم المجمدة، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل استخدام.
    2. عقد الخزان ذلك الغشاء لأسفل، غير معتمد، والموانئ ملء تواجه ما يصل. استخدام ماصة نقل أو حقنة لملء الخزان مع ما يقرب من 3 مل من الدم الكامل من الدجاج الذي لديه سترات الصوديوم بوصفها مضادة للتخثر. ختم ملء الموانئ مع المقابس مصنوعة من البلاستيك.
  4. إرفاق أعدت الخزان إلى وحدة التغذية من قبل الشد وضعها على مسمار على لوحة نقل الحرارة على الجزء السفلي من وحدة التغذية. عكس وحدة التغذية ووضعه على أعلى القفص، جنبا غشاء أسفل، بحيث البعوض يمكن أن تغذي من خلال شبكة من القفص. حافظ على وحدة التغذية في قفص لمدة 45 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من التغذية.

4. الحث على وضع البيض

  1. أربعة إلى خمسة أيام بعد انتهاء وجبة الدم وتجهيز كل قفص مع الظلام الملونة 50 مل جحتى اصطف مع غير مقصور رقة إنبات البذور (ورقة البيض) أو بمادة منشفة غير ابيض الورق وملء منتصف الطريق مع الماء منزوع الأيونات 9. إذا كان أكثر من 250 البعوض هي في قفص، استخدم كوبين.
    ملاحظة: للحصول على أقفاص صغيرة أو قنينة واحدة من الإناث، "ضخ القش" في حاويات وضع البيض قد يزيد وضع البيض بسبب رائحة النباتات الجرثومية 25.

5. جمع وتخزين البيض

  1. بدء جمع البيض في غضون 4-5 أيام من تغذية الدم لإنتاج البيض قمم عادة بعد حوالي خمسة أيام التغذية الدم، ومن ثم ينحسر خلال الاسبوع المقبل.
  2. تختلف وتيرة جمع البيض على الضروريات من التجربة. لأغراض عامة، وجمع الأوراق البيض على جدول زمني MWF. إزالة الأوراق البيض من كل قفص واستبدالها مع ورقة جديدة. ضع أوراق إزالتها مؤخرا في أطباق بتري وتخزينها في SD مجلس الوزراء الضوئية لتجنب آثار الخلط من تخزين البيض.
  3. السماح الأوراق البيض لإعادة الرئيسية الرطب لمدة 2 أيام بعد وضع البيض للسماح بتشكيل المصلي بشرة، والذي يزيد من مقاومة جفاف البيض 26.
  4. ما يقرب من 48 ساعة جمع آخر، والبيض الجافة في الهواء الطلق. تجفيف الورق مثل أنه يعرج ورطبة قليلا لمسة، ولكن ليس الرطب حتى أن ورقة مظلمة من H 2 O أو يحفز الفقس من البيض.
    ملاحظة: "× 4" ورقة 6.5 قد يستغرق حوالي 3.5 ساعة لتجف. الحرص على عدم الإفراط في تجفيف أوراق البيض، لأن ذلك سيؤدي إلى تجفيف البيض 27.
  5. احتياطي البيض إضافية من كلا LD وSD الضوئية لتقييم حالات السكون وتفسير تأثير دور التعرض للضوء (انظر قياس الكمون، القسم 6).
  6. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على الأوراق البيض في 21 ° C وحوالي 80٪ الرطوبة في أطباق بتري. حافظ على أطباق بتري في حاوية تخزين تثبرور مع قارورة من الماء للحفاظ على رطوبة المحلية والتطور الجنيني يأخذ أربعة إلى خمسة أيام في 21 ° C.
ove_title "> 6. قياس الكمون الإصابة

  1. استخدام أجنة محفوظة إضافية (انظر تحفيز وضع البيض، القسم 4) التي هي 7-20 يوما من العمر لقياس استجابة السكون.
  2. تسجيل عدد من البيض موجودة على كل ورقة بيضة.
  3. تحفيز البيض ليفقس من قبل غمر تماما أوراق البيض الفردية في طبق 90 مل بيتري مع ما يقرب من 80 مل H 2 O. منزوع الأيونات إضافة ما يقرب من 0.25 مل الطين الغذاء.
  4. بعد 24 ساعة حصر عدد الفقس الأولى يرقات العمر. وضع طبق بتري على سطح أسود لتصور اليرقات ووضع مصدر الضوء على جانب واحد من الطبق. سوف اليرقات الابتعاد عن مصدر الضوء، والسماح لرصيده واضح لليرقات الفردية. إزالة اليرقات الفردية مع ماصة في حين عد لمنع سرد اليرقات الفردية.
  5. أوراق مكان البيض في طبق بيتري جديدة وإعادة الجافة. إعادة يفقس البيض بعد ~ 1 الأسبوع، ومرة ​​أخرى تتطابق البيض تحاك باستخدام الأسلوب أعلاه.
  6. أوراق مكان البيض مع ش المتبقية البيض ن تحاك في أطباق بتري جديدة 90 مل مع ما يقرب من 80 مل تبيض حل 28. تأكد من أن الأوراق البيض ومغمورة تماما في الحل تبيض وترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان لتجنب رائحة التبييض.
    ملاحظة: التبييض حل يمكن تخزينها ل~ 1 أسبوع في 4 درجات مئوية، ولكن ينبغي على خلاف ذلك أن تدلي جديدة.
  7. تفقد البيض باستخدام المجهر الضوئي كما تبيض سوف مسح المشيمه والسماح التصور للأجنة والبيض من الامم المتحدة وتفقس. إذا تم أجنة البيض، فإن البيض يكون لها لون من البيض مع عيون الظهور عن اثنين من النقط السوداء الصغيرة عكس بعضها البعض على الجانب الظهري. حصر عدد من الامم المتحدة وفقست، البيض المحتوي 13.
  8. تحديد حالات السكون مع الصيغة التالية:٪ السكون = لا. البيض المحتوي الامم المتحدة التي تحاك / (رقم بيض فقس + رقم البيض من الامم المتحدة وتحاك المحتوي) × 100 (13).

7. استخراج الحمض النووي الريبي من البيض / pharate يرقات

ontent "> ملاحظة: استخدام Trizol في غطاء تدفق الصفحي.

  1. فرشاة بيض البعوض التي تحتوي على أجنة نامية أو يرقات pharate في نقاط زمنية تنمية متميزة من الأوراق البيض إلى المطاحن الزجاج باستخدام فرشاة شعر الجمل. طحن البيض في Trizol (1 مل لكل 50-100 ملغ من الأنسجة) حتى المسحوق تماما. استخدام لا يقل عن 400 بيضة في مكتبة لانتاج RNA كافية.
    1. بدلا من ذلك، والمفاجئة البيض تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنابيب microcentrifuge لمدة تصل إلى شهر قبل طحن في Trizol.
  2. أداء استخراج الحمض النووي الريبي في Trizol تليها الأيزوبروبانول هطول الأمطار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. علاج مقاعد البدلاء مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو غيرها من العوامل لإزالة أي nucleases المتبقية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
    1. علاج الحمض النووي الريبي المستخرج مع الدناز. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، احتضان عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. استخدام 1 & #181؛ ل الدناز لمدة تصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل 50 ميكرولتر. زيادة كمية الدناز إذا كان هناك أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل واحد.
    2. تعطيل الدناز عن طريق إضافة 5 ميكرولتر الدناز علقت تعطيل كاشف. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والخلط ثلاث مرات خلال فترة الحضانة (vortexing لطيف).
    3. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1.5 دقيقة. نقل طاف تحتوي على عينات الحمض النووي الريبي المعالجة لأنابيب جديدة لخطوات لاحقة.
  4. تقييم نوعية من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن طريق قياس التألق. إرسال العينات إلى مرفق التخصص مع أداة المناسب لهذه المهمة. ومرفق أداء على رقاقة الكهربائي للهلام لتحديد أحجام الأنواع RNA في العينة، التي تصور صبغة الفلورسنت تغرس في رقاقة. سيتم إرجاع النتائج باعتبارها رحلاني.
    1. تحديد سلامة من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن وجود أو عدم وجود نواتج التحلل، كما يتضح من س جودالقمم و بين 18S و5S قمم RNA الريباسي على رحلاني الناتجة (الشكل 1B).

8. RNA تسلسل

  1. إرسال مجموع عينات الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية بما فيه الكفاية (الشكل 1A) وكمية (عادة> 3 ميكروغرام في المكتبة) إلى مركز تجاري تسلسل لبناء أثرى المكتبات مرنا تقرن نهاية ومرنا التسلسل، بعد البروتوكولات القياسية.
  2. في حالة استخدام حارة أكثر من واحد للتسلسل تجربة واحدة، وتقسيم المكتبات الفردية إلى مسربين لتسلسل لحساب التباين التقني فيما بين الممرات خلال التسلسل.

9. lllumina مقروءة تنظيف

ويلخص الشكل 2 الجزء المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول: ملاحظة. للحصول على قائمة كاملة لجميع البرامج والموارد المستخدمة في قسم المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول، والرجوع إلى الجدول 1. وفيبالإضافة إلى ذلك، الملف التكميلي 1 يحتوي على أمثلة سطر الأوامر لكل من المعلوماتية الحيوية الخطوات التالية البروتوكول.

  1. استخدام ssaha2 29 (الجدول 1) لتحديد مباريات٪ هوية 95 أو أعلى لقاعدة البيانات NCBI UniVec الأساسية (الجدول 1)، A. الضنك تسلسل الرنا الريباسي (بنك الجينات # L22060.1)، ومحولات التسلسل (أمثلة مفصلة سطر الأوامر المتوفرة في ملف إضافي 1). إزالة أزواج القراءة مع المباريات باستخدام بيرل أو أداة البرمجة مماثلة، على سبيل المثال من خلال تكييف بيرل النصي المقدمة (ملف التكميلي 2).
  2. نظيفة المتبقية يقرأ مع الحزمة SolexaQA 30 (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1): تقليم المناطق بنتيجة يعادل PHRED أقل من 20 باستخدام الإعدادات الافتراضية من DynamicTrim.pl.
    1. إزالة يقرأ أقصر من 25 نقطة مع LengthSort.pl على حد سواء إلى الأمام وعكس يقرأ في وقت واحد. تقييم جودة الملفات تنظيفها fastq مع FastQC (الجدول 1

10. التطبيع الرقمية

  1. أداء جولة واحدة من التطبيع الرقمي على تنظيف يقرأ باستخدام أداة الخمير 31 (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1)، normalize-by-median.py على وجه التحديد (باستخدام حجم ك مير 20، تغطية قطع من 20، والعاشر = 1e10).
  2. بدلا من ذلك، إذا كان الجهاز مع RAM عالية متوفرة (مئات باريه)، استخدم الثالوث النصي normalize_by_kmer_coverage.pl (الجدول 1).

11. دي نوفو الجمعية Transcriptome على

  1. الحصول على حق الوصول إلى مجموعة الكمبيوتر أو الكمبيوتر مع ما يصل إلى 256 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي و 24 وحدات المعالجة المركزية، اعتمادا على حجم التجمع.
  2. استخدام الثالوث 32 (الجدول 1؛ الملف التكميلي 1) لتجميع مجموعة الى contigs القراءة تطبيع رقميا. للحد مناستخدام الذاكرة، واستخدام --min_kmer_cov 2.

تقييم جمعية 12.

  1. تشغيل assemblathon_stats.pl من المشروع Assemblathon2 33 على الانتاج contig الثالوث. هذا السيناريو يؤدي العمليات الحسابية الأساسية ذات الصلة لتقييم جودة التجميع، مثل عدد من السقالات، N50، تكوين التجمع، وأكثر من (الجدول 1؛ ملف إضافي 1).

13. الشرح من Transcriptome على تجميعها

  1. أداء Blastx (الجدول 1) من التجمع ضد مجموعة البروتين المرجعية؛ للبعوض، ذبابة الفاكهة، الأنوفيلة الغامبية، بعوض الكيولكس، والزاعجة المصرية إشارات مناسبة. على وجه التحديد، تنسيق ملف FASTA البروتين مرجعية للانفجار، تليها blastx (ملف إضافي 1).

14. خريطة يقرأ إلى الجمعية عن طريق RSEM 34 (الجدول 1)

  1. إنشاء ملف "نسخة إلى الجينات خريطة"، الذيالعمود الأول يحتوي على معرفات الجينات المرجعية، والعمود الثاني معرفات contig. في محرر جداول البيانات، ومبادلة الأعمدة الأولى والثانية من إخراج Blastx، وكتابة هذه الأعمدة إلى ملف txt. استخدام البرنامج LINEBREAK لتحويل فواصل سطر في ملف txt مما أدى إلى تنسيق يونكس.
  2. إنشاء قاعدة بيانات مرجعية من ملف FASTA Transcriptome على استخدام النصي rsem-إعداد الإسناد، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).
  3. حساب القيم التعبير بشكل منفصل لكل مكتبة باستخدام الأمر rsem-حساب-التعبير، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1). كما يقرأ، استخدام الملفات المقترنة fastq الناتجة عن خطوات تنظيف قراءة (الخطوة 9.2).
    1. إذا تم تقسيم RNA من تكرار البيولوجي في مسربين للتسلسل، تشمل كلا من ملفات fastq في حساب التعبير لتوليد ملف واحد.
  4. تحويل نتائج التعبير من كل مكتبة لمصفوفة معالجتها بسهولة من قبل ع الآخركل من برنامج باستخدام المقدمة النصي rsem-توليد للبيانات المصفوفة، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).

15. تحليل التعبير التفاضلي

  1. تثبيت R والمقلم (الجدول 1).
  2. استخدام read.delim لتحميل النتائج RSEM من الخطوة 14.3 (ملف إضافي 1). إذا لزم الأمر، على مدار التهم إلى أقرب عدد صحيح.
    ملاحظة: يوصي دليل المقلم الحد من مجموعة البيانات إلى الجينات مع ارتفاع التعبير يكفي للكشف عن أهمية.
  3. لتنسيق البيانات لالمقلم، وتوليد كائن DGEList من ملف البيانات تحميل (ملف إضافي 1). ثم، وتطبيع البيانات باستخدام TMM التطبيع (ملف إضافي 1). تقدير التفرق المشتركة وtagwise من البيانات (ملف إضافي 1).
  4. تحديد الجينات وأعرب تفاضلي مع Benjamini-هوشبرج تصحيح ف قيمة <0.05 (ملف إضافي 1). رسم توزيع سجل أضعاف تغيير مقابل وفرة (ملف إضافي 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أظهر التألق اثنين من عينات الحمض النووي الريبي تمثيلية شريطين في حوالي 2،000 الإقليم الشمالي (الشكل 1A، B). وتتألف 28S الحشرات RNA الريباسي اثنين من سلاسل عديد النوكليوتيد عقدت معا عن طريق روابط هيدروجينية، التي تتعطل بسهولة عن طريق التسخين وجيزة أو وكلاء التي تعطل روابط هيدروجينية 35. مما أدى مكونات هما تقريبا نفس حجم 18S الريباسي الحمض النووي الريبي. أظهرت عينة الحمض النووي الريبي الثانية مستويات عالية من التدهور (الشكل 1B).

العلاج دور التعرض للضوء من مجموعة ممثلة من A. أسفرت البعوض الضنك في ارتفاع معدل السكون في البعوض تربى لمدة يوم والقصير، وحالات السكون منخفضة في البعوض تربى لمدة يوم ومنذ فترة طويلة، وإن كان هناك بعض الاختلاف بين مكررات (الجدول 2). على سبيل المثال، تكرار معارض SD2 أقل (80٪) حدوث السكون من مكررات المتبقية (87.18٪ - 97.67٪). وكان هذا أيضا تكرار أصغر sampl حجم البريد، لذلك فمن المستحسن أن تخصيص عدد كاف من البيض (> 150) لقياس السكون من أجل الحصول على نتيجة دقيقة.

بعد قراءة التسلسل تنظيف على مكتبة تمثيلية واحد من الكبار A. إزالة الإناث الضنك عدد كبير من يقرأ (من 83853322 إلى 52736065 مجموعه يقرأ لمكتبة تمثيلية واحدة). تخفيض تطبيع الرقمي كذلك عدد من الكل يقرأ على 41435934. والتجمع الثالوث من هذه القراءة ولدت 76377 contigs، مع N50 من 1،879، متوسط ​​طول contig من 1،023.1، وبطول contig الحد الأقصى من 20892 (الشكل 3). يحلل التعبير التفاضلية من سير عمل مماثل من الأجنة تربى تحت ظروف حمل السكون في 11 و 21 يوما كشفت مرحلة ما بعد وضع البيض، 3،128 الجينات وأعرب تفاضلي بين هذه الفترات الزمنية اثنين (الشكل 4).

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "العرض =" 600px ل"/>

الشكل 1: لمحات من التألق سبيل المثال ذات جودة عالية (A) وذات الجودة المنخفضة (B) الاستخراج RNA من A. الضنك. ويمثل محور س أحجام شظايا النوكليوتيدات، والمحور الصادي يمثل القراءات الفلورسنت. لاحظ الفرق في نطاق المحور الصادي بين فريقي (A) و (B). سهام بمناسبة مواقف الرنا الريباسي مختلفة. العصابات واضحة قريبة من الفرقة علامة خضراء تشير إلى تدهور.

الشكل 2

الشكل 2: موجز عن سير العمل المعلوماتية الحيوية من إعداد قراءة لتباين التعبير يمثل كل مربع خطوة في قسم المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول، يرافقه عدد مماثل من كل خطوة بروتوكول.


الرقم 3: الرسم البياني من أطوال contig من الثالوث دي نوفو Transcriptome على التجمع ويبلغ متوسط ​​طول contig هو 1،023.1. لاحظ أن توزيع أطوال contig يميل بشدة نحو contigs أقصر. هذا هو الوضع الطبيعي للدي نوفو Transcriptome على التجمع.

الشكل (4)
الشكل 4: قم 2 أضعاف تغيير مقابل وفرة في التعبير الجيني TMM-تطبيع السكون pharate اليرقات في 11 يوما مقابل 21 يوما بعد وضع البيض، كل نقطة تعين على unigene؛ unigenes أعرب تفاضلي باللون الأحمر. Unigenes مع ارتفاع التعبير في 11 يوما بعد وضع البيض يكون بين القيم الإيجابية أضعاف التغيير، حيثكما unigenes مع ارتفاع التعبير 21 يوما بعد وضع البيض بوجود قيم أضعاف تغيير السلبية.

برنامج / موارد رابط الموقع (الوصول 2014/01/13)
بيرل http://www.perl.org/get.html
الثعبان http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec الأساسية ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
الخمير https://github.com/ged-lab/khmer
ثالوث http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
ثالوثالنصي التطبيع http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 البرامج النصية تقييم https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (والذي يتضمن makeblastdb وblastx) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
LINEBREAK https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
دليل المستخدم المقلم ل http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
المقلم http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

الجدول 1: البرامج والموارد المستخدمة لرانه المعلوماتية الحيوية إجراءات في هذا البروتوكول. وترد عناوين المواقع للوصول بسهولة كل الموارد اللازمة في هذا البروتوكول.

علاج تكرار عدد البيض من 1 الحادي ويفقس عدد البيض من 2 الثانية يفقس رقم أجنة والبيض لم يفقس ٪ الكمون
SD 1 10 0 68 87.18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97.67
SD 4 5 0 46 90.20
SD 5 6 0 79 92.94
LD 1 79 4 9 9.78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

الجدول 2: حسابات حدوث الكمون النتائج من خمس مكررات لكل الضوئية من العمليات الحسابية حدوث السكون. يتم تضمين أعداد اليرقات من اثنين hatchings منفصلة، ​​وكذلك عدد من الامم المتحدة وفقست، البيض المحتوي، والتي هي ضرورية لحساب معدل السكون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويعرض هذا البروتوكول طرق لاكتشاف الجينات وأعرب تفاضلي بسبب photoperiodically السكون الناجم في A. الضنك. بروتوكول مهم في أنه يجمع بشكل فريد تربية البعوض وتقنيات المعلوماتية الحيوية لجعل جميع جوانب التجريبية من برنامج الفيزيولوجيا الجزيئية في متناول المستخدمين المبتدئين - ولا سيما تلك التي تركز على الاستجابة السكون دور التعرض للضوء. الأساليب القائمة، على حد علمنا، لا تقدم الكثير من التفاصيل في البروتوكول تربية - التي غالبا ما تكون ضرورية لتحديد الأخطاء فترة تربية - كما أنها لا تقدم فكرة عن تصميم تجريبي خلال مرحلة تربية من شأنها أن تمكن تحليل بيوينفورمتيك الناجح المصب. وقد تم تحسين الأساليب المقدمة هنا لA. الضنك، وخاصة الطرق تربية، والتي تأخذ عادة ستة أسابيع من جيل مختبر واحد إلى آخر. ومع ذلك، في التطبيقات المستقبلية يمكن تكييفها هذا الأسلوب مع متواضعةتعديلات على أنواع أخرى من البعوض الذي يحمل السكون دور التعرض للضوء 23. وعلاوة على ذلك، فإن التصميم التجريبي العام والمعلوماتية الحيوية سير العمل قابلة للتطبيق لدراسة polyphenisms الأخرى.

عدة نقاط لا مفصل في البروتوكول يجب أخذها في الاعتبار عند تربية A. الضنك اليرقات. الأول، A. الضنك يمكن العثور عليها في مجموعة واسعة من الموائل حاوية الطبيعية والاصطناعية كما هو موضح في الأوراق السابقة 36 و 37. المستخدمة الكثير الاطارات هي مصدر مشترك لليرقات لإقامة المستعمرات المختبر. من المتوقع أن تظهر استجابة قوية السكون 13 السكان جمعها فوق خط العرض 32N في أمريكا الشمالية. وA. تم جمع سلالة الضنك المستخدمة في هذا البروتوكول من ماناساس، VA، وتربى في بيئة المختبر لأكثر من ثمانية أجيال قبل التلاعب التجريبية. ثانيا، ينبغي اختيار الإضاءة في خزائن الضوئية مع الرعاية. المصابيح في خزائنمع وظائف إضاءة مدمجة يمكن أن يسبب ارتفاع درجة الحرارة داخل مجلس الوزراء عندما تتحول الإضاءة أو إيقاف تشغيله. وتشير الملاحظة القصصية يمكن لهذه المسامير درجة حرارة تعطيل استجابة السكون. لمنع هذا، الذي بني في وظائف الإضاءة يجب تعطيل وينبغي تزويد خزانات مع 4 واط لمبة الفلورسنت بارد. الثالثة، اليرقات حساسة للH 2 O الجودة والمواد الغذائية وفرة. لذلك، والإفراط في التغذية قد يؤدي إلى تراكم البكتيريا وفيات اليرقات. رابعا، هناك طرق بديلة لالكبار الدم تغذية إناث البعوض. أغشية الزجاج ونظام غشاء اصطناعي بديل 38، 39، على الرغم من أن نظام HemoTek أداء أفضل في تجربة المؤلفين. ويمكن أيضا الحيوانات الحية (عادة الدجاج أو القوارض) أن تستخدم 38 - في هذه الحالة، من الضروري الحصول على أول شهادة مناسبة من المؤسسي رعاية الحيوان الخاصة بك واستخدام اللجنة (IACUC). خامسا، على الرغم من أنه لا يوجد دليل واضح المنشورة عشرفي البيض حساس 15، وتشير الملاحظات القصصية أن البيض من SD العلاج الضوئية معرض خفضت قليلا حالات السكون عندما تتعرض لالضوئية LD غضون 10 يوما من وضع البيض. وهكذا، تخزين كل SD وLD البيض تحت ظروف SD لإنتاج استجابة السكون القصوى في البيض SD وتجنب أي تأثير الخلط الفترة الضوئية (SD مقابل LD) أثناء التخزين البيض.

جودة عالية RNA أمر ضروري لتوليد البيانات RNA يليها جودة عالية. يجب توخي الحذر وفيرة خلال استخراج الحمض النووي الريبي لتجنب أي تلوث نوكلياز. انخفاض جودة عينات الحمض النووي الريبي، مثل تلك التي تظهر في الشكل 1B، ليست مناسبة للالتسلسل. تقييم نوعية RNA قبل إرسال عينات للتسلسل أمر حتمي. العصابات مميزة من جزيئات الحمض النووي الريبي قد يكون لأنواع مختلفة من الأنسجة الحشرات المستخدمة لاستخراج الحمض النووي الريبي، مثل عصابات أربعة أصغر من 18S هو مبين في RNA رحلاني جودة عالية مرئيةفي الشكل 1A. الأنماط الثابتة للعصابات RNA أخرى من العصابات اثنين على 18S عبر العينات تحت العلاجات البيولوجية متميزة تشير تستطيع بشدة أن هذه العصابات لا تنجم عن تدهور، ولكن تمثل التركيبة البيولوجية للجزيئات الحمض النووي الريبي في أنواع الأنسجة محددة المختار في التصميم التجريبي.

سير العمل المعلوماتية الحيوية المذكورة هنا يسمح للمستخدم مع بعض سطر الأوامر والبرمجة المهارات للحصول على قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي من البيانات البورشيد التسلسل المتولدة من مكتبات RNA منسوخة من اثنين المتناقضة الظروف التجريبية. حين يتعلق هذا المثال الجينات وأعرب تفاضلي بسبب الإضاءة، وهذا العمل يمكن تطبيقها على أي تصميم تجريبي مع اثنين أو أكثر من العلاجات، في أي كائن حي. هناك العديد من الطرق الأخرى للوصول إلى قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي. ومع ذلك، من المرجح أن يكون النهج الأكثر مباشرة بالنسبة للمستخدم المبتدئ هذا البروتوكول. المزيد من السابقbioinformaticians perienced قد ترغب في اتخاذ تدابير إضافية لتحسين التواصل والتكرار التجمع الخاصة بهم. علماء الأحياء مع قليل من دون خبرة المعلوماتية الحيوية قد الكامل أيضا جزء على الأقل من هذا الخط داخل iPlant 40 ديسكفري البيئة، والذي هو واجهة رسومية للمستخدم حرية بيئة تحليل مدفوعة. ومن المرجح أن ظائف iPlant سينمو أكبر في المستقبل من أجل استيعاب خطوط الأنابيب-RNA يليها كامل من دي نوفو المجالس Transcriptome على. وأخيرا، لاحظ أن دليل المستخدم الممتاز يناقش بدقة العديد من الطرق لاستخدام المقلم 41 (الجدول 1) للتحليل التعبير التفاضلي.

في بعض الحالات، يمكن أن سوء المجالس توليد contigs خيالية. هناك العديد من الطرق التي يمكن أن تساعد على تحديد هذه سوء الجمعيات، على سبيل المثال، Uchime 42. ومع ذلك، من التجارب السابقة، وعدد من الوهم الكشف هو منخفضة جدا (<0.1٪)؛ وبالتالي، employinالجا برنامج كشف الوهم قد لا يكون يستحق كل هذا الجهد الإضافي.

تجهيز الإنتاجية العالية، يتطلب بيانات الجيل المقبل من التسلسل القدرة على 1) تخزين كميات كبيرة من البيانات (على مشروع واحد،> 500 جيجابايت)؛ 2) التعامل مع ملفات البيانات الكبيرة التي لا يمكن فتح في كلمة المعالجات التقليدية أو برامج جداول البيانات. 3) إجراء تحليلات التي تتطلب كميات كبيرة من ذاكرة الوصول العشوائي، على سبيل المثال، لدي نوفو التجمع؛ و4) تحليل مجموعات البيانات الكبيرة، سواء من خلال برامج مدفوعة واجهة سطر الأوامر (الذي يتطلب القدرة على تثبيت هذه البرامج، التي غالبا ما تكون غير تافهة)، أو عن طريق الأجنحة التحليل مع واجهات المستخدم الرسومية (مثل غالاكسي 43 أو 40 iPlant ). وسوف يقوم الباحثون مع بعض الكفاءة في سطر الأوامر يونكس ولغة البرمجة كسب أكبر قدر من الفائدة من الحصول على مجموعة الحوسبة المحلية - سواء التي تملكها الجامعة، عن طريق متعاون، أو شراء لمختبر الخاصة بهم. على سبيل المثال، ABوقد أنجز العمل اوفه باستخدام ماكنتوش المملوكة للمختبر (12 النوى، 64 GB RAM، 1 السل القرص الصلب)، ومجموعة الكمبيوتر المملوكة جامعة لجمعية الثالوث. إذا كانت الموارد مشابهة ليست متاحة، يمكن للباحثين بدوره لا يزال لiPlant لإجراء تحليلات واسعة النطاق دون أي تكلفة، ومع انخفاض نسبيا الاستثمار في التدريب نظرا للبيئة واجهة رسومية. ومع ذلك، أولئك الذين يؤدون وتفسير التحليلات لا تزال بحاجة إلى فهم الافتراضات كل برنامج المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

علم الوراثة، العدد 93،
والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter