Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. larveopdræt af Two A. albopictus Grupper til voksenalderen

  1. Sæt to lysperiode kabinetter med programmerbar belysning ved 21 ° C for optimal diapause udtryk 16 og ca. 80% relativ fugtighed.
    1. Program ét kabinet til en 16L: 8D lys: mørke-cyklus (en ikke-diapause inducere LD fotoperiode). Sæt den anden kabinet til en 8L: 16D lys: mørke-cyklus (diapause inducere) 13.
    2. Program 'lys på "på samme tid i begge kabinetter at synkronisere døgnrytmen tid mellem fotoperioder.
  2. Beregn mængden af ​​æg, der er nødvendige til at udføre eksperimentet. Målet for 300-500 æg pr bur. Mindst tre replikere diapause bure og tre replikere er behov ikke-diapause bure for RNA generation. Dette beløber til ca. 1,800-3,000 æg pr eksperiment.
    1. Hatch æggene ved at nedsænke æg papirer i ca. 500 ml deioniseret H 2 O.
    2. Tilføj <em> ca. 1 ml mad gylle består af jord hundemad og artemia som tidligere beskrevet 24. Dæk beholderen med mesh, og holde masken på plads med en elastik.
    3. Placer i LD fotoperioden kabinet til ca. 24 timer.
  3. Transfer udklækket larver til 10 x 10 x 2 cm Petriskåle fyldt med Ca. 90 ml deioniseret H2O
    1. Oprethold ca. 30 larver pr skål. Overførsel larver til at rense retter hver 48-72 timer, for eksempel hver mandag, onsdag og fredag ​​(MWF) 24.
    2. Feed ca. 1 ml fødevarer opslæmning bestående af jorden hundemad og saltvand rejer i deioniseret vand hver MWF som tidligere beskrevet 24.
  4. Opsætning 3-4 voksne bure for hver lysperiode behandling, hvor hvert bur omfatter et biologisk gentagelse.
    1. Fra modstående sider af 9,5 L spande, skåret ud en 10-by-14 cm hul og et andet hul med diameter på 15 cm. Cover den først med mesh. Skær ca. fodlængde af en ortopædisk strømpe og lim den ene ende omkring indersiden af ​​det andet hul.
    2. Skær fodenden af ​​strømpen fra og knude lukket - åben, når der er behov for adgang til det indre af buret. For buret låg, skære alle af interiøret, så kun kanten, og erstatte den indvendige plast med mesh 24.
    3. Bemærk fotoperioden, replikere nummer, bur startdato, og andre nødvendige oplysninger til forsøget med permanent markør på siden af ​​buret.
  5. Line bunden af ​​de voksne bure med vådt filtrerpapir. Fugt filtrerpapiret med tilstrækkelig deioniseret H2O at forøge den lokale luftfugtighed i buret, men undgå stillestående vand, som kan stimulere æglægning på filterpapiret 24. Kontroller filtrerpapir dagligt til tørring, re-våd, når det er nødvendigt.
  6. At producere tilstrækkelige æg til en RNA-bibliotek, omfatter mindst 100 kvinder / 9,5 L caGE, med ikke mere end 500 myg per bur.
  7. Saml pupper MWF og sted i en lille kop ren H2O ved en densitet på højst 50 pupper per 25 ml H 2 O. Overfør pupper cup til en voksen bur. Placer bure i de respektive fotoperioden kabinet - A. albopictus pupper er lysfølsomme 15.
  8. Sikre daglig at H2O i kopper er ren og klar, og fjerne døde pupper, fordi opbygning af døde pupper kan forårsage masse dødelighed. Fjern H 2 O-kopper efter alle pupper opstå.
  9. Placer økologiske rosiner på toppen maske i buret til at levere sukker til dukket voksne. Overvåg rosiner, og ændre dem hver 3-5 dage for at forhindre mug ophobning.

2. Vedligeholdelse af voksne til Tillad Parring og ægproduktion

  1. Oprethold bure ved høj luftfugtighed (ca.. 80%) ved foring buret bunden med et fugtigt filtrerpapir, og give adgang til ikke-mugne rosiner, som beskrevet ovenfor (sections 1.5 og 1.9).

3. Blod-fodring

  1. Forbered dig på at blod-foder kvinder mellem to til seks dage efter eclosion at sikre, at kvinder har været udsat for mindst otte utvetydige korte dage før æglægning begynder for næsten 100% diapause æg 14.
  2. Forbered Hemotek Membrane Fodring system. Sæt fodring enheder i strømforsyningen. Juster temperaturen af ​​hver enhed til 37 ° C ved hjælp af justeringsskruen. Brug et elektronisk termometer og sonde til at måle temperaturen af ​​tilførselsenheden under kalibreringen.
  3. Forbered måltidet reservoir. Stræk et kvadrat af kollagen fodring membran over åbningen af ​​måltidet reservoir og sikre den med en O-ring. Træk forsigtigt hjørnerne for at fjerne rynker; trimme overskydende membran med en saks.
    BEMÆRK: collagenmembran fungerer muligvis ikke godt for alle myg arter, og det kan være nødvendigt at prøve flere typer at finde den optimale membran, hvis du arbejder med enandre end A. arter albopictus. Parafilm fungerer godt med Culex pipiens.
    1. Hvis blod opbevares frosne, optøning ved stuetemperatur i mindst 1 time før brug.
    2. Hold beholderen, så membranen vender nedad, er understøttede, og fyldningen porte opad. Brug en transfer pipette eller en sprøjte til at fylde beholderen med ca. 3 ml fuldblod fra kyllinger, der har natriumcitrat som en antikoagulant. Seal påfyldning havne med plastpropper.
  4. Fastgør fremstillet reservoir til feeder ved at skrue den på tappen på varmeoverføringspladen på bunden af ​​feeder. Vend feeder og placere den på toppen af ​​buret, membranen nedad, så myg kan fodre gennem masken af ​​buret. Hold feeder på buret i ca. 45 min for at maksimere fodring.

4. Stimulere æglægning

  1. Fire til fem dage efter blodmel, udstyre hvert bur med en mørk farvet 50 ml cop foret med ubleget frøspiring papir (æg papir) eller tekstureret ikke-bleget papir håndklæde og fyld halvt op med demineraliseret vand 9. Hvis der er mere end 250 myg er i et bur, bruge to kopper.
    BEMÆRK: For små bure eller single-kvinde hætteglas, kan "hø infusion" i æglægning containere øger æglægning på grund af lugten af den mikrobielle flora 25.

5. Saml og Store Æg

  1. Begynd ægudtagningen inden 4-5 dage efter blod fodring fordi ægproduktionen topper typisk ca. fem dage efter blod fodring, og derefter aftager i løbet af den næste uge.
  2. Varier ægudtagningen frekvens på fornødenheder af eksperimentet. Til generelle formål, indsamle æg papirer på en MWF tidsplan. Fjern æg papirer fra hvert bur og erstatte med nyt papir. Sted for nylig fjernede papirer i petriskåle og butik i SD lysperiode skab for at undgå forstyrrende effekter af æg opbevaring.
  3. Tillad æg papirer at re vigtigste våd for 2 dage efter æglægning at tillade serosale kutikula formation, hvilket øger æg udtørring modstand 26.
  4. Ca. 48 timer efter indsamling, tørre æg i fri luft. Tør papiret, således at den er slap og lidt fugtig at røre ved, men ikke så våd, at papiret er mørkt fra H2O eller stimulerer klækning af æg.
    BEMÆRK: En 6,5 "x 4" papir kan tage ca. 3,5 timer at tørre. Vær forsigtig ikke at over-tør æg papirer, da dette vil resultere i æg udtørring 27.
  5. Reserve yderligere æg fra både LD og SD fotoperioder at vurdere diapause incidens og fortolke fotoperiodiske effekt (se Måling diapause, afsnit 6).
  6. For langtidsopbevaring, holde æg papirer ved 21 ° C og ca. 80% luftfugtighed i petriskåle. Hold petriskåle i en Tupperware lagerbeholder med en kolbe af vand at opretholde den lokale luftfugtighed som fosterudviklingen tager fire til fem dage ved 21 ° C.
ove_title "> 6. Mål diapause Forekomst

  1. Brug yderligere reserverede embryoner (se Stimulere æglægning, afsnit 4), der er 7-20 dage gammel at kvantificere diapause respons.
  2. Registrere antallet af æg til stede på hvert æg papir.
  3. Stimulere æg at klække ved fuldstændig nedsænkning enkelte æg papirer i en 90 ml petriskål med ca. 80 ml ​​deioniseret H 2 O. Ca. 0,25 ml fødevarer opslæmning.
  4. Efter 24 timer stemmer overens med antallet af udklækkede første stadie larver. Anbring petriskålen på en sort overflade for at visualisere larver og placere en lyskilde på den ene side af skålen. Larver vil bevæge sig væk fra lyskilden, giver mulighed for en klar optælling af individuel larver. Fjerne enkelte larver med en pipette mens tælle at forhindre genfortælle individuel larver.
  5. Placer æg papirer i en ny petriskål og re-tør. Re-luge æg efter ~ 1 uge og igen stemmer overens æg klækket ved hjælp af ovenstående metode.
  6. Placer æg papir med resterende u n-udklækket æg i nye 90 ml petriskåle med ca. 80 ml ​​blegning løsning 28. Kontroller, at æg papirer er helt nedsænket i den blegende opløsning, og efterlade under en emhætte natten over for at undgå lugten af ​​blegemiddel.
    BEMÆRK: blegende opløsning kan opbevares i ~ 1 uge ved 4 ° C, men bør ellers gøres frisk.
  7. Undersøg æg ved hjælp af et lysmikroskop som blegning vil rydde chorion og tillade visualisering af befrugtede, un-udklækket æg. Hvis ægget er befrugtede, bliver ægget have en off-white farve med øjne fremstår som to små sorte prikker modsat hinanden på den dorsale side. Stemmer overens med antallet af un-skraverede, befrugtede æg 13.
  8. Bestem diapause incidens med følgende formel:% diapause = nej. befrugtede un-udklækkede æg / (nr. udklækkede æg + nr. befrugtede un-skraverede æg) x 100 13.

7. RNA ekstraktion fra æg / pharate Larver

Indholdsproduktion "> BEMÆRK: Brug Trizol i en laminar strømning hætte.

  1. Brush myg æg indeholder udviklingslandene embryoner eller pharate larver på forskellige udvikling tidspunkter fra æg papirer til glas kværne hjælp af en kamel-hår børste. Grind æggene i Trizol (1 ml pr 50-100 mg væv) indtil den er helt pulveriseret. Brug mindst 400 æg pr bibliotek til opnåelse af tilstrækkelig RNA.
    1. Alternativt snap fryse æg i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i mikrocentrifugerør i op til en måned før formaling i Trizol.
  2. Udfør RNA-ekstraktion i Trizol efterfulgt af isopropanol udfældning i henhold til producentens anvisninger.
  3. Behandl bænken med RNase dekontaminering opløsning eller andre midler for at fjerne eventuelle nukleaser at undgå RNA nedbrydning.
    1. Behandl ekstraherede RNA med DNase. Ifølge producentens anvisninger inkuberes RNA prøver med DNase i 30 minutter ved 37 ° C. Brug 1 & #181 l DNase op til 10 ug RNA i en 50 pi reaktion. Øg mængden af ​​DNase hvis der er mere end 10 ug RNA i én reaktion.
    2. Inaktivere DNase ved tilsætning af 5 pi suspenderet DNase inaktivering reagens. Inkuber 5 min ved stuetemperatur, blanding tre gange i løbet af inkubationsperioden (blid omhvirvling).
    3. Centrifugeres ved 10.000 xg i 1,5 min. Overfør supernatanten indeholdende de behandlede RNA-prøver til friske rør for efterfølgende trin.
  4. Vurdere kvaliteten af ​​det samlede RNA-prøver ved fluorometri. Send prøverne til en specialitet facilitet med ordentlig instrument til denne opgave. Anlægget vil udføre gelelektroforese on-chip til at bestemme størrelsen af ​​RNA-arter i prøven, visualiseret ved fluorescerende farvestof indpodet i chippen. Resultaterne vil blive returneret som et elektroferogram.
    1. Bestem integriteten af ​​den samlede RNA-prøver ved tilstedeværelsen eller fraværet af nedbrydningsprodukter, som det fremgår af tilstedeværelsen of toppe mellem 18S og 5S ribosomalt RNA toppe på den resulterende elektroferogram (figur 1b).

8. RNA-sekventering

  1. Send samlede RNA-prøver med tilstrækkelig høj kvalitet (figur 1A) og mængde (normalt> 3 ug pr bibliotek) til en kommerciel sekventering center for opførelse af berigede parret-end mRNA biblioteker og mRNA sekventering, efter standardprotokoller.
  2. Hvis mere end én vognbane bliver brugt til sekventering af et enkelt forsøg, opdelt enkelte biblioteker i to baner til sekventering til at redegøre for den tekniske variation blandt baner under sekventering.

9. lllumina Læs Rengøring

BEMÆRK: Figur 2 opsummerer bioinformatik del af denne protokol. For en komplet liste over alle programmer og ressourcer, der anvendes i bioinformatik i denne protokol, se tabel 1. IDesuden Supplerende fil 1 indeholder kommandolinje eksempler for hvert af de følgende bioinformatik protokol.

  1. Brug ssaha2 29 (tabel 1) for at identificere kampe i 95% identitet eller højere for at NCBI UniVec Core database (tabel 1), A. albopictus rRNA-sekvens (GenBank # L22060.1), og sekventering adaptere (detaljeret kommandolinje-eksempler i Supplemental File 1). Fjern læste par med tændstikker ved hjælp Perl eller en lignende scripting værktøj, f.eks ved at tilpasse forudsat Perl script (Supplemental File 2).
  2. Ren resterende læser med SolexaQA pakke 30 (tabel 1 Supplerende fil 1): trim regioner med Phred score svarer til mindre end 20 ved hjælp af standardindstillingerne for DynamicTrim.pl.
    1. Fjern læser kortere end 25 bp med LengthSort.pl på både fremad og baglæns læser på samme tid. Evaluere kvaliteten af de rensede fastq filer med FastQC (tabel 1

10. Digital Normalisering

  1. Udfør en runde af digital normalisering på den rengjorte læser hjælp Khmer værktøjet 31 (tabel 1 Supplerende fil 1), specielt normalize-by-median.py (ved hjælp af K-mer størrelse 20, en dækning cut-off på 20, og x = 1E10).
  2. Alternativt hvis en maskine med høj RAM er til rådighed (hundredvis af GBS), brug Trinity s normalize_by_kmer_coverage.pl script (tabel 1).

11. De Novo Transkriptomet Assembly

  1. Få adgang til en computer eller klynge med op til 256 GB RAM og 24 CPU'er, afhængigt af størrelsen af samlingen.
  2. Brug Trinity 32 (tabel 1 Supplerende fil 1) for at samle digitalt normaliserede læse sat i contigs. For at reducerehukommelsesforbrug, brug --min_kmer_cov 2.

12. Assembly Evaluering

  1. Kør assemblathon_stats.pl fra Assemblathon2 projektet 33 på Trinity contig output. Dette script udfører grundlæggende beregninger relevante for at evaluere forsamling kvalitet, såsom antallet af stilladser, N50, montage sammensætning, og mere (tabel 1 Supplerende fil 1).

13. Angivelse af den samlede Transkriptomet

  1. Udfør BLASTX (tabel 1) af samlingen mod en henvisning protein sæt; for myg, Drosophila melanogaster, Malariamyg, Culex pipiens og Aedes aegypti egnede referencer. Konkret formatere henvisningen protein FASTA fil til blast, efterfulgt af BLASTX (Supplemental File 1).

14. Kort Læser til Forsamlingen Brug RSEM 34 (tabel 1)

  1. Opret en "udskrift-til-gen-map 'fil, hvoriførste kolonne indeholder henvisningen gen ID'er, og i anden kolonne contigen ID'er. I et regneark editor, bytte den første og anden kolonne fra BLASTX output, og skriver disse kolonner til en .txt-fil. Brug LINEBREAK program til at konvertere linjeskift i den resulterende .txt fil til Unix-format.
  2. Opret en henvisning datasæt fra transkriptom FASTA fil ved hjælp af rsem-forberede-henvisning script, forudsat i RSEM pakken (Supplemental File 1).
  3. Beregn udtrykket værdier separat for hvert bibliotek ved hjælp af rsem-Beregn-udtryk kommando, forudsat i RSEM pakken (Supplemental File 1). Som læser, skal du bruge de parrede fastq filer som følge af read-rengøring trin (trin 9.2).
    1. Hvis RNA fra en biologisk replikat blev opdelt i to baner til sekventering, omfatter både fastq filer i beregningen udtrykket til at generere en enkelt fil.
  4. Omregning resultaterne fra hvert bibliotek til en matrix let behandles af andre programs hjælp af den medfølgende script rsem-generere-data-matrix, forudsat i RSEM pakken (Supplemental File 1).

15. Differential Expression Analysis

  1. Installer R og Edger (tabel 1).
  2. Brug read.delim at indlæse RSEM resultaterne fra trin 14.3 (Supplemental File 1). Hvis det er nødvendigt, runde tællingerne til nærmeste hele tal.
    BEMÆRK: kantskærer guide anbefaler at begrænse datasættet til gener med høj nok udtryk for at detektere betydning.
  3. Hvis du vil formatere dataene for kantskærer, generere en DGEList objekt fra den indlæste datafil (Supplemental File 1). Derefter normalisere data ved hjælp af TMM normalisering (Supplemental File 1). Vurdere de fælles og tagwise dispersioner af data (Supplerende fil 1).
  4. Identificer differentielt udtrykte gener med en Benjamini-Hochberg korrigerede p-værdi <0,05 (Supplemental File 1). Plot fordelingen af ​​log-fold-ændring vs. overflod (Supplemental File 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorometri af to repræsentative RNA-prøver viste to bånd ved ca. 2.000 nt (figur 1A, B). Insektet 28S ribosomal RNA består af to polynukleotidsekvenser kæder holdes sammen af hydrogenbindinger, som let afbrudt ved kort opvarmning eller midler, der afbryder hydrogenbindinger 35. De resulterende to komponenter er omtrent den samme størrelse som den 18S ribosomale RNA. Den anden RNA-prøve viste høje niveauer af nedbrydning (Figur 1B).

Fotoperiodisk behandling af en repræsentativ gruppe af A. albopictus myg resulterede i høj diapause forekomst i korte dag-opdrættet myg, og lav diapause forekomst i lang dag-opdrættet myg, selv om der var nogen variation blandt gentagelser (tabel 2). For eksempel replikerer SD2 viser lavere (80%) diapause forekomst end de resterende replikater (87,18% - 97,67%). Denne replikat havde også den mindste sampl e størrelse, så det anbefales at afsætte et tilstrækkeligt antal æg (> 150) for diapause måling for at få et præcist resultat.

Post-sekventering læse rengøring på en repræsentant bibliotek fra voksen A. albopictus hunner fjernet et betydeligt antal læser (fra 83853322 til 52736065 total læser for en repræsentant bibliotek). Digital normalisering yderligere reduceret antallet af samlede læser til 41435934. En Trinity samling af disse læser genereret 76.377 contigs, med en N50 på 1.879, gennemsnitlige contig længde på 1,023.1, og en maksimal contig længde på 20.892 (figur 3). Differentiel ekspression analyser fra en tilsvarende arbejdsgang embryoner opdrættet under diapause-inducerende betingelser ved 11 og 21 dage efter æglægning afsløret 3.128 differentielt udtrykte gener mellem disse to tidsperioder (Figur 4).

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>

Figur 1: fluorometri profiler af eksempel høj kvalitet (A) og lav kvalitet (B) RNA ekstraktioner fra A. albopictus. X-aksen repræsenterer størrelserne af nukleotidfragmenter, og y-aksen repræsenterer de fluorescerende aflæsninger. Bemærk forskellen i Y-aksens skala mellem paneler (A) og (B). Pile markerer positionerne for de forskellige ribosomale RNA. De tilsyneladende bands tæt på den grønne markør band indikerer nedbrydning.

Figur 2

Figur 2: Oversigt over bioinformatik workflow fra læst forberedelse til differential udtryk Hver kasse er et skridt i den bioinformatik i denne protokol, ledsaget af det tilsvarende antal hver protokol trin..


Figur 3:. Histogram af contig'en længder fra en treenighed de novo transkriptom samling Den gennemsnitlige contig længde er 1,023.1. Bemærk, at fordelingen af ​​contig'en længder er stærkt skæv til kortere contigs; dette er typisk for de novo transkriptom forsamling.

Figur 4
Figur 4: Log 2 fold-ændring vs. overflod af TMM-normaliseret genekspression af diapause pharate larver på 11 dage vs. 21 dage efter-æglægning Hvert punkt betegner en UniGene;. differentielt udtrykte unigenes er rødt. Unigenes med højere ekspression ved 11 dage efter æglægning have positive fold-ændre værdier, hvorsom unigenes med højere ekspression 21 dage efter-æglægning få negative fold-ændre værdier.

Program / ​​Resource Website URL (adgang 2014/01/13)
perl http://www.perl.org/get.html
python http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Core ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Trinity http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Trinitynormalisering script http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 evalueringsrapporter scripts https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (som omfatter makeblastdb og BLASTX) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
LINEBREAK https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger Brugervejledning http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabel 1: programmer og ressourcer, der anvendes til than bioinformatik procedurer i denne protokol. URL-adresser findes til nemt få adgang til hver af de ressourcer, der er nødvendige i denne protokol.

Behandling Repliker Antal æg fra 1. luge Antal æg fra 2. luge Nej befrugtede, uklækkede æg % Diapause
SD 1 10 0 68 87,18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97,67
SD 4 5 0 46 90,20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9,78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6,52

Tabel 2:. Diapause forekomst beregninger Resultater fra fem gentagelser pr fotoperiode på diapause forekomst beregninger. Antallet af udklækkede larver fra to separate skraveringer er inkluderet, som er antallet af un-skraverede, embryonerede æg, som alle er nødvendige for at beregne diapause incidens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol viser metoder til at opdage differentielt udtrykte gener på grund photoperiodically induceret diapause i A. albopictus. Protokollen er vigtig, fordi den unikt kombinerer myg opdræt og bioinformatik teknikker til at gøre alle eksperimentelle aspekter af en molekylær fysiologi program tilgængeligt for nybegyndere - især for dem, der fokuserer på den fotoperiodiske diapause respons. Eksisterende metoder til vores viden, giver ikke så mange detaljer i opdræt protokollen - som ofte er nødvendigt at identificere opdræt fejl - heller ikke de giver indsigt i eksperimentelle design under opdræt etape, der vil gøre det muligt for en vellykket bioinformatisk analyse nedstrøms. De metoder, der præsenteres her, er blevet optimeret til A. albopictus, især opdrætsmetoder, som generelt tager seks uger et laboratorium generation til den næste. Men i fremtidige applikationer denne metode kan tilpasses med beskedentilpasninger til andre myg arter, der udviser fotoperiodisk diapause 23. Desuden vil den generelle eksperimentelle design og bioinformatik workflow gælder for studiet af andre polyphenisms.

Flere punkter ikke er beskrevet i protokollen bør overvejes, når opdræt A. albopictus larver. Først A. albopictus kan findes i en lang række naturlige og kunstige container levesteder som beskrevet i tidligere artikler 36, 37. brugte dæk partier er en almindelig kilde til larver til oprettelse laboratorie kolonier. Populationer ovennævnte indsamlede 32N bredde i Nordamerika kan forventes at udvise en stærk diapause reaktion 13. A. albopictus stamme i denne protokol blev indsamlet fra Manassas, VA, og blev opdrættet i et laboratorium indstilling for mere end otte generationer forud for eksperimentel manipulation. For det andet bør belysning i fotoperioden kabinetter vælges med omhu. Løg i kabinettermed indbyggede lygtefunktioner kan forårsage temperatur pigge i kabinettet, når belysningen tændes eller slukkes. Anekdotiske observation tyder disse temperaturer pigge kan forstyrre diapause respons. For at forhindre dette, indbyggede lygtefunktioner skal deaktiveres, og kabinetter bør være udstyret med en 4-watt cool-fluorescerende pære. Tredje larver er følsomme over for H 2 O fødevarekvalitet og overflod. Derfor kan over-fodring føre til bakteriel ophobning og larver dødelighed. For det fjerde er der alternative metoder til voksne blod-foder kvindelige myg. Glas membraner er en alternativ kunstig membransystem 38, 39, selvom HemoTek systemet udfører bedre i forfatternes erfaring. Levende dyr (normalt kylling eller gnavere) kan også anvendes 38 - i dette tilfælde, er det vigtigt først at få en passende certificering fra din Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Femte, selv om der ikke er noget klart offentliggjorte beviser thpå æg er lysfølsomme 15, anekdotiske observationer tyder på, at æg fra et SD-fotoperiode behandling udviser lidt reduceret diapause forekomst når de udsættes for en LD fotoperiode senest 10 dage efter æglægning. Således gemme både SD og LD æg under SD betingelser for at producere en maksimal diapause respons i SD æg og undgå confounding effekt af lysperiode (SD vs. LD) under æg opbevaring.

Høj RNA kvalitet er afgørende for generering af høj kvalitet RNA-Seq data. Rigelige pleje bør tages i løbet af RNA-ekstraktion for at undgå nuklease forurening. Lav kvalitet RNA-prøver, såsom det vist i figur 1B, er ikke egnede til sekventering. Vurdering af RNA kvalitet, før du sender prøverne til sekventering er bydende nødvendigt. Karakteristiske bånd af RNA-molekyler kan være synlig for forskellige typer af insekter væv, der anvendes til RNA-ekstraktion, såsom fire bånd mindre end 18S vist i den høje kvalitet RNA elektroferogrami figur 1A. Konsekvent mønstre af andre end de to bands på 18S tværs prøver under forskellige biologiske behandlinger RNA bands kan stærkt indikerer, at disse bånd ikke skyldes nedbrydning, men repræsenterer den biologiske sammensætning af RNA-molekyler i de specifikke vævstyper valgt i den eksperimentelle design.

Den bioinformatik workflow skitseret her tillader en bruger med nogle kommandolinjen og scripting færdigheder til at få en liste over differentielt udtrykte gener fra Illumina sekventering data genereret fra replikerede RNA biblioteker fra to kontrasterende forsøgsbetingelser. Mens dette eksempel vedrører gener udtrykkes differentielt grund fotoperiode, kan denne arbejdsgang anvendes på enhver eksperimentel design med to eller flere behandlinger, i enhver organisme. Der er mange andre måder at nå frem til en liste over differentielt udtrykte gener; men denne protokol er sandsynligvis den mest ligefremme tilgang til den uerfarne bruger. Mere exoplevet bioinformatikere måske ønsker at tage ekstra foranstaltninger for at forbedre grænsefællesskab og redundans i deres samling. Biologer med lidt at ingen bioinformatik erfaring kan også udfylde mindst en del af denne rørledning i iPlant 40 Discovery Miljø, som er et gratis grafisk-brugergrænseflade drevet analyse miljø. Det er sandsynligt, at iPlant funktionalitet vil vokse sig større i fremtiden for at imødekomme fuld RNA-Seq rørledninger fra de novo transkriptom forsamlinger. Endelig skal det bemærkes, at den fremragende brugervejledning grundigt diskuterer mange måder at bruge kantskærer 41 (tabel 1) for differentiel ekspression analyse.

I nogle tilfælde kan mis-forsamlinger generere kimære contigs. Der er flere metoder, der kan hjælpe til at identificere disse mis-forsamlinger, f.eks Uchime 42. Men fra tidligere erfaringer, at antallet af fundne kimærer er overordentlig lav (<0,1%); derfor employinga kimære afsløring program kan ikke være værd at den ekstra indsats.

Behandling high-throughput, næste generation sekventering data kræver evnen til 1) opbevare store mængder data (for et enkelt projekt,> 500 Gb); 2) manipulere store datafiler, der ikke kan åbnes i traditionelle tekstbehandlingsprogrammer eller regneark programmer; 3) udføre analyser, der kræver store mængder RAM, fx for de novo samling; og 4) at analysere store datamængder, enten gennem programmer drevet af en kommando-line interface (som kræver mulighed for at installere disse programmer, som ofte er ikke-triviel), eller gennem analyse suiter med grafiske brugergrænseflader (f.eks Galaxy 43 eller iPlant 40 ). Forskere med nogle færdigheder i Unix kommandolinje og et scriptsprog får mest gavn af adgang til en lokal computing cluster - enten University ejet via en samarbejdspartner eller erhvervet til eget laboratorium. For eksempel above arbejdsgang blev opnået under anvendelse af et laboratorium ejet Macintosh (12 kerner, 64 GB RAM, 1 TB harddisk), og et universitet ejet computer cluster for Trinity samling. Hvis lignende ressourcer ikke er tilgængelige, kan forskerne stadig henvende sig til iPlant at udføre store analyser uden omkostninger, og med relativt lavere investeringer i uddannelse på grund af den grafiske brugerflade miljø. Men dem, der udfører og fortolke analyserne stadig nødt til at forstå forudsætningerne for hvert program, der bruges.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

Genetik , fotoperiodisk diapause RNA-Seq myg dyrehold
En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter