Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. opkweek van larven van Two A. albopictus Groepen naar volwassenheid

  1. Stel twee fotoperiode kasten met programmeerbare verlichting bij 21 ° C voor optimale expressie diapause 16 en circa 80% relatieve vochtigheid.
    1. Programma een kast voor een 16L: 8D licht: donker cyclus (een niet-diapause inducerende LD fotoperiode). Stel de tweede kast voor een 8L: 16D licht: donker cyclus (diapause inducerende) 13.
    2. 'Lichten aan' programma op hetzelfde moment in beide kasten te circadiane tijd tussen fotoperiodiciteit synchroniseren.
  2. Bereken de hoeveelheid eieren die nodig zijn om het experiment uit te voeren. Streven naar 300-500 eieren per kooi. Ten minste drie repliceren diapause kooien en drie repliceren niet diapause kooien zijn nodig voor RNA genereren. Deze totalen op 1,800-3,000 eieren per experiment ca..
    1. Luik van de eieren door onderdompeling ei papers in ca. 500 ml gedemineraliseerd H 2 O.
    2. Voeg <em> ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en pekelgarnalen zoals eerder beschreven 24. Bedek container met gaas, en houden het gaas op zijn plaats met een rubberen band.
    3. Plaatsen in de LD fotoperiode kast voor ca. 24 uur.
  3. Overdracht uitgekomen larven 10 x 10 x 2 cm petrischalen gevuld met ongeveer 90 ml gedeïoniseerd H2O
    1. Onderhouden ca. 30 larven per gerecht. Transfer larven te reinigen gerechten elke 48-72 uur, bijvoorbeeld elke maandag, woensdag en vrijdag (MWF) 24.
    2. Feed ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en artemia in gedeïoniseerd water om de MWF zoals eerder beschreven 24.
  4. Opgezet 3-4 volwassen kooien voor elk fotoperiode behandeling, waarbij elke kooi bestaat uit een biologische repliceren.
    1. Van weerszijden van 9,5 L emmers, uitgesneden een 10-by-14 cm gat, en een ander gat met een diameter van 15 cm. CoVer de eerste met gaas. Knip ongeveer een voetlengte van orthopedische kous en plak ene uiteinde rond de binnenkant van de andere opening.
    2. Snijd het voeteneinde van de kous af en knoop shut - geopend wanneer toegang tot het inwendige van de kooi nodig. Voor de kooi deksel, knip alle van het interieur, waardoor alleen de velg, en vervang het interieur plastic met gaas 24.
    3. Let op de fotoperiode, repliceren nummer, kooi startdatum, en andere informatie om het experiment met een permanent marker op de zijkant van de kooi relevant.
  5. Lijn de onderkant van de volwassen kooien met natte filtreerpapier. Bevochtig het filter papier met genoeg gedeïoniseerd H 2 O aan lokale luchtvochtigheid te verhogen in de kooi, maar vermijd stilstaand water, die ovipositie kan stimuleren op het filterpapier 24. Controleer het filterpapier dagelijks drogen, opnieuw nat indien nodig.
  6. Om voldoende eieren te produceren voor een RNA-bibliotheek, ten minste 100 wijfjes / 9.5 L cage, met niet meer dan 500 muggen per kooi.
  7. Verzamel poppen MWF en plaats in een klein kopje schone H 2 O in een dichtheid van niet meer dan 50 poppen per 25 ml H 2 O. Breng de poppen beker aan een volwassene kooi. Plaats kooien in de respectieve fotoperiode kabinet - A. albopictus poppen zijn lichtgevoelige 15.
  8. Dagelijkse zorgen dat H 2 O in de cups is schoon en helder, en het verwijderen van dode poppen, omdat ophoping van dode poppen massale sterfte kan veroorzaken. Verwijder H 2 O kopjes na alle poppen te voorschijn komen.
  9. Plaats biologische rozijnen op de top gaas van de kooi aan suiker voor voortgekomen volwassenen. Monitor rozijnen, en elke 3-5 dagen te veranderen hen om schimmel stapeling te voorkomen.

2. Onderhoud van volwassenen aan het Koppelen en eieren toestaan

  1. Handhaaf kooien bij hoge luchtvochtigheid (ong. 80%) door langs de kooi bodem met een vochtig filtreerpapier, en toegang tot niet- beschimmelde rozijnen, zoals hierboven beschreven (sections 1.5 en 1.9).

3. Bloed van borstvoeding

  1. Bereid bloed toevoer vrouwen tussen 2-6 dagen na verpopping opdat vrouwen zijn blootgesteld aan ten minste acht ondubbelzinnige korte dagen vóór het leggen van eitjes begint bijna 100% diapause eieren 14.
  2. Bereid de Hemotek Membrane Feeding systeem. Steek het voeden van eenheden in de voeding. Regel de temperatuur van elke eenheid tot 37 ° C met stelschroef. Gebruik een elektronische thermometer en sonde naar de temperatuur van de toevoereenheid tijdens de kalibratie te meten.
  3. Bereid de maaltijd reservoir. Strek een vierkant van collageen voeden membraan over de opening van de maaltijd reservoir en zet hem vast met een O-ring. Trek de hoeken om rimpels te verwijderen zorgvuldig; trim de overtollige membraan met een schaar.
    OPMERKING: kan Collageen membraan niet goed werken voor alle soorten muggen, en het kan nodig zijn om verschillende soorten trachten de optimale membraan vinden als het werken met eenanders dan A. species albopictus. Parafilm werkt goed met Culex pipiens.
    1. Indien bloed wordt opgeslagen bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
    2. Houd het reservoir, zodat het membraan naar beneden is gericht, worden niet ondersteund, en de vulopeningen naar boven. Gebruik een pipet of een spuit aan het reservoir te vullen met ongeveer 3 ml volbloed uit kippen die natriumcitraat heeft als een anti-stollingsmiddel. Verzegelen vulopeningen met plastic pluggen.
  4. Bevestig het bereid reservoir naar de feeder door te schroeven op de nok van de warmteoverdracht plaat op de bodem van de feeder. Keer de feeder en plaats het op de top van de kooi, membraan naar beneden, zodat de muggen kunnen voeden door het gaas van de kooi. Houd de feeder op de kooi ongeveer 45 min voedering maximaliseren.

4. Stimuleer Ovipositie

  1. Vier tot vijf dagen na het bloedmeel, uitrusten elke kooi met een donker gekleurde 50 ml cbekleed met ongebleekt zaadontkieming papier (ei papier) of structuur niet gebleekt papier handdoek en vul de helft met gedemineraliseerd water 9. Indien meer dan 250 muggen in een kooi, gebruikt twee kopjes.
    OPMERKING: Voor kleine kooien of single-vrouw flacons, kan "hooi infuus" in ovipositie containers ovipositie toenemen als gevolg van de geur van de microbiële flora 25.

5. Verzamel en Store Eieren

  1. Aanvangen eierverzameling binnen 4-5 dagen bloed geeft, omdat de productie van eieren piekt meestal ongeveer vijf dagen na het bloed voeden, en dan zakt de komende week.
  2. Variëren eierverzameling frequentie op behoeften van het experiment. Voor algemene doeleinden, verzamelen ei papers over een MWF schema. Verwijder ei papers uit elke kooi en te vervangen door nieuw papier. Plaats onlangs verwijderd papieren in petrischaaltjes en op te slaan in SD fotoperiode kabinet om verstorende effecten van ei opslag te vermijden.
  3. Laat ei papieren om opnieuw belangrijkste nat voor 2 dagen na het leggen van eitjes te serosale cuticula vorming, die ei verdroging weerstand 26 verhoogt mogelijk te maken.
  4. Ongeveer 48 uur na inzameling, droge eieren in de open lucht. Droog het papier zodanig dat het slap en licht vochtig aanvoelt, maar niet zo nat dat het papier is donker van H 2 O of stimuleert het uitbroeden van de eieren.
    OPMERKING: een 6.5 "x 4" papier kan ongeveer 3,5 uur duren om te drogen. Wees voorzichtig niet te over-droog ei papers, omdat dit zal resulteren in ei verdroging 27.
  5. Extra reserve eieren van zowel LD en SD fotoperiodiciteit om diapause incidentie te beoordelen en de fotoperiodische effect (zie Meten diapause, hoofdstuk 6).
  6. Voor de lange termijn opslag, houden ei papieren bij 21 ° C en ongeveer 80% vochtigheid in petrischaaltjes. Houd petrischalen in een Tupperware opslaghouder met een fles water plaatselijke vochtigheidsgraad te handhaven embryonale ontwikkeling vindt 4-5 dagen bij 21 ° C.
ove_title "> 6. Meet diapause Incidentie

  1. Gebruik extra gereserveerd embryo's (zie Stimuleer Ovipositie, hoofdstuk 4) die 7-20 dagen oud aan het diapause reactie te kwantificeren zijn.
  2. Noteer het aantal eieren aanwezig op elk ei papier.
  3. Stimuleer eieren uit te broeden door het volledig onder te dompelen individuele ei papieren in een 90 ml petrischaal met ongeveer 80 ml ​​gedeïoniseerd H 2 O. Voeg ongeveer 0,25 ml voedsel drijfmest.
  4. Na 24 uur tally het aantal larven gearceerde eerste instar. Plaats de petrischaal op een zwarte ondergrond larven visualiseren en plaats een lichtbron aan één zijde van de schaal. Larven af ​​te stappen van de lichtbron, waardoor een duidelijke aantekening van individuele larven. Verwijder individuele larven met een pipet, terwijl het tellen te voorkomen vertellen individuele larven.
  5. Plaats ei papieren in een nieuwe petrischaal en opnieuw droog. Re-hatch eieren na ~ 1 week en opnieuw tally eieren uitgebroed met behulp van de bovenstaande methode.
  6. Plaats ei papieren met de resterende u n-uitgebroede eieren in nieuwe 90 ml Petrischalen met ongeveer 80 ml ​​bleeksop 28. Zorg ervoor dat het ei papieren volledig worden ondergedompeld in het bleken oplossing en laat onder een zuurkast 's nachts om de geur van bleekwater te voorkomen.
    Opmerking bleken oplossing kan worden bewaard ~ 1 week bij 4 ° C, maar moet verder worden vers gemaakt.
  7. Inspecteer de eieren met behulp van een lichtmicroscoop als het bleken zal het chorion wissen en visualisatie van bevruchte, niet-uitgekomen eieren. Wanneer het bevruchte ei wordt het ei een gebroken witte kleur met ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde. Tally het aantal niet-uitgekomen, bebroede eieren 13.
  8. Bepaal diapause incidentie met de volgende formule:% diapause = geen. bebroede un-uitgebroede eieren / (no. uitgebroede eieren + no. bebroede un-uitgebroede eieren) x 100 13.

7. RNA-extractie uit Eieren / pharate Larven

NHOUD "> LET OP: Gebruik Trizol in een laminaire stroming kap.

  1. Borstel mug eieren met de ontwikkeling van embryo's of pharate larven op verschillende tijdstippen ontwikkeling van ei papieren om glas slijpmachines met behulp van een kameel-borstel. Maal de eieren in Trizol (1 ml per 50-100 mg weefsel) tot het volledig verpulverd. Gebruik minimaal 400 eieren per bibliotheek voldoende RNA verkregen.
    1. Alternatief snap bevriezen eieren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C in microcentrifuge buisjes tot een maand voor malen in Trizol.
  2. Voer RNA extractie Trizol gevolgd door isopropanol precipitatie volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Behandel de bank met RNase decontaminatie-oplossing of andere middelen om eventuele resten nucleases verwijderen om RNA degradatie te voorkomen.
    1. Behandel de geëxtraheerde RNA met DNase. Volgens de instructies van de fabrikant, incubeer de RNA monsters met DNase gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gebruik 1 & #181, l DNase tot 10 ug RNA in 50 pl reactie. Verhoog de hoeveelheid DNase als er meer dan 10 ug RNA in één reactie.
    2. DNase inactiveren door toevoeging van 5 pi gesuspendeerd DNase inactivatie reagens. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur mengen driemaal in incubatieperiode (zacht vortexen).
    3. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1,5 min. Breng het supernatant dat het behandelde RNA monsters verse buizen voor daaropvolgende stappen.
  4. Beoordeel de kwaliteit van de totale RNA monsters door fluorometrie. Stuur de monsters naar een specialiteit faciliteit met de juiste instrument voor deze taak. De faciliteit zal on-chip gelelektroforese uit te voeren om de grootte van de RNA-soorten in het monster, gevisualiseerd door fluorescerende kleurstof ingeprent in de chip te bepalen. De resultaten zullen worden geretourneerd als een elektroferogram.
    1. Bepaal de integriteit van totaal RNA monsters door de aanwezigheid of afwezigheid van afbraakproducten, zoals blijkt uit de aanwezigheid of pieken tussen het 18S en 5S ribosomale RNA pieken op het verkregen elektroferogram (Figuur 1B).

8. RNA Sequencing

  1. Stuur totaal RNA monsters met een voldoende hoge kwaliteit (Figuur 1A) en hoeveelheid (meestal> 3 ug per bibliotheek) naar een commercieel sequencing centrum voor de bouw van verrijkte gepaarde-end mRNA bibliotheken en mRNA sequencing, volgende standaard protocollen.
  2. Indien meer dan één rijstrook wordt gebruikt voor het sequentiëren van een enkel experiment, opgesplitst in twee afzonderlijke bibliotheken rijstroken voor sequencing te verantwoorden technische variatie tussen lanen tijdens sequencing.

9. lllumina lezen Cleaning

OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de bioinformatica deel van dit protocol. Voor een volledige lijst van alle programma's en middelen gebruikt in de sectie bioinformatica van dit protocol, zie tabel 1. InDaarnaast Aanvullende Bestand 1 bevat command line voorbeelden voor elk van de volgende bioinformatica protocol stappen.

  1. Gebruik ssaha2 29 (tabel 1) groepjes van 95% identiteit of hoger identificeren de NCBI UniVec Core database (tabel 1), A. albopictus rRNA sequentie (GenBank # L22060.1), en sequencing adapters (gedetailleerde command-line voorbeelden in Aanvullende File 1). Verwijder gelezen paren met lucifers Perl of soortgelijk scriptingtool, bijvoorbeeld door aanpassing van het ontvangen Perl-script (Supplemental bestanden 2).
  2. Schoon resterende leest met de SolexaQA pakket 30 (tabel 1; Aanvullende Bestand 1): trimmen regio's met een phred score equivalent van minder dan 20 met de standaardinstellingen van DynamicTrim.pl.
    1. Verwijder leest korter dan 25 bp met LengthSort.pl op zowel vooruit als achteruit tegelijk leest. Evalueer de kwaliteit van de gereinigde fastq bestanden met FastQC (Tabel 1

10. Digitale Normalisatie

  1. Voer een ronde van digitale normalisatie op het gereinigde leest met behulp van de khmer gereedschap 31 (tabel 1; Aanvullende File 1), in het bijzonder normalize-by-median.py (met behulp van k-mer grootte 20, een dekking cut-off van 20, en x = 1e10).
  2. Als alternatief, als een machine met een hoge RAM beschikbaar is (honderden gigabytes), gebruik Trinity's normalize_by_kmer_coverage.pl script (tabel 1).

11. De Novo Transcriptome Vergadering

  1. Verkrijg toegang tot een computer of computer-cluster met 256 Gb RAM en CPU 24, afhankelijk van de grootte van het samenstel.
  2. Gebruik Trinity 32 (Tabel 1; Supplemental bestanden 1) aan de digitaal genormaliseerde leesverzameling in contigs monteren. Te verminderengeheugengebruik, gebruiken --min_kmer_cov 2.

12. Vergadering Evaluatie

  1. Ren assemblathon_stats.pl uit de Assemblathon2 project 33 op de Drie-eenheid aaneengesloten uitgang. Dit script voert eenvoudige berekeningen te evalueren assemblage kwaliteit relevant, zoals het aantal steigers, N50, assemblage samenstelling, en meer (tabel 1; Aanvullende File 1).

13. Annotatie van de Gemonteerd Transcriptome

  1. Voeren BLASTX (tabel 1) van het geheel tegen een referentie-eiwit vast te stellen; voor muggen, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens en Aedes aegypti zijn geschikt gevonden. Specifiek, formatteer het referentie-eiwit fasta bestand voor ontploffing, gevolgd door blastx (Aanvullende File 1).

14. Kaart Leest aan de Vergadering Met behulp RSEM 34 (tabel 1)

  1. Een "transcript naar gen-map" file, waarbij deeerste kolom bevat de referentie-gen-id's, en de tweede kolom de aaneengesloten ID's. In een spreadsheet editor, wisselen de eerste en de tweede kolom van de BLASTX uitgang, en schrijf deze kolommen naar een .txt bestand. Gebruik de linebreak programma om regeleinden om te zetten in het resulterende .txt bestand naar Unix formaat.
  2. Maak een verwijzing dataset van de transcriptome fasta bestand met de rsem-bereiden-referentie-script, mits in de RSEM pakket (Aanvullende File 1).
  3. Afzonderlijk Bereken de expressie waarden voor elke bibliotheek met behulp van de rsem-berekenen-expressie opdracht, op voorwaarde dat in de RSEM pakket (Aanvullende File 1). Zoals leest, gebruik dan de gepaarde fastq bestanden als gevolg van de read-reiniging stap (stap 9.2).
    1. Als RNA uit een biologisch repliceren opgesplitst in twee rijstroken voor sequencing, zowel fastq bestanden in de expressie te brengen naar een enkel bestand te genereren.
  4. Zet de expressieresultaten van elke bibliotheek een matrix gemakkelijk verwerkt door andere programs met de meegeleverde script rsem-genereren-data-matrix, die in de RSEM pakket (Aanvullende File 1).

15. differentiële expressie Analyse

  1. Installeer R en Edger (tabel 1).
  2. Gebruik read.delim de RSEM resultaten van stap 14.3 (Aanvullende File 1) laden. Indien nodig, rond de graven op het dichtstbijzijnde gehele getal.
    OPMERKING: De Edger gids beveelt het beperken van de dataset aan genen met hoog genoeg uitdrukking aan betekenis te detecteren.
  3. Om de gegevens voor edger formatteren, het genereren van een DGEList object uit de geladen databestand (Aanvullende File 1). Dan, normaliseren van de gegevens met behulp van TMM normalisatie (Aanvullende File 1). Schat de gemeenschappelijke en tagwise dispersies van de gegevens (Aanvullende File 1).
  4. Identificeren van differentieel tot expressie genen met een Benjamini-Hochberg gecorrigeerde p-waarde <0,05 (Aanvullende File 1). Plot de verdeling van log-voudige-verandering versus overvloed (Aanvullende File 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorometrie twee representatieve RNA monsters vertoonde twee banden bij ongeveer 2000 nt (Figuur 1A, B). Het insect 28S ribosomaal RNA uit twee polynucleotide ketens bijeengehouden door waterstofbindingen, die gemakkelijk worden verstoord door korte verhitting of middelen die waterstofbindingen 35 verstoren. De resulterende twee componenten ongeveer even groot als de 18S ribosomale RNA. De tweede RNA-monster toonde een hoge mate van afbraak (Figuur 1B).

Fotoperiodische behandeling van een representatieve groep A. albopictus muggen tot hoge diapause incidentie bij korte dagen gekweekt muggen en lage diapause incidentie bij lange dagen gekweekt muggen, hoewel er enige variatie tussen replicaten (tabel 2). Bijvoorbeeld repliceren SD2 toont lager (80%) diapause incidentie dan de resterende duplo (87,18% - 97,67%). Dit repliceren had ook de kleinste Sampl e grootte, dus het is aangeraden om vernietiging van een voldoende aantal eieren (> 150) voor de diapause meting om een ​​nauwkeurig resultaat te verkrijgen.

Post-sequencing lezen schoonmaak op één vertegenwoordiger bibliotheek van volwassen A. albopictus vrouwtjes verwijderde een aanzienlijk aantal leest (van 83.853.322 naar 52.736.065 totale leest voor één vertegenwoordiger bibliotheek). Digitale normalisering verder verminderde het aantal totale leest 41.435.934. Een Trinity montage van deze leest gegenereerde 76377 aaneengesloten sequenties, met een N50 van 1,879, contig gemiddelde lengte van 1,023.1, maximaal contig lengte van 20.892 (figuur 3). Differentiële expressie analyse van een soortgelijke workflow embryo fokkerij-diapause inducerende omstandigheden bij 11 en 21 dagen na het leggen van eitjes geopenbaarde 3128 differentieel geëxpresseerde genen tussen deze twee perioden (Figuur 4).

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>

Figuur 1: fluorometrie profielen van bijvoorbeeld hoogwaardige (A) en lage kwaliteit (B) RNA extracties uit A. albopictus. De x-as geeft de grootte van de nucleotide fragmenten, en de y-as de fluorescentie metingen. Merk het verschil op de y-as schaal tussen panelen (A) en (B). Pijlen markeren de posities van de verschillende ribosomale RNA's. De schijnbare banden dicht bij de groene markering band geven degradatie.

Figuur 2

Figuur 2: Overzicht van de bioinformatica workflow uit te lezen voorbereiding tot uitdrukking differentiële Elke doos is een stap in de sectie bioinformatica van dit protocol, vergezeld van het overeenkomstige aantal elk protocol stap..


Figuur 3:. Histogram van aaneengesloten lengte van een drie-eenheid de novo transcriptome montage De gemiddelde aaneengesloten lengte is 1,023.1. Merk op dat de verdeling van contig lengten sterk scheef naar kortere aaneengesloten sequenties; Dit is typisch voor de novo transcriptoom montage.

Figuur 4
Figuur 4: Log 2-voudige-verandering versus overvloed van TMM-genormaliseerde genexpressie van diapause pharate larven in 11 dagen versus 21 dagen na de ovipositie Elk punt wijst een Unigene;. verschillend tot expressie unigenes zijn in het rood. Unigenes met hogere expressie in 11 dagen na het leggen van eitjes hebben positieve fold-change waarden, waarals unigenes met hogere expressie 21 dagen na het leggen van eitjes hebben negatieve fold-waarden wijzigen.

Programma / Resource Website URL (toegankelijk 2014/01/13)
perl http://www.perl.org/get.html
python http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Core ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Drievuldigheid http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Drievuldigheidnormalisering script http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 evaluatie scripts https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (die makeblastdb en BLASTX omvat) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
linebreak https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Gids Edger gebruikershandleiding http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabel 1: Programma's en middelen gebruikt voor thij bioinformatica procedures in dit protocol. URL's worden weergegeven elk van de middelen die nodig zijn in dit protocol gemakkelijk toegang.

Behandeling Kopiëren Aantal eieren van 1 ste luik Aantal eieren van 2 e luik Nee bevruchte, unhatched eieren % Diapause
SD 1 10 0 68 87,18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97.67
SD 4 5 0 46 90.20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9.78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

Tabel 2:. Diapause incidentie berekeningen Resultaten van vijf herhalingen per fotoperiode van diapause incidentie berekeningen. Aantallen uitgekomen larven uit twee afzonderlijke arceringen zijn opgenomen, evenals het aantal niet-uitgebroede, geëmbryoneerde eieren, die nodig diapause incidentie te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol biedt methoden om differentieel tot expressie genen wijten ontdekken geïnduceerde diapause in A. photoperiodically albopictus. Het protocol is van belang omdat het een unieke combinatie van mosquito opfok en bio-informatica technieken om alle experimentele aspecten van een moleculaire fysiologie programma toegankelijk is voor beginnende gebruikers te maken - in het bijzonder voor degenen die zich richt op de fotoperiodische diapause respons. Bestaande methoden, voor zover wij weten, niet zo gedetailleerd in de opfok protocol - dat is vaak nodig om opfok fouten te identificeren - noch hebben ze inzicht bieden in experimenteel ontwerp tijdens de opfok stadium dat succesvolle bioinformatic analyse stroomafwaarts in staat zal stellen. De hier gepresenteerde methoden zijn geoptimaliseerd voor A. albopictus, vooral de kweekmethoden, die over het algemeen nemen de zes weken van de ene laboratorium generatie naar de volgende. In toekomstige toepassingen deze methode kan worden aangepast met bescheidenaanpassingen aan andere muggensoorten die fotoperiodische diapause 23 vertonen. Bovendien is de algemene proefopzet en bioinformatica workflow gelden voor de studie van andere polyphenisms.

Een aantal punten niet gedetailleerd in het protocol moeten worden overwogen bij het ​​grootbrengen A. albopictus larven. Ten eerste, A. albopictus kan worden gevonden in een grote verscheidenheid van natuurlijke en kunstmatige container habitats zoals in eerdere documenten 36, 37. Gebruikte banden percelen een gemeenschappelijke bron van larven voor de vaststelling laboratorium kolonies. Populaties boven 32N breedte in Noord Amerika verzamelde verwachting een sterke diapause reactie 13 vertonen. De A. albopictus stam gebruikt in dit protocol werd verzameld uit Manassas, VA, en werd opgevoed in een laboratorium omgeving voor meer dan acht generaties voorafgaand aan de experimentele manipulatie. Ten tweede moet de verlichting in de fotoperiode kasten worden met zorg gekozen. Bollen in kastenmet ingebouwde verlichting functies kan de temperatuur pieken in de kast veroorzaken wanneer de verlichting wordt in- of uitgeschakeld. Anekdotische observatie suggereert dat deze temperatuur spikes kan de diapause respons verstoren. Om dit te voorkomen, ingebouwde verlichting functies moet worden uitgeschakeld en kasten moeten worden uitgerust met een 4-watt cool-TL-lamp. Ten derde, larven gevoelig voor H2O voedselkwaliteit en overvloed. Daarom kan overvoeren leiden tot bacteriële accumulatie en larvale mortaliteit. Ten vierde, zijn er alternatieve methoden voor vrouwelijke muggen bloed-toevoer volwassene. Glazen membranen zijn een alternatief kunstmatig membraansysteem 38, 39, hoewel de HemoTek uitvoert beter de auteurs ervaringen. Levende dieren (meestal kip of knaagdieren) kan ook 38 worden gebruikt - in dit geval, is het essentieel om eerst de juiste certificering te verkrijgen van uw Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Ten vijfde, hoewel er geen duidelijke gepubliceerd bewijs thop eieren zijn lichtgevoelige 15, anekdotische waarnemingen suggereren dat de eieren van een SD fotoperiode behandeling vertonen iets verlaagd diapause incidentie bij blootstelling aan een LD fotoperiode binnen 10 dagen na het leggen van eitjes. Zo slaan zowel SD en LD eieren onder SD voorwaarden om een ​​maximale diapause reactie in de SD-eieren te produceren en te voorkomen dat eventuele verstorende effect van fotoperiode (SD vs. LD) tijdens de eieren opslag.

Hoge RNA kwaliteit is essentieel voor het genereren van RNA-Seq data van hoge kwaliteit. Overvloedige zorg moeten worden genomen tijdens de RNA-extractie om eventuele nuclease besmetting te voorkomen. Lage kwaliteit RNA monsters, zoals getoond in figuur 1B, zijn niet geschikt voor sequentiebepaling. Het beoordelen van de RNA-kwaliteit voordat de monsters voor sequencing is noodzakelijk. Kenmerkend banden van RNA-moleculen kunnen toegankelijk voor verschillende soorten insecten weefsels voor RNA-extractie, zoals de vier banden kleiner dan 18S in het hoge kwaliteit RNA elektroferogram wordenfiguur 1A. Consistente patronen van andere dan de twee bands op 18S overkant van monsters uit hoofde van verschillende biologische behandelingen RNA bands kan zijn sterke aanwijzingen dat deze bands niet het gevolg zijn van degradatie, maar vertegenwoordigen de biologische samenstelling van de RNA-moleculen in de specifieke soorten weefsel in de experimentele opzet gekozen.

De bioinformatica workflow hier geschetste kan een gebruiker met een aantal command-line en scripting vaardigheden om een ​​lijst van differentieel tot expressie genen van Illumina sequencing data gegenereerd uit gerepliceerd RNA bibliotheken te verkrijgen van twee contrasterende experimentele omstandigheden. Hoewel dit voorbeeld gaat genen differentieel tot expressie afhankelijk fotoperiode, kan deze werkstroom worden toegepast op elk experimenteel ontwerp met twee of meer behandelingen, in elk organisme. Er zijn vele andere manieren om tot een lijst van differentieel tot expressie gebrachte genen; Echter, dit protocol is waarschijnlijk de meest eenvoudige aanpak voor de beginnende gebruiker. Meer experienced bio-informatici Misschien wilt u extra maatregelen om de contiguïteit en redundantie van hun vergadering te verbeteren. Biologen met weinig tot geen bioinformatica ervaring vast ook volledig ten minste een deel van deze leiding in het iPlant 40 Discovery milieu, die een vrij-grafische gebruikersinterface driven analyseomgeving. Het is waarschijnlijk dat de functionaliteit iPlant de grotere in de toekomst zal groeien om de volledige RNA-Seq pijpleidingen vanuit de novo transcriptome assemblages tegemoet te komen. Merk tenslotte op dat leidraad voor de uitstekende gebruikershandleiding bespreekt de vele manieren om Edger 41 (tabel 1) te gebruiken voor differentiële expressie analyse grondig.

In sommige gevallen kan mis-assemblages chimeer contigs genereren. Er zijn verschillende methoden die kunnen helpen om deze mis-assemblages te identificeren, bijvoorbeeld Uchime 42. Echter, ervaringen uit het verleden, het aantal gedetecteerde hersenschimmen is zeer laag (<0,1%); Daarom employinga hersenschim detectie programma misschien niet de extra inspanning waard.

Verwerking van high-throughput, next-generation sequencing data vereist het vermogen om 1) op te slaan grote hoeveelheden data (voor een enkel project,> 500 Gb); 2) te manipuleren grote gegevensbestanden die niet in traditionele tekstverwerkers of spreadsheetprogramma's kan worden geopend; 3) analyses die grote hoeveelheden RAM, bijvoorbeeld voor de novo assemblage nodig voeren; en 4) het analyseren van grote datasets, hetzij door middel van programma's aangedreven door een command-line interface (die de mogelijkheid om deze programma's te installeren, die vaak niet-triviale), of door middel van analyse suites met een grafische user interfaces (vereist bijvoorbeeld Galaxy 43 of iPlant 40 ). Onderzoekers met enkele vaardigheid in Unix command line en een scripttaal zal het meeste voordeel halen uit de toegang tot een lokale computer cluster - ofwel University-eigendom, via een medewerker, of eerst voor hun eigen laboratorium. Bijvoorbeeld, de above workflow werd uitgevoerd met behulp van een in het laboratorium eigendom Macintosh (12 cores, 64 GB RAM-geheugen, 1 TB harde schijf), en een universiteit in handen computer cluster voor de Drie-eenheid montage. Als soortgelijke middelen niet beschikbaar zijn, kunnen onderzoekers nog steeds te schakelen om iPlant uit te voeren op grote schaal analyseert zonder kosten, en met relatief lagere investeringen in opleiding te wijten aan de grafische interface milieu. Echter, die het uitvoeren en interpreteren van de analyses nog steeds nodig om de aannames van elk programma gebruikt te begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

Genetica , fotoperiodische diapause RNA-Seq mug veeteelt
Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug,<em&gt; Aedes albopictus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter