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Biology

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. Larvenaufzucht von zwei A. albopictus Gruppen zum Erwachsenwerden

  1. Stellen Sie zwei Photoperiode Schränke mit programmierbaren Beleuchtung bei 21 ° C für eine optimale Diapause Ausdruck 16 und ca. 80% relativer Luftfeuchtigkeit.
    1. Programmieren Sie einen Schrank für einen 16L: 8D-Licht: Dunkel-Zyklus (ein nicht-Diapause induziert LD Photoperiode). Stellen Sie das zweite Gehäuse für eine 8L: 16D Licht: Dunkel-Zyklus (Diapause induziert) 13.
    2. "Licht an" Programm zur gleichen Zeit in beiden Schränke auf circadiane Zeit zwischen Photoperioden zu synchronisieren.
  2. Berechnen Sie die Menge der Eier erforderlich sind, um das Experiment durchzuführen. Ziel für 300 bis 500 Eier pro Käfig. Mindestens drei replizieren Diapause Käfige und drei replizieren nicht Diapause Käfige für die RNA-Generation benötigt. Dieser beläuft sich auf 1,800-3,000 Eier pro Experiment ca..
    1. Hatch die Eier durch Eintauchen Ei Papiere in ca. 500 ml VE H 2 O
    2. Hinzufügen <em> ca. wie zuvor 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Grundfutter und Artemia beschrieben 24. Decken Sie Behälter mit Mesh, und halten Sie die Masche an Ort und Stelle mit einem Gummiband.
    3. Platzieren Sie in der Photoperiode LD Schrank für ca. 24 Std.
  3. Übertragungs geschlüpften Larven zu 10 x 10 x 2 cm Petrischalen mit ca. 90 ml gefüllt entionisiertem H 2 O.
    1. Halten Sie ca. 30 Larven pro Schale. Übertragen Larven zu reinigen Gerichte jeden 48-72 Stunden, zum Beispiel jeden Montag, Mittwoch und Freitag (MWF) 24.
    2. Feed ca. 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Boden Hundefutter und Artemia in VE-Wasser jeden MWF wie zuvor beschrieben 24.
  4. Bis drei Minuten vor vier Erwachsenen Käfige diese Einstellung für jedes Photoperiode Behandlung, wobei jeder Käfig einen biologischen Replikation.
    1. Von gegenüberliegenden Seiten des 9,5 l Eimer, schneiden Sie ein 10-für-14 cm Loch, und ein weiteres Loch mit 15 cm Durchmesser. Cover das erste mit Mesh. Geschnitten etwa eine Fußlänge eines orthopädischen Strumpf und kleben einem Ende um die Innenseite der anderen Bohrung.
    2. Schneiden Sie das Fußende der Strumpf aus und Knoten geschlossen - offen nur bei Zugriff auf das Innere des Käfigs erforderlich. Für den Käfig Deckel, schneiden Sie den gesamten Innenraum, so dass nur die Felge, und ersetzen Sie den Innenraum Kunststoff mit Mesh-24.
    3. Achten Sie auf die Photoperiode, replizieren Zahl, Käfig Startdatum und andere Informationen, die für das Experiment mit wasserfesten Stift auf der Seite des Käfigs.
  5. Den Boden der Erwachsenen Käfige mit feuchtem Filterpapier. Befeuchten des Filterpapiers mit ausreichend entionisiertem H 2 O, lokale Luftfeuchtigkeit im Käfigs zu erhöhen, aber vermeiden stehendes Wasser, das Eiablage auf dem Filterpapier 24 stimulieren kann. Überprüfen Sie das Filterpapier täglich zum Trocknen, wieder nass, wenn notwendig.
  6. Um eine ausreichende Eier für eine RNA-Bibliothek zu erstellen, mindestens 100 Frauen / 9,5 L cage, mit nicht mehr als 500 Mücken pro Käfig.
  7. Sammeln Puppen MWF und in eine kleine Tasse sauber H 2 O bei einer Dichte von nicht mehr als 50 Puppen pro 25 ml H 2 O Übertragen Sie die Puppen cup einem Erwachsenen Käfig. Platz Käfige in der jeweiligen Photoperiode Schrank - A. albopictus Puppen sind lichtempfindlich 15.
  8. Stellen Sie sicher, dass täglich H 2 O in Tassen ist sauber und klar, und entfernen abgestorbene Puppen, weil Aufbau von toten Puppen können Massensterben verursachen. Entfernen H 2 O Tassen, nachdem alle Puppen entstehen.
  9. Platzieren organische Rosinen auf dem oberen Gitter des Käfigs Zucker zur taucht Erwachsenen bereitzustellen. Überwachen Sie Rosinen, und ändern Sie sie alle 3-5 Tage, um Schimmel Ansammlung zu verhindern.

2. Wartung der Erwachsene zu Paarung und Eierproduktion zulassen

  1. Pflegen Käfigen bei hoher Feuchtigkeit (ca. 80%) durch Auskleiden der Käfigunterteil mit einem feuchten Filterpapier, und den Zugriff auf Nicht-schimmelig Rosinen, wie oben beschrieben (Abschnitons 1.5 und 1.9).

3. Blut-Fütterung

  1. Bereiten Sie sich darauf Blutzufuhr Weibchen zwischen zwei bis sechs Tage nach dem Schlüpfen, um sicherzustellen, dass Frauen haben mindestens acht eindeutige kurze Tage ausgesetzt worden, bevor der Eiablage beginnt für nahezu 100% Diapause Eier 14.
  2. Bereiten Sie die Hemotek Membran Zuführsystem. Stecken Sie die Zuführungseinheiten in die Stromversorgung. Die Temperatur einer jeden Einheit auf 37 ° C mit der Stellschraube. Mit einem elektronischen Thermometer und Sonde, um die Temperatur der Zuführungseinheit während der Kalibrierung zu messen.
  3. Bereiten Sie die Mahlzeit Reservoir. Dehnen Sie ein Quadrat von Kollagen Fütterung Membran über der Öffnung der Mahlzeit Behälter und sichern Sie sie mit einem O-Ring. Die Ecken, um Falten zu entfernen Ziehen; schneiden Sie die überschüssige Membran mit einer Schere.
    HINWEIS: Collagen Membran kann nicht gut für alle Mückenarten zu arbeiten, und es kann notwendig sein, verschiedene Arten versucht, die optimale Membran zu finden, wenn die Arbeit mit einemaußer A. Arten albopictus. Parafilm funktioniert gut mit Culex pipiens.
    1. Wenn Blut wird bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung gefroren gelagert, Tauwetter.
    2. Halten Sie den Behälter, so dass die Membran nach unten zeigt, werden nicht unterstützt, und die Einfüllöffnungen nach oben zeigt. Verwenden einer Transferpipette oder Spritze, um das Reservoir mit etwa 3 ml Vollblut von Hühnern, Natriumcitrat als Antikoagulans einfüllen. Siegel Einfüllöffnungen mit Kunststoffstopfen.
  4. Befestigen Sie das vorbereitet Reservoir zur Zuführung durch Aufschrauben auf das Gestüt auf der Wärmeübertragungsplatte auf der Unterseite des Förderers. Kehren Sie die Zuführung und setzen Sie ihn auf dem Käfig, Membranseite nach unten, so dass Mücken können durch die Maschen des Käfigs zu ernähren. Halten Sie die Zuführung auf den Käfig ca. 45 min zu Fütterung zu maximieren.

4. Anregung Eiablage

  1. Vier bis fünf Tage nach der Blutmahlzeit, rüsten jeden Käfig mit einem dunkel gefärbten 50 ml cmit rohen Samenkeimung Papier (Ei Papier) oder strukturierte nicht-gebleichten Papiertuch ausgekleidet und füllen auf halbem Weg mit VE-Wasser 9. Wenn mehr als 250 Mücken sind in einem Käfig, verwenden Sie zwei Tassen.
    HINWEIS: Bei kleinen Käfigen oder Einzel weibliche Fläschchen kann "Heu-Infusion" in Eiablagebehälter Eiablage durch den Geruch der mikrobiellen Flora 25 zu erhöhen.

5. sammeln und speichern Eggs

  1. Beginnen Eiersammlung innerhalb von 4-5 Tagen von blutsaugenden, weil die Eierproduktion Spitzen typischerweise etwa fünf Tage nach Blut Fütterung und dann nachlässt in der nächsten Woche.
  2. Vary Eiersammlung Frequenz auf Notwendigkeiten des Experiments. Für allgemeine Zwecke, sammeln Eier Papiere auf einer MWF Zeitplan. Entfernen Ei Papiere aus jedem Käfig und ersetzen mit frischem Papier. Zeigen kürzlich entfernt Papiere in Petrischalen und lagern in SD Photoperiode Schrank auf verwirrende Auswirkungen ei der Lagerung zu vermeiden.
  3. Lassen Sie Eier Papieren neu Haupt nass für 2 Tage nach der Eiablage an serösen Nagelhautbildung, die Ei Austrocknung Widerstand 26 erhöht ermöglichen.
  4. Etwa 48 Stunden nach der Sammlung, trockene Eier im Freien. Trocknen Sie das Papier, so dass es schlaff und leicht feucht anfühlen, aber nicht so feucht, dass das Papier dunkel von H 2 O oder stimuliert Schlüpfen der Eier.
    HINWEIS: Ein 6.5 "x 4" Papier kann etwa 3,5 Stunden dauern, um zu trocknen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu über-trocken Ei Papiere, da dies in Ei Austrocknung 27 führen.
  5. Reserve zusätzliche Eier sowohl von LD und SD-Photoperioden zu Diapause Häufigkeit zu beurteilen und interpretieren die photoperiodische Effekt (siehe Mess Diapause, Abschnitt 6).
  6. Für langfristige Lagerung, halten Ei Papiere bei 21 ° C und ca. 80% Luftfeuchtigkeit in Petrischalen. Halten Sie Petrischalen in einer Tupperware Vorratsbehälter mit einer Flasche Wasser auf lokale Feuchtigkeit zu halten, wie der Embryonalentwicklung dauert vier bis fünf Tage bei 21 ° C.
ove_title "> 6. Messen Sie Diapause Inzidenz

  1. Verwenden Sie zusätzliche vorbehalten Embryonen (siehe Stimulieren Eiablage, Abschnitt 4), die 7 bis 20 Tage alt, um die Diapause Antwort zu quantifizieren sind.
  2. Notieren Sie sich die Anzahl der auf jedem Ei papier Eier.
  3. Stimulieren Sie Eier, die von Notlaufeigenschaften einzelnen Ei Papiere in einem 90 ml Petrischale mit ca. 80 ml ​​VE H 2 O schlüpfen In etwa 0,25 ml Lebensmittel Gülle.
  4. Nach 24 Stunden tally die Anzahl der schraffierten ersten Larvenstadium. Legen Sie die Petrischale auf eine schwarze Oberfläche zu Larven zu visualisieren und legen Sie eine Lichtquelle auf einer Seite der Schale. Die Larven werden von der Lichtquelle weg bewegen, was eine klare Bilanz von einzelnen Larven. Entfernen Sie einzelne Larven mit einer Pipette beim Zählen erzählt einzelnen Larven zu verhindern.
  5. Platz Ei Papiere in eine neue Petrischale und wieder trocken. Re-Eier brüten nach ca. 1 Woche wieder übereinstimmen Eiern geschlüpft Verwendung des vorstehenden Verfahrens.
  6. Platz Ei Papiere mit dem restlichen u n-geschlüpften Eier in neue 90 ml Petrischalen mit ca. 80 ml ​​Bleichlösung 28. Sicherzustellen, dass die Eier Papiere vollständig in der Bleichlösung eingetaucht und lassen im Abzug über Nacht, um den Geruch der Bleich vermeiden.
    HINWEIS: Bleichlösung kann für ~ 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden, sollte aber ansonsten frisch hergestellt werden.
  7. Überprüfen Sie Eier mit einem Lichtmikroskop als Bleich das Chorion zu löschen und Visualisierung von embryonierten, un-geschlüpften Eiern. Wenn das Ei embryonierten, wird das Ei eine cremefarbene, mit den Augen als zwei kleine schwarze Punkte gegenübereinander auf der Rückenseite erscheinen. Tally die Anzahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern 13.
  8. Bestimmen Diapause Einfall mit der folgenden Formel:% Diapause = keine. embryonierte un-Eier ausgebrütet / (Nr. geschlüpften Eier + Nr. embryonierte un-Eier ausgebrütet) x 100 13.

7. RNA-Extraktion aus Eier / Larven pharate

NHALT "> Hinweis: Verwenden Trizol in einer Sterilbank.

  1. Pinsel Mücke Eier enthalten entwickelnden Embryonen oder pharate Larven an bestimmten Entwicklungszeitpunkten vom Ei Papiere Glasschleifer mit einer Kamelhaarbürste. Schleifen Sie die Eier in Trizol (1 ml pro 50 bis 100 mg Gewebe), bis sie vollständig pulverisiert. Verwenden Sie mindestens 400 Eier pro Bibliothek, um eine ausreichende RNA ergeben.
    1. Alternativ Snap freeze Eier in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C in Mikrozentrifugenröhrchen für bis zu einem Monat vor dem Mahlen in Trizol gespeichert.
  2. Führen RNA-Extraktion in Trizol gefolgt von Isopropanolfällung nach Herstelleranweisungen.
  3. Behandeln Sie die Bank mit RNase Dekontaminationslösung oder andere Mittel, um alle restlichen Nukleasen zu entfernen, um RNA-Abbau zu vermeiden.
    1. Behandeln Sie die extrahierte RNA mit DNase. Nach den Anweisungen des Herstellers, Inkubation der RNA-Proben mit DNase für 30 min bei 37 ° C. Verwenden Sie 1 und #181; l DNase für bis zu 10 & mgr; g RNA in einer 50 ul Reaktion. Erhöhung der Menge an DNase, wenn es mehr als 10 & mgr; g RNA in einer Reaktion.
    2. Inaktivierung von DNase durch Zugabe von 5 ul suspendiert DNase-Inaktivierung Reagenz. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur, dreimal während der Inkubationsperiode (leichter Verwirbelung).
    3. Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1,5 min. Die überstehende, die die behandelten RNA Proben in frische Röhrchen zur anschließenden Schritten.
  4. Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA-Proben mittels Fluorometrie. Senden Sie die Proben auf eine Spezialanlage mit geeignete Instrument für diese Aufgabe. Die Anlage wird auf dem Chip-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Größe der RNA-Spezies in der Probe durch Fluoreszenzfarbstoff in der Chip instilliert visualisiert bestimmen. Die Ergebnisse werden als ein Elektropherogramm zurückgegeben.
    1. Bestimmung der Integrität der Gesamt-RNA-Proben durch das Vorhandensein oder Fehlen von Abbauprodukten, wie durch das Vorhandensein o belegenf Peaks zwischen 18S und 5S rRNA Peaks auf der resultierenden Elektropherogramm (1B).

8. RNA Sequenzierung

  1. Senden der Gesamt-RNA-Proben mit einer ausreichend hohen Qualität (1A) und Menge (in der Regel> 3 ug pro Bibliothek) an eine kommerzielle Ordnungszentrum für den Bau von angereichertem Paired-End mRNA-Bibliotheken und mRNA-Sequenzierung nach Standardprotokollen.
  2. Wenn mehr als eine Spur wird für die Sequenzierung eines einzigen Experiment verwendet wird, aufgeteilt einzelnen Bibliotheken in zwei Fahrspuren für die Sequenzierung für technische Unterschiede zwischen den Fahrspuren während der Sequenzierung zu berücksichtigen.

9. Illumina lesen Reinigung

ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Bioinformatik Teil dieses Protokolls. Für eine vollständige Liste aller Programme und Ressourcen in der Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll verwendet, auf die Tabelle 1 verwiesen. InAußerdem STADT Datei 1 enthält Befehlszeilenbeispiele für jede der folgenden Bioinformatik Protokollschritte.

  1. Verwenden ssaha2 29 (Tabelle 1), um Gruppen aus 95% Identität oder höher, um der NCBI UniVec Core-Datenbank identifiziert (Tabelle 1), A. albopictus rRNA-Sequenz (GenBank # L22060.1) und Sequenzierung Adaptern (detaillierte Befehlszeilenbeispiele in STADT Datei-1 zur Verfügung gestellt). Entfernen Lesepaare mit Streichhölzern mit Perl oder eine ähnliche Scripting-Tool, beispielsweise durch Anpassung der bereitgestellten Perl-Skript (Supplemental Datei 2).
  2. Reinigen Sie verbleibende liest mit dem SolexaQA Paket 30 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1): schneiden Regionen mit phred Punktzahl Äquivalent von weniger als 20 mit den Standardeinstellungen des DynamicTrim.pl.
    1. Entfernen Sie liest die kürzer als 25 bp mit LengthSort.pl auf Vorwärts- und Rückwärts liest gleichzeitig. Bewerten Sie die Qualität der fastq gereinigt Dateien mit FastQC (Tabelle 1

10. Digitale Normalisierung

  1. Führen Sie eine Runde von digitalen Normalisierung auf dem gereinigten liest mit Hilfe des Khmer-Werkzeug 31 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1), insbesondere normalize-by-median.py (mit k-mer Größe 20, eine Abdeckung Cut-off von 20, und x = 1e10).
  2. Alternativ, wenn eine Maschine mit hoher RAM zur Verfügung steht (Hunderte von GB), verwenden Sie Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl Skript (Tabelle 1).

11. De Novo Transkriptom Assembly

  1. Beim Zugang zu einem Computer oder einem Computer-Cluster mit bis zu 256 GB RAM und 24 CPUs, abhängig von der Größe der Anordnung.
  2. Verwenden Trinity 32 (Tabelle 1; Supplemental Datei-1), um die digital normalisierte Lese in Contigs gesetzt zu montieren. So verkleinernSpeichernutzung, verwenden --min_kmer_cov 2.

12. Montage Bewertung

  1. Führen assemblathon_stats.pl vom Assemblathon2 Projekt 33 auf der Fläche zu Trinity-Ausgang. Dieses Skript führt Grundrechenarten relevant Auswertung Montagequalität, wie die Anzahl der Gerüste, N50, Montage Zusammensetzung und (Tabelle 1; Supplemental Datei 1).

13. Markieren des Assembled Transkriptom

  1. Führen BLASTX (Tabelle 1) der Anordnung gegenüber einem Referenzprotein-Set; für Moskitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens und Aedes aegypti eignen Referenzen. Genauer gesagt, formatieren Sie das Referenzprotein fasta Datei für Explosion, gefolgt von blastx (Supplemental Datei 1).

14. Karte Liest der Versammlung Mit RSEM 34 (Tabelle 1)

  1. Erstellen Sie eine Datei "transcript-to-Gen-Karte", in dem dererste Spalte enthält die Referenz-Gen-IDs und die zweite Spalte die Fläche zu IDs. In einem Spreadsheet-Editor, tauschen die ersten und zweiten Spalte von der BLASTX Ausgang, und schreiben Sie diese Spalten in eine TXT-Datei. Verwenden Sie die Linebreak-Programm um Zeilenumbrüche in der resultierenden Textformat an den Unix-Format zu konvertieren.
  2. Erstellen Sie eine Referenzdatensatz aus der Transkriptom fasta Datei mit dem RSEM-Vorbereitung Verweis Skript, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.
  3. Berechnen Sie die Expressionswerte für jede Bibliothek mit dem Befehl RSEM-calculate-Ausdruck, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. Wie liest, verwenden Sie die gepaart fastq Dateien aus dem Lesereinigungsschritt (Schritt 9.2) ergibt.
    1. Wenn RNA aus einer biologischen Replikation wurde für die Sequenzierung in zwei Bahnen aufgeteilt, umfassen sowohl fastq Dateien im Ausdruck Berechnung, um eine einzelne Datei zu generieren.
  4. Konvertieren Sie die Ausdruck ergibt sich aus jeder Bibliothek zu einer Matrix leicht von anderen p verarbeitetROGRAMME mit dem mitgelieferten Skript RSEM-generate-Data-Matrix, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.

15. Differential Expressionsanalyse

  1. Installieren R und Kantenschneider (Tabelle 1).
  2. Verwenden read.delim die RSEM Ergebnisse aus Schritt 14.3 (Supplemental Datei-1) zu laden. Falls erforderlich, ergänzen die Zähler auf die nächste ganze Zahl.
    HINWEIS: Der Kantenschneider Leitfaden empfiehlt die Begrenzung der Datenmenge, um Gene mit hoch genug zum Ausdruck Bedeutung zu erkennen.
  3. Um die Daten für Edger zu formatieren, erzeugen eine DGEList Objekt aus der geladenen Datei (Supplemental Datei 1). Dann normalisieren die Daten mit TMM Normalisierung (Supplemental Datei 1). Schätzen Sie die gemeinsame und tagwise Dispersionen der Daten (Supplemental Datei 1).
  4. Identifizieren differentiell exprimierte Gene mit einem Benjamini-Hochberg korrigierten p-Wert <0,05 (Supplemental Datei 1). Zeichnen Sie die Verteilung der log-fach Wechsel vs. Fülle (Supplemental Datei 1).

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Representative Results

Fluorometrie zweier repräsentativer RNA Proben zeigten zwei Banden bei ca. 2000 nt (1A, B). Das Insekt 28S ribosomale RNA aus zwei Polynucleotidketten durch Wasserstoffbrücken, die sich leicht durch kurzes Erhitzen oder Agenten, die Wasserstoffbrückenbindungen 35 stören gestört zusammengehalten zusammen. Die resultierenden beiden Komponenten ungefähr die gleiche Größe wie der ribosomalen RNA 18S. Die zweite RNA-Probe zeigte eine hohe Abbauwerte (1B).

Photoperiodische Behandlung von einer repräsentativen Gruppe von A. albopictus Moskitos zu hohen Diapause Einfalls Kurztag- aufgezogenen Mücken und niedrige Diapause Einfalls Langtagbedingungen aufgezogenen Mücken, obwohl es einige Unterschiede zwischen den Replikaten (Tabelle 2). Zum Beispiel replizieren SD2 zeigt niedriger (80%) Diapause Inzidenz als die übrigen Replikate (87,18% - 97,67%). Das Replikat hatte auch die kleinsten sampl e Größe, so empfiehlt es sich, um eine ausreichende Anzahl von Eiern (> 150) für die Messung der Diapause, um ein genaues Ergebnis zu erhalten, aufgehoben.

Post-Sequenzierung lesen Reinigung auf einer repräsentativen Bibliothek von Erwachsenen A. albopictus Weibchen entfernt eine erhebliche Anzahl von Lesevorgängen (von 83.853.322 auf 52.736.065 Gesamt liest für einen Vertreter Bibliothek). Digitale Normalisierung weiter reduziert die Anzahl der gesamten liest zu 41.435.934. Ein Trinity Montage von diesen liest erzeugt 76.377 Contigs, mit einem N50 von 1879, mittlere Fläche zu Länge von 1.023,1 und eine maximale Fläche zu Länge von 20.892 (Abbildung 3). Differential Expressionsanalysen von einem ähnlichen Arbeitsablauf von Embryonen unter Diapause induzierenden Bedingungen bei 11 und 21 Tage nach der Eiablage ergab 3.128 differenziell exprimierte Gene zwischen diesen beiden Zeiträumen (4) aufgezogen.

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Abbildung 1: Fluorometrie Profile von Beispiel hochwertige (A) und von geringer Qualität (B) RNA Extraktionen von A. albopictus. Die x-Achse repräsentiert die Größe der Nukleotid-Fragmente, und die y-Achse stellt die Fluoreszenzmesswerte. Man beachte den Unterschied in der Y-Achsenskala zwischen den Tafeln (A) und (B). Pfeile markieren die Positionen der verschiedenen ribosomalen RNAs. Die scheinbaren Bands in der Nähe des grünen Markierungsband zeigen Abbau.

Abbildung 2

Abbildung 2: Zusammenfassung der Bioinformatik-Workflow von der Vorbereitung bis zur gelesen differentielle Expression Jedes Kästchen stellt einen Schritt in die Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll, begleitet von der entsprechenden Anzahl von einzelnen Protokolle Schritt..


Abb. 3: Histogramm der Fläche zu Längen von einer Trinity de novo Transkriptom Montage Die durchschnittliche Fläche zu Länge beträgt 1.023,1. Beachten Sie, dass die Verteilung der Fläche zu Länge ist stark verzerrt zu kürzeren Contigs; Dies ist typisch für de novo Transkriptom Montage.

4
Abbildung 4: Melden Sie 2 fach Wechsel vs. Fülle von TMM-normalisierten Genexpression Diapause pharate Larven auf 11 Tage vs. 21 Tage nach der Eiablage Jeder Punkt bezeichnet eine Unigene;. differentiell exprimierten unigenes sind rot. Unigenes mit höhere Expression um 11 Tage nach der Eiablage positive fach-Werte ändern, in demals unigenes mit höheren Ausdruck 21 Tage nach der Eiablage negative fold change Werte.

Programm / Ressourcen Website URL (abgerufen 2014.01.13)
perl http://www.perl.org/get.html
Python http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Kern ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Dreieinigkeit http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
DreieinigkeitNormalisierung Skript http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 Auswertungsskripte https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (die makeblastdb und blastx umfasst) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Zeilenumbruch https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger Benutzerhandbuch http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabelle 1: Programme und Ressourcen für t eingesetzter Bioinformatik Verfahren in diesem Protokoll. URLs aufgelistet sind den einfachen Zugriff auf jeden der in diesem Protokoll erforderlichen Ressourcen.

Behandlung Wiederholen Anzahl der Eier vom 1. Luke Anzahl der Eier vom 2. Luken Nr embryonierten, nicht geschlüpften Eier % Diapause
SD 1 10 0 68 87,18
SD 2 3 0 12 80,00
SD 3 1 0 42 97,67
SD 4 5 0 46 90,20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9,78
LD 2 28 0 4 12,50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14,29
LD 5 43 0 3 6,52

Tabelle 2:. Diapause Inzidenz Berechnungen Ergebnisse aus fünf Wiederholungen pro Photoperiode von Diapause Inzidenz Berechnungen. Die Zahl der geschlüpften Larven von zwei verschiedenen Schraffuren sind enthalten, ebenso wie die Zahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern, die alle notwendig, Diapause Inzidenz berechnen sind.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt Methoden, um differentiell exprimierte Gene aufgrund entdecken induzierte Diapause in A. photoperiodisch albopictus. Das Protokoll ist, dass es auf einzigartige Weise Moskito Aufzucht und Bioinformatik-Techniken, um alle experimentelle Aspekte eines molekularen Physiologie Programm zugänglich Anfänger machen signifikante - insbesondere für diejenigen, die sich auf die photoperiodische Diapause Antwort. Bestehende Verfahren, nach unserer Kenntnis nicht bieten so viele Details bei der Aufzucht-Protokoll - die oft notwendig ist, um Fehler zu identifizieren, Aufzucht - noch haben sie einen Einblick auf experimentelles Design während der Aufzuchtphase, die erfolgreich bioinformatische Analyse Downstream ermöglicht. Die hier vorgestellten Verfahren wurden für A. optimiert albopictus, vor allem die Aufzuchtmethoden, die in der Regel nehmen sechs Wochen nach einer Labor Generation zur nächsten. Jedoch in zukünftigen Anwendungen dieser Methode könnten mit bescheidenen angepasst werdenAnpassungen an andere Mückenarten, die photoperiodische Diapause 23 aufweisen. Außerdem werden zur Versuchsplanung und Bioinformatik Workflow gelten für das Studium der anderen polyphenisms.

Einige Punkte, die nicht im Protokoll aufgeführt sollte bei der Aufzucht von A. werden albopictus Larven. Zuerst A. albopictus können in einer Vielzahl von natürlichen und künstlichen Behälter Lebensräume wie in früheren Arbeiten beschrieben 36, 37. Gebrauchte Reifen Plätze sind eine häufige Quelle von Larven zur Festlegung labor Kolonien gefunden werden. Bevölkerung über 32N Breitengrad in Nordamerika gesammelt zu erwarten, dass eine starke Reaktion Diapause 13 aufweisen werden. Die A. in diesem Protokoll verwendet albopictus Stamm wurde aus Manassas, VA gesammelt und wurde in einer Laborumgebung mehr als acht Generationen vor der experimentellen Manipulation aufgezogen. Zweitens sollten die Beleuchtung in den Photoperiode Schränke mit Sorgfalt ausgewählt werden. Bulbs Schränkemit eingebautem Lichtfunktionen können Temperaturspitzen im Gehäuse zu bewirken, wenn die Beleuchtung ein- bzw. ausgeschaltet wird. Anekdotische Beobachtung legt nahe, diese Temperaturspitzen können die Diapause Reaktion stören. Um dies zu verhindern, integrierte Lichtfunktionen sollten deaktiviert werden und Schränke sollten mit einem 4-Watt-cool-Leuchtstofflampe ausgestattet werden. Drittens Larven sind empfindlich gegenüber H 2 O Qualität und Lebensmittelfluss. Daher kann Überfütterung, um bakterielle Akkumulation und Larvensterblichkeit führen. Viertens gibt es alternative Methoden zur Blutzufuhr erwachsenen weiblichen Mücken. Glasmembranen sind eine Alternative künstlichen Membransystem 38, 39, obwohl die HemoTek System führt besser in Erfahrung der Autoren. Lebende Tiere (meist Huhn oder Nagetier) kann auch verwendet werden 38 - in diesem Fall ist es wichtig, zunächst entsprechende Zertifizierung zu erhalten von Ihrem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). Fünftens, obwohl es keine klaren Beweise veröffentlicht thbei Eiern sind lichtempfindlich 15, schlage anekdotischen Beobachtungen, dass Eier von einer SD-Photoperiode Behandlung weisen leicht reduziert Diapause Inzidenz, wenn sie einer Photoperiode LD 10 Tage nach der Eiablage ausgesetzt. So speichern sowohl SD und LD Eier unter SD Bedingungen, um eine maximale Diapause Reaktion in den SD-Eier zu produzieren und zu keiner Verwechslung Wirkung von Photoperiode (SD vs. LD) bei Eier Lagerung.

Hohe RNA-Qualität ist für die Erstellung hochwertiger RNA-Seq Daten. Reichlich Sorgfalt sollte während der RNA-Extraktion getroffen werden, um Nuklease Kontamination zu vermeiden. Niedrige Qualität RNA-Proben, wie sie in 1B gezeigt, sind nicht für die Sequenzierung geeignet. Die Beurteilung der RNA Qualität, bevor die Proben für die Sequenzierung ist zwingend erforderlich. Charakteristische Banden von RNA-Molekülen kann für verschiedene Arten von Insektengewebe zur RNA-Extraktion verwendet wird, wie beispielsweise vier Bänder kleiner als 18S in der hohen Qualität RNA Elektropherogramm gezeigt sichtbarin 1A. Timmende Muster von anderen als den zwei Banden bei 18S in Proben unter unterschiedliche biologische Behandlungen RNA Banden stark kann zeigen, daß diese Bänder nicht vor Abbau führen, stellen aber die biologische Zusammensetzung der RNA-Moleküle in den spezifischen Gewebetypen in der Versuchsanordnung gewählt.

Die Bioinformatik Workflow skizzierten kann ein Benutzer mit einigen Befehlszeile und Scripting-Fähigkeiten, um eine Liste der differentiell exprimierten Gene von Illumina Sequenzierung Daten repliziert RNA-Bibliotheken erzeugt aus zwei kontrastierenden Versuchsbedingungen zu erhalten. Während dieses Beispiel betrifft Gene durch Photoperiode unterschiedlich exprimiert, kann dieser Workflow jeder Versuchsanordnung mit zwei oder mehr Behandlungen angewendet werden, in jedem Organismus. Es gibt viele andere Möglichkeiten, um auf eine Liste von differentiell exprimierten Genen zu gelangen; jedoch ist dieses Protokoll wahrscheinlich der einfachste Ansatz für den Anfänger sein. Mehr aberfahrenen Bioinformatiker Vielleicht möchten Sie zusätzliche Maßnahmen, um die Nachbarschaft und Redundanz ihrer Montage zu verbessern. Biologen mit wenig bis gar keine Erfahrung Bioinformatik können auch komplette zumindest einen Teil dieser Pipeline im iPlant 40 Discovery-Umwelt, die eine freie grafische Benutzerschnittstelle angesteuert Analyseumgebung ist. Es ist wahrscheinlich, dass iPlant Funktionalität wird in Zukunft größer sein, um vollständige RNA-Seq-Pipelines von De-novo-Transkriptom Baugruppen aufnehmen wachsen. Schließlich ist zu beachten, dass der hervorragende Bedienungsanleitung gründlich diskutiert die viele Möglichkeiten, Kantenschneider 41 (Tabelle 1) für differentielle Expressionsanalyse zu verwenden.

In einigen Fällen kann die Fehlanordnungen chimären Contigs erzeugen. Es gibt verschiedene Methoden, die dazu beitragen können, diese Fehlanordnungen identifizieren, beispielsweise Uchime 42. , Aus den Erfahrungen der Vergangenheit, ist die Anzahl der erkannten Chimären jedoch äußerst gering (<0,1%); daher employinga Chimäre Erkennungsprogramm möglicherweise nicht den zusätzlichen Aufwand.

Die Verarbeitung mit hohem Durchsatz, der nächsten Generation Sequenzierungsdaten erfordert die Fähigkeit, 1) speichern große Mengen von Daten (für ein einzelnes Projekt,> 500 GB); 2) zu manipulieren große Dateien, die nicht in der traditionellen Textverarbeitungsprogrammen oder Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden können; 3) Durchführung von Analysen, die große Mengen des RAM, beispielsweise für die de novo Anordnung erfordert; und 4) Analyse großer Datenbestände, sei es durch Programme, die von einer Befehlszeilenschnittstelle (die die Möglichkeit, diese Programme zu installieren, die oft nicht trivial ist) oder durch die Analyse Suiten mit grafischen Benutzeroberflächen (erfordert angetrieben zB Galaxy 43 oder 40 iPlant ). Forscher mit einigen Kenntnisse in Unix-Kommandozeile und einer Skriptsprache wird den größten Nutzen aus Zugang zu einem lokalen Rechencluster zu gewinnen - entweder Universität Besitz, über einen Mitarbeiter oder für den eigenen Labor gekauft. Zum Beispiel kann die above Workflow wurde mit einem Laboreigenen Macintosh (12 Kerne, 64 GB RAM, 1 TB Festplatte), und eine Universität eigenen Computer-Cluster für die Trinity Montage durchgeführt. Wenn ähnliche Ressourcen nicht verfügbar sind, können die Forscher noch iPlant drehen durchführen groß angelegte Analysen ohne Kosten und mit relativ niedrigen Investitionen in die Ausbildung durch die grafische Oberfläche Umwelt. Doch diejenigen, die Durchführung und Interpretation der Analysen müssen noch die Voraussetzungen der einzelnen Programme verwendet zu verstehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

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Genetik Heft 93, photoperiodische Diapause RNA-Seq Moskitohaltung
Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em
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Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

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