Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. הזחל גידול של שני א קבוצות albopictus לבגרות

  1. הגדר שני ארונות photoperiod עם תאורה הניתנת לתכנות ב 21 מעלות צלזיוס במשך ביטוי דיאפאוזה אופטימלי 16 וכ 80% לחות יחסית.
    1. קבינט תכנית אחת ל16L: אור ד 8: מחזור כהה (שאינה דיאפאוזה גרימת photoperiod LD). הגדר את הארון השני ל8L: אור 16 ד: מחזור כהה (דיאפאוזה התרמה) 13.
    2. "האורות ב'התכנית באותו הזמן בשני הארונות ללסנכרן את זמן היממה בין photoperiods.
  2. לחשב את כמות הביצים הדרושים לביצוע הניסוי. לשאוף 300-500 ביצים בכלוב. לפחות שלוש לשכפל כלובי דיאפאוזה ושלוש לשכפל כלובים הלא דיאפאוזה נדרשים לייצור RNA. זה מסתכם לCA. 1,800-3,000 ביצים לכל ניסוי.
    1. האץ הביצים על ידי השריית ניירות ביצה לתוך בערך 500 מיליליטר של H 2 O. deionized
    2. להוסיף <em> ca. 1 מיליליטר תרחיף מזון מורכב ממזון כלבי קרקע וארטמיה כפי שתואר קודם לכן 24. כיסוי מיכל עם רשת, ולשמור על הרשת במקום עם גומייה.
    3. מניחים בארון photoperiod LD לבערך 24 שעות.
  3. זחלים בקעו העברה עד 10 x 10 x 2 סנטימטר פטרי H מנות מלאות מיליליטר 90 בערך deionized 2 O.
    1. לשמור בערך 30 זחלים לכל צלחת. העבר את הזחלים לנקות מנות כל שעות 48-72, למשל בכל יום שני, רביעי ושישי (MWF) 24.
    2. slurry מזון 1 מיליליטר בערך Feed בהיקף של מזון לכלבי קרקע וארטמיה במים ללא יונים כל MWF כמו בעבר תאר 24.
  4. הגדרה 03:57 כלובים מבוגרים לכל טיפול photoperiod, שבו כל כלוב כולל לשכפל ביולוגי.
    1. משני צדי מתרס של 9.5 דליי L, לגזור חור סנטימטר 10-by-14 אחד, ועוד חור בקוטר 15 סנטימטר. CoVer הראשון עם רשת. חותך כ אחד אורך רגל של גרב אורתופדים, ודבק קצה אחד סביב החלק הפנימי של החור האחר.
    2. חותך את קצה הרגל של הגרב ומסגר קשר - פתוח רק כאשר יש צורך בגישה לחלק הפנימי של הכלוב. למכסה הכלוב, לחתוך את כל הפנים, ומשאירים רק את השפה, ולהחליף את הפלסטיק הפנימי עם רשת 24.
    3. הערה photoperiod, לשכפל מספר, תאריך התחלת כלוב, וכל מידע אחר רלוונטי לניסוי עם סמן קבוע בצד של הכלוב.
  5. שורה התחתונה של הכלובים המבוגרים עם נייר סינון רטוב. לצנן את נייר הסינון עם מספיק H 2 O deionized להגדיל לחות מקומית בכלוב, אך להימנע מים עמד, שיכול לעורר ההטלה על נייר הסינון 24. בדוק את נייר הסינון יומי לייבוש, מחדש רטוב בעת צורך.
  6. כדי לייצר ביצים מספיק לספריית RNA, כוללים לפחות 100 נשים / ca 9.5 Lge, עם לא יותר מ -500 יתושים בכל כלוב.
  7. לאסוף MWF גלמים ומקום בכוס קטנה של H 2 O הנקי בצפיפות של לא יותר מ -50 גלמים לכל 25 מיליליטר H 2 O. העבר את כוס הגלמים לכלוב מבוגר. כלובי מקום בארון photoperiod בהתאמה - א גלמי albopictus הם רגישים 15.
  8. ודא יומי שH 2 O בכוסות נקי וברור, ולהסיר גלמים מתים, כי הצטברות של גלמים מתים יכולה לגרום לתמותה המונית. הסר H 2 O כוסות אחרי כל הגלמים לצוץ.
  9. מניחים צימוקים אורגניים ברשת העליונה של הכלוב כדי לספק סוכר למבוגרים יצאו. צג צימוקים, ולשנות אותם כל 3-5 ימים כדי למנוע הצטברות עובש.

2. תחזוקה של מבוגרים כדי לאפשר ייצור של הזדווגות וביצה

  1. לשמור על כלובים בלחות גבוהה (כ. 80%) על ידי המצפה את תחתית הכלוב עם נייר סינון לח, ומספק גישה לצימוקים שאינם מעופשים, כפי שתואר לעיל (sectiתוספות 1.5 ו -1.9).

3. דם-האכלה

  1. הכן לנקבות דם הזנה בין שניים לשישה ימים לאחר eclosion כדי להבטיח שנשים שנחשפו ללפחות שמונה ימים קצרים חד-משמעיים לפני ההטלה מתחילה לכמעט 100 ביצי דיאפאוזה% 14.
  2. הכן את מערכת האכלת Hemotek ממברנה. חבר את יחידות האכלה לאספקת החשמל. כוון את הטמפרטורה של כל יחידה עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות בורג ההתאמה. השתמש במדחום ובדיקה אלקטרוניים כדי למדוד את הטמפרטורה של יחידת ההאכלה במהלך כיול.
  3. הכן את מאגר הארוחה. למתוח רבוע של קרום האכלת קולגן על הצמצם של מאגר הארוחה ולאבטח אותו עם O-טבעת. משכו בזהירות את הפינות להסרת קמטים; חתוך את הקרום העודף במספריים.
    הערה: קרום קולגן עשוי שלא לפעול היטב לכל מיני היתושים, וייתכן שיהיה צורך לנסות כמה כדי למצוא את הקרום האופטימלי אם עובד עםמינים אחרים מאשר A. albopictus. Parafilm עובד היטב עם כולכית מצויים.
    1. אם דם מאוחסן קפוא, להפשיר בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1 לפני השימוש.
    2. החזק את המאגר, וכך הקרום פונה כלפי מטה, והיציאות שאינן נתמכות, המילוי הם פונים כלפי מעלה. השתמש פיפטה העברה או מזרק כדי למלא את המאגר עם כ 3 מיליליטר של דם מלא מתרנגולות שיש נתרן ציטרט כנוגדת קרישה. לאטום יציאות מילוי עם תקעי פלסטיק.
  4. צרף את המאגר מוכן המזין על ידי הברגתו על ההרבעה על צלחת העברת חום בתחתית המזין. הפוך את המזין ולמקם אותו בחלק העליון של הכלוב, צד קרום למטה, כך שיתושים יכולים להאכיל דרך רשת הכלוב. שמור המזין בכלוב לכ 45 דקות על מנת למקסם את ההאכלה.

4. עידוד הטלה

  1. ארבעה עד חמישה ימי הודעה ארוחת דם, לצייד כל כלוב עם הצבע כהה 50 מיליליטר געד מרופד בנייר מולבן נביטת זרעים (נייר ביצה) או מגבת נייר מולבן ללא מרקם ולמלא באמצע הדרך עם מים ללא יונים 9. אם יותר מ -250 יתושים נמצאים בכלוב, להשתמש בשתי כוסות.
    הערה: לכלובים קטנים או בקבוקונים חד-נשיים, "עירוי חציר" במכולות ההטלה עלול להגביר ההטלה בשל הריח של צמחיית חיידקי 25.

5. לאסוף ולאחסן ביצים

  1. להתחיל אוסף ביצה בתוך 4-5 ימים של האכלת דם בגלל ייצור ביצים בדרך כלל מגיע לשיא כחמישה ימים לאחר האכלת דם, ולאחר מכן שוככת במהלך השבוע הבא.
  2. להשתנות בתדירות אוסף ביצה על צרכי הניסוי. למטרות כלליות, לאסוף ניירות ביצה על לוח זמנים MWF. הסר ניירות ביצה מכל כלוב ולהחליף עם נייר טרי. תניח נייר הוסר לאחרונה בצלחות פטרי וחנות בקבינט photoperiod SD כדי למנוע תופעות של בלבול אחסון ביצה.
  3. לאפשר ניירות ביצה מחדש עיקרי רטוב במשך 2 ימים לאחר ההטלה-כדי לאפשר היווצרות ציפורן serosal, אשר מגדילה את התנגדות התייבשות ביצת 26.
  4. הודעה אוסף כ 48 שעות, ביצים יבשות באוויר פתוח. ייבש את הנייר כך שהוא רפוי ומעט לח למגע, אבל לא כל כך רטוב שהנייר הוא כהה מH 2 O או ממגר בקיעה של ביצים.
    הערה: "x 4" נייר 6.5 עלול לקחת כ 3.5 שעות לייבוש. היה זהיר לא לניירות ביצה מעל יבש, כמו זה יגרום להתייבשות ביצת 27.
  5. ביצים נוספות ריזרב מphotoperiods שני LD וSD להעריך שכיחות דיאפאוזה ולפרש את השפעת photoperiodic (ראה מדידת דיאפאוזה, סעיף 6).
  6. לאחסון לטווח ארוך, לשמור מסמכי ביצה בגיל 21 ° C ולחות כ -80% בצלחות פטרי. שמור צלחות פטרי במכל אחסון טאפרוור עם בקבוק של מים כדי לשמור על לחות מקומית כהתפתחות עוברית לוקחת ארבעה עד חמישה ימים ב 21 מעלות צלזיוס.
ove_title "> 6. מדוד דיאפאוזה תחולה

  1. השתמש בעוברים שמורות נוספים (ראו לעורר הטלה, סעיף 4), כי הם 7-20 ימים ההם לכמת את תגובת דיאפאוזה.
  2. רשום את מספר הביצים הנוכחיות על כל נייר ביצה.
  3. לעורר ביצים לבקוע על ידי השריית לחלוטין ניירות ביצה בודדים בצלחת פטרי עם 90 מיליליטר כ -80 מיליליטר H 2 O. deionized להוסיף כ 0.25 מיליליטר תרחיף מזון.
  4. לאחר 24 שעות עולים בקנה מספר זחלי instar הראשונים בקע. מניחים את צלחת פטרי על משטח שחור לדמיין זחלים ולמקם את מקור אור בצד אחד של צלחת. זחלים יהיו להתרחק ממקור האור, המאפשרים למניין ברור של זחלים בודדים. הסר זחלים בודדים עם טפטפת תוך ספירה כדי למנוע מספרים זחלים בודדים.
  5. ניירות ביצת מקום בצלחת פטרי חדשה ומחודשת יבשים. ביצים בוקעים מחדש לאחר שבוע 1 ~ ושוב עולות בקנה ביצים בקעו באמצעות השיטה הנ"ל.
  6. ניירות ביצת מקום עם u שנותר n בקע ביצים בצלחות פטרי חדשות 90 מיליליטר עם פתרון הלבנה כ 80 מיליליטר 28. ודא שניירות הביצה שקועים לחלוטין בפתרון ההלבנה ולהשאיר תחת לילה מנדף, כדי למנוע את הריח של אקונומיקה.
    הערה: הלבנת פתרון יכולה להיות מאוחסנת במשך שבוע ~ 1 על 4 מעלות צלזיוס, אבל צריך להיות אחר עשתה טרי.
  7. בדוק ביצים באמצעות מיקרוסקופ אור כהלבנה ינקה את סיסית ולאפשר להדמיה של ביצי embryonated,-בקע un. אם הביצית embryonated, הביצה תהיה צבע off-לבן עם עיניים המופיעות כשתי נקודות שחורות קטנות זה מול זה בצד הגב. עולה בקנה אחד מספר, ביצי embryonated un בקע 13.
  8. לקבוע שכיחות דיאפאוזה עם הנוסחה הבאה: דיאפאוזה% = לא. ביצים בקעו בלתי embryonated / (לא. ביצים בקעו + לא. ביצים בקעו-un embryonated) x 100 13.

7. הפקת RNA מהביצים / pharate זחלים

ontent "> הערה: השימוש Trizol בזרימה למינרית.

  1. ביצי יתושים מברשת מכילות עובר פיתוח או זחלי pharate בנקודות שונות בזמן פיתוח מעיתוני ביצה למטחנות זכוכית בעזרת מברשת משיער גמל. טוחנים את הביצים בTrizol (1 מיליליטר ל50-100 מ"ג של רקמה) עד מרסק לחלוטין. השתמש בלפחות 400 ביצים בספרייה להניב RNA מספיק.
    1. לחלופין, הצמד ביצי הקפאה בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C בצינורות microcentrifuge עד חודש לפני הטחינה בTrizol.
  2. לבצע הפקת RNA בTrizol ואחריו המשקעים isopropanol על פי הוראות יצרן.
  3. פנק את הספסל עם פתרון טיהור RNase או סוכנים אחרים כדי להסיר כל nucleases שייר כדי למנוע השפלה RNA.
    1. פנק את RNA חילוץ עם DNase. על פי הוראות יצרן, דגירה דגימות RNA עם DNase במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש & # 1181; DNase l עד 10 מיקרוגרם של RNA בתגובת 50 μl. להגדיל את כמות DNase אם יש יותר מ -10 מיקרוגרם של RNA בתגובה אחת.
    2. להשבית DNase על ידי הוספה מגיב איון DNase המושעה 5 μl. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר, ערבוב שלוש פעמים במהלך תקופת דגירה (vortexing העדין).
    3. צנטריפוגה XG ב 10,000 עבור 1.5 דקות. מעביר את supernatant המכיל דגימות RNA שטופלו לצינורות טריים לשלבים הבאים.
  4. להעריך את איכות הכוללת דגימות RNA על ידי fluorometry. שלח את הדגימות למתקן מיוחד עם מכשיר נכון למשימה זו. המתקן יבצע ג'ל אלקטרופורזה על השבב כדי לקבוע את הגדלים של מיני RNA במדגם, דמיינו ידי צבע פלואורסצנטי החדיר בשבב. התוצאות תוחזר כelectropherogram.
    1. לקבוע את היושרה של דגימות RNA הכוללת על ידי הנוכחות או עדר של מוצרים פגומים, כפי שמעיד o הנוכחותפסגות f בין פסגות RNA ריבוזומלי 18S ו5S על electropherogram וכתוצאה מכך (איור 1).

רצף 8. RNA

  1. שלח כוללת דגימות RNA עם איכות גבוהה מספיק (איור 1 א) וכמות (> 3 מיקרוגרם בדרך כלל לספרייה) למרכז מסחרי לבניית רצף של מועשר ספריות לזווג-סוף mRNA ורצף ה- mRNA, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים.
  2. אם נתיב אחד או יותר משמש לקביעת רצף ניסוי בודד, לפצל ספריות בודדות לשני נתיבים לרצף כדי להסביר וריאציה טכנית בין נתיבים ברצף.

ניקוי קרא 9. lllumina

הערה: איור 2 מסכם את חלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה. לקבלת רשימה מלאה של כל התוכניות ומשאבים המשמשים בחלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה, עיין בטבלת 1. בבנוסף, קובץ נוסף 1 מכיל דוגמאות שורת הפקודה עבור כל אחד משלבי פרוטוקול ביואינפורמטיקה הבאים.

  1. השתמש ssaha2 29 (טבלת 1) לזהות התאמות של זהות 95% ומעלה למסד נתוני צמח השדה UniVec Core, א '(טבלה 1) רצף albopictus rRNA (# L22060.1 GenBank), ומתאמי רצף (דוגמאות שורת הפקודה מפורטת שנקבעו בקובץ נוסף 1). הסר זוגות קריאה עם גפרורים באמצעות Perl או כלי scripting דומה, למשל על ידי התאמת התסריט סיפק פרל (קובץ נוסף 2).
  2. נקי שנותר קורא עם חבילת SolexaQA 30 (טבלת 1; קובץ נוסף 1): לקצץ אזורים עם מקבילה ציון Phred של פחות מ -20 תוך שימוש בהגדרות ברירת המחדל של DynamicTrim.pl.
    1. הסר קורא נ"ב קצר יותר מ -25 עם LengthSort.pl בשני קדימה ולאחור קוראים בו זמנית. להעריך את האיכות של הקבצים ניקו fastq עם FastQC (טבלת 1

10. דיגיטלי נורמליזציה

  1. לבצע סיבוב של נורמליזציה דיגיטלית אחד בניקה קורא באמצעות כלי החמר 31 (טבלת 1; קובץ נוסף 1), במיוחד normalize-by-median.py (באמצעות גודל k-mer 20, כיסוי חתך של 20, וx = 1e10).
  2. לחלופין, אם מכונה עם גבוה RAM זמין (מאות GB), להשתמש בסקריפט של טריניטי normalize_by_kmer_coverage.pl (טבלת 1).

11. De עצרת transcriptome Novo

  1. לקבל גישה לאשכול מחשב או מחשב עם עד 256 GB של RAM ו -24 מעבדים, תלוי בגודל של ההרכבה.
  2. השתמש בטריניטי 32 (טבלה 1; קובץ נוסף 1) להרכיב את הקריאה דיגיטלית המנורמלת להגדיר לcontigs. כדי להפחיתשימוש בזיכרון, השתמש --min_kmer_cov 2.

12. עצרת הערכה

  1. הפעל assemblathon_stats.pl מפרויקט Assemblathon2 33 על תפוקת contig טריניטי. סקריפט זה מבצע חישובים בסיסיים רלוונטיים לאיכות הרכבה הערכה, כגון מספר הפיגומים, N50, הרכב הרכבה, ועוד (טבלה 1; קובץ נוסף 1).

13. ביאור של transcriptome מורכבת

  1. בצע Blastx (טבלת 1) של ההרכבה נגד קבוצת חלבון התייחסות; ליתושים, melanogaster דרוזופילה, אנופלס gambiae, כולכית מצוי, וAedes aegypti הפניות מתאימות. באופן ספציפי, לאתחל את קובץ חלבון התייחסות fasta לפיצוץ, ואחריו blastx (קובץ נוסף 1).

14. מפה קוראת לעצרת שימוש RSEM 34 (טבלה 1)

  1. צור קובץ 'תמליל לגן-המפה', שבוהעמודה ראשונה מכילה את תעודות זהות של גן ההתייחסות, והעמודה השנייה את תעודות הזהות של contig. בעורך גיליון אלקטרוני, להחליף את העמודים הראשונים והשני מתפוקת Blastx, ולכתוב טורים אלה לקובץ txt. השתמש בתכנית LINEBREAK להמיר מעברי שורה בקובץ txt וכתוצאה מכך לפורמט יוניקס.
  2. צור מערך התייחסות מקובץ FASTA transcriptome באמצעות סקריפט rsem-להכין-ההתייחסות, המסופק באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).
  3. חשב את ערכי הביטוי בנפרד עבור כל ספרייה באמצעות פקודת rsem לחשב הביטוי, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1). כקורא, להשתמש בקבצים לזווג fastq כתוצאה מצעד ניקוי לקריאה (שלב 9.2).
    1. אם RNA מלשכפל ביולוגי פוצל לשני נתיבים לרצף, כולל שני קבצי fastq בחישוב הביטוי כדי ליצור קובץ יחיד.
  4. להמיר את תוצאות הביטוי מכל ספרייה למטריצת מעובד בקלות על ידי p האחרrograms באמצעות rsem-ליצור-data-מטריצת התסריט סיפקה, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).

15. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי

  1. התקן R וEdger (טבלה 1).
  2. השתמש read.delim כדי לטעון את תוצאות RSEM מצעד 14.3 (קובץ נוסף 1). במידת צורך, לעגל. הספירה למספר שלם הקרוב ביותר
    הערה: מדריך Edger ממליץ להגביל את בסיס הנתונים לגנים עם מספיק ביטוי גבוה כדי לזהות משמעות.
  3. כדי לעצב את הנתונים לEdger, ליצור אובייקט DGEList מהקובץ שנטען נתונים (קובץ נוסף 1). לאחר מכן, לנרמל את הנתונים באמצעות הנורמליזציה TMM (קובץ נוסף 1). להעריך את התפוצות הנפוצות וtagwise של הנתונים (קובץ נוסף 1).
  4. זיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי עם Benjamini-הוכברג תיקן p-value <0.05 (קובץ נוסף 1). עלילה ההפצה של יומן-פי-שינוי לעומת שפע (קובץ נוסף 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorometry של שתי דגימות RNA נציג הראה שתי להקות בכ -2,000 NT (איור 1 א ', ב'). RNA ריבוזומלי -28 חרק מורכב משתי רשתות polynucleotide מוחזקות ביחד על ידי קשרי מימן, שהם שיבשו בקלות על ידי חימום או סוכנים המשבשים קשרי מימן 35 קצרים. שני מרכיבים המתקבלים הם בערך באותו גודל כמו RNA ריבוזומלי 18S. מדגם RNA השני הראה רמות גבוהות של השפלה (איור 1).

טיפול Photoperiodic של קבוצה מייצגת של א ' יתושי albopictus הביאו שכיחות גבוהה דיאפאוזה ביתושים קצר-גודלו יום, ושכיחות נמוכה דיאפאוזה ביתושים ארוך-גודלו יום, למרות שהיה קצת שונה בין משכפל (טבלה 2). לדוגמא, לשכפל SD2 תערוכות (80%) שכיחות נמוכה יותר מאשר דיאפאוזה משכפל הנותר (87.18% - 97.67%). לשכפל את זה גם היה לי sampl הקטן ביותר גודל דואר, ולכן מומלץ להניח בצד את מספר מספיק של ביצים (> 150) למדידת דיאפאוזה על מנת לקבל תוצאה מדויקת.

Post-רצף לקרוא ניקוי בספריית נציג אחד מא הבוגר נקבות albopictus הוסרו מספר לא מבוטל של קורא (מ83853322 52736065 לסך קורא לספריית נציג אחד). נורמליזציה דיגיטלית להפחית עוד יותר את מספר הכולל קורא ל41435934. הרכבה שילוש של אלה קורא נוצרה 76377 contigs, עם N50 של 1,879, אורך contig ממוצע של 1,023.1, ואורך contig מרבי של 20892 (איור 3). ביטוי ההפרש ניתוחים מעבודה דומה של עוברים שגדלו בתנאים ישכנע דיאפאוזה ב -11 ו -21 ימים לאחר ההטלה-גילתה 3,128 גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בין שתי תקופות הזמן אלה (איור 4).

"= רוחב" 600px /ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "/>

איור 1: פרופילים של דוגמא באיכות גבוהה (A) ואיכות נמוכה (B) עקירות RNA Fluorometry מא albopictus. ציר X מייצג את הגדלים של שברי נוקלאוטיד, וציר y מייצג את קריאות ניאון. שים לב להבדלים בקנה מידת ציר y בין פנלים () ו- (B). חצים מסמנים את עמדותיהם של RNAs ריבוזומלי השונים. הלהקות בולטות קרובות ללהקת הסמן הירוקה מציינות השפלה.

איור 2

איור 2: סיכום של זרימת העבודה ביואינפורמטיקה מהכנה לקרוא לביטוי הפרש כל תיבה, מהווה צעד בסעיף ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה, מלווה במספר המקביל של כל שלב פרוטוקול..


איור 3:. היסטוגרמה של אורכי contig מדה נובו הרכבה transcriptome שילוש אורך contig הממוצע היא 1,023.1. שים לב שחלוקת אורכי contig מוטה בכבדות לעבר contigs קצר יותר; זה אופייני לדה נובו הרכבה transcriptome.

איור 4
איור 4: 2 התחבר -fold-שינוי לעומת שפע של ביטוי גני TMM-מנורמל של זחלי pharate דיאפאוזה ב -11 ימים לעומת 21 ימים לאחר ההטלה-כל נקודה מציינת unigene;. unigenes הביע באופן דיפרנציאלי הם באדום. יש לי Unigenes עם ביטוי גבוה יותר ב -11 ימים שלאחר ההטלה-ערכים מתקפלים שינוי חיוביים, שבוכunigenes עם ביטוי גבוה יותר יש 21 ימים לאחר ההטלה-ערכים מתקפלים שינוי שליליים.

תכנית / משאבים כתובת אתר אינטרנט (גישה 2014/01/13)
פרל http://www.perl.org/get.html
פִּיתוֹן http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
צמח השדה UniVec Core ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
חמר https://github.com/ged-lab/khmer
שִׁלוּשׁ http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
שִׁלוּשׁתסריט נורמליזציה http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 תסריטי הערכה https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
פיצוץ + (הכולל makeblastdb וblastx) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
LINEBREAK https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
המדריך למשתמש Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

טבלת 1: תוכניות ומשאבים המשמש לtהוא יואינפורמטיקה נהלים בפרוטוקול זה. כתובות URL מופיעות לגשת בקלות כל אחד מהמשאבים הדרושים בפרוטוקול זה.

טיפול לשכפל מס 'ביצים מיום 1 בפתח st מס 'ביצים מ2 nd הפתח מס 'ביצי embryonated, ביצה שלא נולדו דיאפאוזה%
SD 1 10 0 68 87.18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97.67
SD 4 5 0 46 90.20
SD 5 6 0 79 92.94
LD 1 79 4 9 9.78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

טבלה 2:. חישובי שכיחות דיאפאוזה תוצאות מחמש חזרות לכל photoperiod של חישובי שכיחות דיאפאוזה. מספרים של זחלים בקעו משתי בקיעה נפרדת כלולים, כמו גם מספר, ביצים בלתי בקע embryonated, אשר כולם יש לחשב שכיחות דיאפאוזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטות לגלות גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בשל photoperiodically דיאפאוזה המושרית בא albopictus. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא משלב באופן ייחודי לגידול יתושים וטכניקות ביואינפורמטיקה לעשות את כל ההיבטים הניסיוניים של תכנית פיזיולוגיה מולקולרית נגישה למשתמשים מתחילים - ובעיקר עבור אלה המתמקדים בתגובת דיאפאוזה photoperiodic. שיטות קיימות, למיטב ידיעתנו, לא מספקות כמה שיותר פרטים בפרוטוקול הגידול - שלעתים קרובות יש צורך לזהות טעויות גידול - ולא לעשות שהם מספקים תובנה על תכנון ניסוי בשלב הגידול שיאפשר ניתוח bioinformatic מוצלח במורד הזרם. השיטות שהוצגו כאן כבר מותאמות לא albopictus, במיוחד בשיטות הגידול, אשר בדרך כלל לוקחות שישה שבועות מדור מעבדה אחד למשנהו. עם זאת, ביישומים עתידיים בשיטה זו יכולה להיות מותאמת עם צנועהתאמות למינים יתושים אחרים שמפגינים דיאפאוזה photoperiodic 23. יתר על כן, עיצוב ניסיון בכלל והעבודה ביואינפורמטיקה חלים על המחקר של polyphenisms האחר.

כמה נקודות לא מפורטות בפרוטוקול יש לשקול בעת גידול א זחלי albopictus. ראשית, א ' ניתן למצוא albopictus במגוון רחב של בתי גידול טבעיים ומלאכותיים מיכל כמתואר במאמרים קודמים 36, הרבה צמיגים משומשים 37. הוא מקור נפוץ של זחלים להקמת מושבות מעבדה. ניתן לצפות אוכלוסיות שנאספו מעל קו רוחב 32N בצפון אמריקה להפגין תגובת דיאפאוזה חזקה 13. א זן albopictus שימוש בפרוטוקול זה נאסף מManassas, VA, וגודל במעבדת הגדרה יותר משמונה דורות לפני מניפולציה ניסויית. שנית, יש לבחור תאורה בארונות photoperiod בזהירות. נורות בארונותעם פונקציות תאורה מובנית יכול לגרום קוצים טמפרטורה בתוך הארון כאשר התאורה נדלקת או כבויה. תצפית רחבות מצביעה על קוצים טמפרטורה אלה יכולים לשבש את תגובת דיאפאוזה. כדי למנוע זאת, פונקציות המובנות של תאורה צריך להיות נכה וארונות צריכים להיות מצוידים בנורת ניאון מגניב-4 ואט. שלישית, זחלים רגישים לאיכות 2 O שפע ומזון H. לכן, על-האכלה עלולה להוביל להצטברות חיידקים ותמותת זחל. רביעית, יש שיטות חלופיות ליתושי נקבה בוגרים דם הזנה. קרומי זכוכית הם מערכת חלופית מלאכותית קרום 38, 39, למרות שמערכת HemoTek מבצעת טובה יותר בניסיון של המחברים. גם בעלי חיים (בדרך כלל עוף או מכרסם) יכולים לשמש 38 - במקרה זה, זה חיוני כדי ראשון לקבל הסמכה מתאימה מהטיפול בבעלי חיים המוסדי שלך ועדת שימוש (IACUC). חמישי, אם כי אין ראיות שפורסמו ברורות הבביצים הן רגישים 15, תצפיות אנקדוטיות מצביעות על כך שביצים מתערוכת טיפול photoperiod SD מעט מופחתות שכיחות דיאפאוזה כאשר הם נחשפים לphotoperiod LD בתוך 10 ימים מהטלה. לפיכך, לאחסן ביצי SD וLD בתנאי SD כדי לייצר תגובת דיאפאוזה מקסימלי בביצי SD ולהימנע מכל השפעה של בלבול photoperiod (SD לעומת LD) במהלך אחסון ביצה.

איכות גבוהה RNA היא חיונית ליצירת נתונים RNA-Seq באיכות גבוהה. טיפול בשפע יש לנקוט במהלך הפקת RNA כדי למנוע זיהום nuclease. דגימות איכות נמוכות RNA, כמו שמוצג באיור 1, אינן מתאימות לריצוף. הערכת איכות RNA לפני שליחת הדגימות עבור סידור הכרחי. להקות אופייניות למולקולות RNA עשויות להיות גלויות לסוגים שונים של רקמות חרקים המשמשים להפקת RNA, כגון ארבע להקות קטנות יותר 18S מוצג בelectropherogram RNA באיכות גבוההבאיור 1 א. דפוסים עקביים של להקות RNA אחרות משתי הלהקות ב18S פני דגימות תחת טיפולים ביולוגיים שונים יכול מאוד מצביעים על כך שהלהקות האלה אינן נובעות משפלה, אבל מייצגות הרכב ביולוגי של מולקולות RNA בסוגי הרקמות הספציפיות שנבחרו בעיצוב ניסיוני.

ביואינפורמטיקה העבודה המתוארת כאן מאפשרת למשתמש עם כמה מיומנויות של שורת הפקודה וscripting כדי להשיג רשימה של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי מנתוני רצף Illumina שנוצרו מספריות RNA משוכפלים משני מנוגדות תנאי ניסוי. בעוד דוגמא זו נוגעת גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בשל photoperiod, זרימת עבודה זו יכולה להיות מיושמת על כל עיצוב ניסיוני עם שניים או יותר טיפולים, בכל אורגניזם. יש הרבה דרכים אחרות להגיע לרשימה של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי; עם זאת, פרוטוקול זה עשוי להיות הגישה הפשוטה ביותר למשתמש המתחיל. יותר לשעברbioinformaticians perienced אולי כדאי לנקוט בצעדים נוספים כדי לשפר את הרצף ויתירות של ההרכבה שלהם. ביולוגים עם לא מעט ניסיון ביואינפורמטיקה עשויה גם מלא לפחות חלק מצינור זה בתוך iPlant 40 גילוי הסביבה, שהיא סביבת ניתוח מונחה ממשק גרפי למשתמש בחינם. סביר להניח כי פונקציונלי של iPlant יגדלו גדול יותר בעתיד על מנת להתאים צינורות RNA-Seq מלאים ממכלולי transcriptome דה נובו. לבסוף, שימו לב שהמדריך למשתמש המעולה דן ביסודיות דרכים רבות להשתמש Edger 41 (טבלת 1) לניתוח ביטוי ההפרש.

במקרים מסוימים, אי-מכלולים יכולים ליצור contigs chimeric. ישנן מספר שיטות שיכולים לעזור לזהות mis-מכלולים אלה, למשל, Uchime 42. עם זאת, מניסיון העבר, מספר מפלצות שזוהו הוא (<0.1%) הנמוכים ביותר; לכן, employinתכנית איתור הכימרה ga לא יכולה להיות שווה את המאמץ הנוסף.

עיבוד תפוקה גבוהה, נתונים רצף של הדור הבא דורש את היכולת) חנות 1 כמויות גדולות של נתונים (לפרויקט בודד,> 500 Gb); 2) לטפל בקבצי נתונים גדולים שלא ניתן לפתוח במעבדי תמלילים מסורתיים או תוכניות גיליון אלקטרוני; 3) לבצע ניתוחים הדורשים כמויות גדולות של זיכרון RAM, למשל, להרכבת דה נובו; ו 4) לנתח מערכי נתונים גדולים, בין אם באמצעות תוכניות מונעות על ידי ממשק שורת פקודה (הדורש את היכולת להתקין תוכניות אלה, אשר לעתים קרובות אינם טריוויאלי), או באמצעות ניתוח סוויטות עם ממשקי משתמש גרפיים (למשל Galaxy 43 או 40 iPlant ). חוקרים עם כמה בקיאות בשורת פקודת יוניקס ושפת סקריפטים ירוויחו את מירב התועלת מגישה לאשכול מחשוב מקומי - בין אם בבעלות אוניברסיטה, באמצעות משתף פעולה, או שנרכשו עבור המעבדה שלהם. לדוגמא, abעבודה אובה הושגה באמצעות Macintosh בעלות מעבדה (12 ליבות, 64 GB זיכרון RAM, כונן קשיח 1 TB), ואשכול מחשב בבעלות אוניברסיטה להרכבת טריניטי. אם משאבים דומים אינם זמינים, חוקרים עדיין יכולים לפנות לiPlant לבצע בקנה מידה גדולה ניתוחים ללא עלות, ועם השקעה נמוכה יחסית באימונים בשל סביבת הממשק הגרפית. עם זאת, אלה ביצוע ולפרש את הניתוחים עדיין צריכים להבין את ההנחות של כל תכנית בשימוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

גנטיקה גיליון 93, דיאפאוזה photoperiodic RNA-Seq בעלי יתושים
ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter