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Biology

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

1. larvale allevamento di due A. albopictus gruppi di età adulta

  1. Impostare due armadi fotoperiodo con illuminazione programmabile a 21 ° C per l'espressione ottimale diapausa 16 e circa l'80% di umidità relativa.
    1. Programma un armadio per un 16L: luce 8D: ciclo scuro (un non-diapausa indurre LD fotoperiodo). Impostare il secondo armadio per 8L: 16D luce: ciclo scuro (diapausa indurre) 13.
    2. 'Luci' del programma contemporaneamente in entrambe le armadi per sincronizzare l'ora circadiano tra fotoperiodi.
  2. Calcolare la quantità di uova necessarie per eseguire l'esperimento. Obiettivo per 300-500 uova per gabbia. Almeno tre replicare gabbie diapausa e tre replicano gabbie non diapausa sono necessari per la produzione di RNA. Questo ammonta a circa il 1,800-3,000 uova per esperimento.
    1. Hatch le uova immergendo carte uovo in circa 500 ml di H 2 O. deionizzata
    2. Aggiungi <em> ca. 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e il gambero di salamoia come descritto in precedenza 24. Coprire il contenitore con rete, e mantenere la maglia in posizione con un elastico.
    3. Mettere nell'armadio LD fotoperiodo per circa 24 ore.
  3. Trasferimento larve schiuse a 10 x 10 x 2 cm Petri piatti pieni di ca. 90 ml di acqua deionizzata H 2 O.
    1. Mantenere ca. 30 larve per piatto. Trasferimento larve per pulire piatti ogni 48-72 ore, ad esempio ogni Lunedi, Mercoledì e Venerdì (MWF) 24.
    2. Alimentazione circa 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e artemie in acqua deionizzata ogni MWF come descritto in precedenza 24.
  4. Impostare 3-4 gabbie per adulti per ogni trattamento fotoperiodo, dove ogni gabbia comprende una replica biologica.
    1. Da bande opposte 9.5 L secchi, tagliare una 10-by-14 centimetri foro, e un altro foro di diametro 15 cm. Conel corso dei primi con rete. Tagliare circa un lunghezza di piede di una calza ortopedica, e incollate un'estremità intorno l'interno del foro.
    2. Tagliare l'estremità di piede della calza off e nodo arresto - aperto solo quando è necessario accedere all'interno della gabbia. Per il coperchio della gabbia, tagliare fuori tutto l'interno, lasciando solo il bordo, e sostituire la plastica interno con rete 24.
    3. Notare il fotoperiodo, replicare numero, data di inizio della gabbia, e altre informazioni pertinenti per l'esperimento con pennarello indelebile sul lato della gabbia.
  5. Foderare il fondo delle gabbie adulti con carta da filtro umida. Inumidire la carta da filtro con abbastanza deionizzata H 2 O per aumentare l'umidità locale nella gabbia, ma evitare acqua stagnante, che può stimolare ovideposizione sulla carta da filtro 24. Controllare la carta da filtro giornaliera per essiccamento, ri-bagnato quando necessario.
  6. Per produrre uova sufficienti per una libreria di RNA, comprende almeno 100 donne / 9.5 L cage, con non più di 500 zanzare per gabbia.
  7. Raccogliere pupe MWF e posto in una tazzina di H 2 O pulita con una densità di non oltre il 50 pupe per 25 ml di H 2 O. Trasferire la coppa pupe di una gabbia adulto. Posizionare gabbie nel rispettivo cabinet fotoperiodo - A. albopictus pupe sono fotosensibile 15.
  8. Assicurarsi quotidiana che H 2 O in tazze è pulito e chiaro, e rimuovere pupe morti, perché l'accumulo di pupe morta può causare la mortalità di massa. Rimuovere H 2 O tazze dopo tutti pupe emergono.
  9. Mettere uvetta organici sulla maglia superiore della gabbia di fornire zucchero per adulti emerse. Monitorare uvetta, e cambiarle ogni 3-5 giorni per evitare l'accumulo di muffe.

2. Manutenzione di adulti per consentire l'accoppiamento e Egg Production

  1. Mantenere gabbie a umidità elevata (circa. 80%) allineando il fondo della gabbia con una carta da filtro umida e fornire accesso a uva non-muffa, come descritto sopra (Sezioons 1.5 e 1.9).

3. si nutrono di sangue

  1. Preparatevi a femmine di sangue-alimentazione tra 2-6 giorni dopo eclosion per garantire che le femmine sono stati esposti ad almeno otto giorni prima della deposizione delle uova brevi inequivocabili inizia per quasi 100 uova% diapausa 14.
  2. Preparare il sistema di alimentazione Hemotek membrana. Collegare le unità di alimentazione alla presa di corrente. Regolare la temperatura di ciascuna unità di 37 ° C con la vite di regolazione. Utilizzare un termometro elettronico e sonda per misurare la temperatura del gruppo di alimentazione durante la calibrazione.
  3. Preparare il serbatoio pasto. Allungare un quadrato di membrana di collagene alimentazione sopra l'apertura del serbatoio pasto e fissarlo con un O-ring. Tirare con attenzione gli angoli per rimuovere le rughe; tagliare la membrana in eccesso con le forbici.
    NOTA: membrana collagene non può funzionare bene per tutte le specie di zanzara, e può essere necessario provare diversi tipi di trovare membrana ottimale se si lavora con unspecie diverse da A. albopictus. Parafilm funziona bene con Culex pipiens.
    1. Se il sangue è conservato congelato, scongelare a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di utilizzare.
    2. Tenere il serbatoio in modo che la membrana è rivolta verso il basso, e le porte di riempimento non supportati sono rivolti verso l'alto. Utilizzare una pipetta di trasferimento o una siringa per riempire il serbatoio con circa 3 ml di sangue intero da polli che ha citrato di sodio come anticoagulante. Sigillare porte di riempimento con tappi di plastica.
  4. Fissare il serbatoio preparata all'alimentatore avvitandolo sul perno sulla piastra di trasferimento di calore sul fondo dell'alimentatore. Invertire l'alimentatore e posizionarlo sulla parte superiore della gabbia, lato membrana verso il basso, in modo che le zanzare possono alimentare attraverso le maglie della gabbia. Tenere l'alimentatore sulla gabbia per circa 45 min per massimizzare alimentazione.

4. Stimolare Deposizione delle uova

  1. Quattro o cinque giorni dopo pasto di sangue, dotare ogni gabbia con un colore scuro 50 ml cup foderata con carta greggi germinazione dei semi (carta d'uovo) o il tovagliolo strutturato non sbiancata carta e riempire a metà con acqua deionizzata 9. Se più di 250 zanzare sono in una gabbia, utilizzare due tazze.
    NOTA: Per le piccole gabbie o fiale singolo femminile, "infuso fieno" in contenitori di deposizione delle uova può aumentare deposizione causa l'odore della flora microbica 25.

5. Raccogliere e deposito Uova

  1. Iniziare la raccolta delle uova entro 4-5 giorni di alimentazione sangue, perché la produzione di uova picchi tipicamente di circa cinque giorni dopo l'alimentazione di sangue, e poi scompare nel corso della settimana prossima.
  2. Variare frequenza di raccolta delle uova sulla necessità dell'esperimento. Per scopi generali, raccogliere documenti di uova su una pianificazione MWF. Rimuovere carte uovo da ogni gabbia e sostituirla con carta nuova. Posizionare i documenti rimossi di recente in piastre di Petri e conservare in cabinet fotoperiodo SD per evitare effetti confondenti di stoccaggio delle uova.
  3. Lasciare carte uovo di ri principale bagnato per 2 giorni dopo la deposizione delle uova per permettere la formazione sierosa cuticola, che aumenta la resistenza uovo essiccazione 26.
  4. Raccolta postale circa 48 ore, uova asciugare all'aria aperta. Essiccare la carta in modo che sia molle e leggermente umido al tatto, ma non così bagnato che la carta è scuro da H 2 O o stimola la schiusa delle uova.
    NOTA: A "x 4" carta 6.5 potrebbe richiedere circa 3,5 ore ad asciugare. Fare attenzione a non troppo secca carte d'uovo, in quanto questo si tradurrà in uovo essiccazione 27.
  5. Riserva uova aggiuntivi sia da LD e SD fotoperiodi per valutare l'incidenza diapausa e interpretano l'effetto photoperiodic (vedi Misurazione diapausa, sezione 6).
  6. Per la conservazione a lungo termine, tenere le carte d'uovo a 21 ° C e circa l'80% di umidità in piastre di Petri. Tenere piastre di Petri in un contenitore Tupperware con un pallone di acqua per mantenere l'umidità locale come lo sviluppo embrionale richiede 4-5 giorni a 21 ° C.
ove_title "> 6. Misura diapausa Incidenza

  1. Utilizzare ulteriori embrioni riservati (cfr Stimolare Deposizione delle uova, sezione 4) che sono 7-20 giorni per quantificare la risposta diapausa.
  2. Registrare il numero di uova presenti su ogni carta uovo.
  3. Stimolare le uova per schiudersi immergendo completamente carte uovo individuali in un piatto di 90 ml di Petri con circa 80 ml ​​di H 2 O. deionizzata Aggiungere circa 0,25 ml cibo liquami.
  4. Dopo 24 ore coincidere il numero di tratteggiata prima larve instar. Porre la capsula Petri su una superficie nera per visualizzare larve e posizionare una sorgente di luce su un lato del piatto. Le larve si allontanerà dalla fonte di luce, consentendo una chiara conteggio delle larve individuale. Rimuovere larve individuo con una pipetta, mentre il conteggio per evitare raccontare larve individuale.
  5. Carte Luogo d'uovo in una nuova piastra di Petri e ri-asciutto. Re-hatch uova dopo ~ 1 settimana e ancora coincidono uova schiuse utilizzando il metodo di cui sopra.
  6. Documenti Posizionare uovo con lo u rimanenti uova n-covato in nuovi 90 ml capsule di Petri con una soluzione sbiancante circa 80 ml ​​28. Assicurarsi che le carte di uova sono completamente immersi in soluzione sbiancante e lasciare sotto una cappa durante la notte per evitare l'odore di candeggina.
    NOTA: Bleaching soluzione può essere conservata per ~ 1 settimana a 4 ° C, ma dovrebbe tuttavia essere fatta fresca.
  7. Controllare le uova con un microscopio ottico come sbiancamento cancellerà il corion e permettere la visualizzazione di embrionate, uova non-covato. Se l'uovo è embrionate, l'uovo avrà un colore bianco sporco, con gli occhi che appaiono come due piccoli punti neri di fronte all'altro sul lato dorsale. Coincidere il numero di non-nati, uova embrionate 13.
  8. Determinare l'incidenza diapausa con la seguente formula:% diapausa = no. uova embrionate un-nati / (n. di uova schiuse + n. embrionate di uova non-covato) x 100 13.

7. RNA Estrazione da uova / pharate Larve

ONTENUTO "> NOTA: Uso Trizol in una cappa a flusso laminare.

  1. Uova di zanzara Brush contenenti embrioni in via di sviluppo o larve pharate in distinti momenti di sviluppo dalle carte a base di uova a macine di vetro con un pennello di peli di cammello. Macinare le uova in Trizol (1 ml per 50-100 mg di tessuto) fino a completo polverizzato. Utilizzare almeno 400 uova per biblioteca per produrre RNA sufficiente.
    1. In alternativa, far scattare le uova congelare in azoto liquido e conservati a -80 ° C in provette da microcentrifuga fino a un mese prima della macinazione, in Trizol.
  2. Eseguire l'estrazione di RNA in Trizol seguita da isopropanolo precipitazione secondo le istruzioni del produttore.
  3. Trattare panchina con soluzione RNase decontaminazione o altri agenti per rimuovere eventuali residui nucleasi per evitare la degradazione dell'RNA.
    1. Trattare l'RNA estratto con DNasi. Secondo le indicazioni del produttore, incubare i campioni di RNA con DNasi per 30 minuti a 37 ° C. Utilizzare 1 & #181; l DNasi fino a 10 mg di RNA in una reazione di 50 microlitri. Aumentare la quantità di DNasi se vi sono più di 10 mg di RNA in una reazione.
    2. Inattivare DNase aggiungendo 5 ml DNasi sospeso inattivazione reagente. Incubare 5 min a temperatura ambiente, mescolando tre volte durante il periodo di incubazione (vortex).
    3. Centrifugare a 10.000 g per 1.5 min. Trasferire il surnatante contenente i campioni di RNA trattati ai tubi freschi per fasi successive.
  4. Valutare la qualità dei campioni di RNA totale da fluorometria. Inviare i campioni ad un impianto di specialità con strumento adeguato per questo compito. L'impianto eseguirà elettroforesi su gel-chip per determinare le dimensioni delle specie di RNA nel campione, visualizzati da colorante fluorescente instillato nel chip. I risultati saranno restituiti come elettroferogramma.
    1. Determinare l'integrità dei campioni di RNA totale dalla presenza o l'assenza di prodotti di degradazione, come dimostra la presenza opicchi F tra le 18S e 5S ribosomiale picchi RNA sul dell'elettroferogramma risultante (Figura 1B).

8. RNA Sequencing

  1. Invia campioni di RNA totale con qualità sufficientemente elevata (Figura 1A) e quantità (generalmente> 3 mg per libreria) a un centro commerciale sequenziamento per la costruzione di librerie arricchiti accoppiato fascia mRNA mRNA e sequenziamento, seguendo protocolli standard.
  2. Se più di una corsia viene utilizzato per il sequenziamento di un singolo esperimento, dividere singole biblioteche in due corsie per il sequenziamento in funzione delle variazioni tecniche tra vicoli durante la sequenza.

9. lllumina Leggi Cleaning

NOTA: La Figura 2 riassume la parte bioinformatica di questo protocollo. Per un elenco completo di tutti i programmi e le risorse utilizzate nella sezione bioinformatica di questo protocollo, fare riferimento alla Tabella 1. InInoltre, File supplementare 1 contiene esempi riga di comando per ciascuna delle seguenti fasi di protocollo di bioinformatica.

  1. Utilizzare ssaha2 29 (Tabella 1) per identificare le partite di 95% di identità o superiore al database NCBI UniVec core (Tabella 1), A. albopictus sequenza rRNA (GenBank # L22060.1), e gli adattatori di sequenziamento (esempi dettagliata della riga di comando fornite in file supplementare 1). Rimuovere le coppie a capire con le partite utilizzando Perl o uno strumento di scripting simile, ad esempio adattando lo script Perl in dotazione (File supplementare 2).
  2. Pulire rimanendo legge con il pacchetto SolexaQA 30 (Tabella 1; Supplemental File 1): tagliare le regioni con un punteggio Phred equivalente di meno di 20 utilizzando le impostazioni predefinite di DynamicTrim.pl.
    1. Rimuovere legge più breve di 25 bp con LengthSort.pl sia in avanti e retromarcia legge simultaneamente. Valutare la qualità dei file puliti FASTQ con FastQC (Tabella 1

10. Digital Normalizzazione

  1. Effettuare un giro di normalizzazione digitale sul pulito legge utilizzando lo strumento khmer 31 (Tabella 1; Supplemental File 1), in particolare normalize-by-median.py (con dimensioni della k-mer 20, una copertura cut-off di 20, e x = 1e10).
  2. In alternativa, se una macchina ad alta RAM è disponibile (centinaia di GB), utilizzare lo script normalize_by_kmer_coverage.pl di Trinity (Tabella 1).

11. De Novo trascrittoma Assembly

  1. Ottenere accesso a un computer o un computer cluster con fino a 256 Gb di RAM e 24 CPU, a seconda delle dimensioni del gruppo.
  2. Utilizzare Trinity 32 (Tabella 1; File supplementare 1) per assemblare la lettura digitale normalizzato impostare in contigs. Per ridurrel'utilizzo della memoria, uso --min_kmer_cov 2.

12. Assemblea valutazione

  1. Eseguire assemblathon_stats.pl dal progetto Assemblathon2 33 sull'uscita contig Trinità. Questo script esegue i calcoli di base per affrontare la valutazione della qualità di assemblaggio, come il numero di ponteggi, N50, la composizione di assemblaggio, e più (Tabella 1; File supplementare 1).

13. Annotazione del trascrittoma Assemblato

  1. Eseguire BLASTX (Tabella 1) l'insieme contro una serie proteina di riferimento; per le zanzare, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti sono riferimenti adeguati. In particolare, formattare il file FASTA proteina di riferimento per esplosione, seguita da BLASTX (File supplementare 1).

14. Map Legge all'Assemblea Utilizzo RSEM 34 (Tabella 1)

  1. Creare un file 'trascrizione-to-gene-map', in cui laprima colonna contiene gli ID del gene di riferimento, e la seconda colonna della IDS contig. In un editor di fogli di calcolo, scambiare la prima e la seconda colonna della uscita BLASTX, e scrivere queste colonne in un file .txt. Utilizzare il programma per convertire linebreak interruzioni di riga nel file .txt risultante in formato Unix.
  2. Creare un set di dati di riferimento dal file FASTA trascrittoma utilizzando lo script rsem-preparare-riferimento, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1).
  3. Calcolare i valori di espressione separatamente per ciascuna libreria utilizzando il comando rsem-calcolo-espressione, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1). Come si legge, utilizzare i file abbinati FASTQ risultanti dal passo-lettura pulizia (punto 9.2).
    1. Se RNA da una replica biologico è stato diviso in due corsie per il sequenziamento, includere entrambi i file FASTQ nel calcolo dell'espressione per generare un unico file.
  4. Convertire i risultati di espressione di ogni libreria a una matrice facilmente trattati da altri programs utilizzando lo script rsem-generate-data-matrix forniti, forniti nella confezione RSEM (File supplementare 1).

15. Espressione Differential Analysis

  1. Installare R e levigabordi (Tabella 1).
  2. Utilizzare read.delim per caricare i risultati RSEM dal punto 14.3 (File supplementare 1). Se necessario, completano i conteggi al numero intero più vicino.
    NOTA: La guida Edger raccomanda di limitare il dataset di geni con abbastanza espressione elevata per rilevare significato.
  3. Per formattare i dati per edger, generare un oggetto DGEList dal file di dati caricati (File supplementare 1). Poi, normalizzare i dati utilizzando TMM normalizzazione (File supplementare 1). Stimare le dispersioni comuni e tagwise dei dati (File supplementare 1).
  4. Identificare geni differenzialmente espressi con un Benjamini-Hochberg corretto p-value <0.05 (File supplementare 1). Tracciare la distribuzione di log-fold-change vs. abbondanza (File supplementare 1).

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Representative Results

Fluorometria di due campioni di RNA rappresentativi mostrato due bande a circa 2.000 nt (Figura 1A, B). Il 28S insetti RNA ribosomiale è costituito da due catene polinucleotidiche tenuti insieme da legami di idrogeno, che sono facilmente interrotti da brevi riscaldamento o agenti che sconvolgono legami idrogeno 35. Le risultanti due componenti sono approssimativamente le stesse dimensioni del 18S RNA ribosomiale. Il secondo campione RNA mostrato elevati livelli di degrado (Figura 1B).

Trattamento photoperiodic di un gruppo rappresentativo di A. zanzare albopictus evidenziato un'elevata incidenza diapausa nelle zanzare-breve-day allevati, e bassa incidenza diapausa nelle zanzare-lunga giornata allevati, anche se c'era un po 'di variabilità tra le repliche (Tabella 2). Ad esempio, replicare SD2 mostra inferiore (80%) incidenza diapause rispetto alle restanti replicati (87.18% - 97.67%). Questa replica ha avuto anche il più piccolo sampl e dimensioni, quindi è consigliabile avere un numero sufficiente di uova (> 150) per la misura diapause per ottenere un risultato preciso.

Post-sequencing leggere pulizia su una libreria rappresentante adulto A. femmine albopictus rimosso un consistente numero di letture (da 83.853.322 a 52.736.065 totale legge per una biblioteca rappresentante). Normalizzazione Digital ulteriormente ridotto il numero di totale letture a 41.435.934. Un assemblaggio di queste letture Trinity generato 76.377 contig, con N50 di 1.879, lunghezza contig medio di 1,023.1, ed una lunghezza massima di 20.892 contig (Figura 3). Espressione differenziale analizza da un simile flusso di lavoro di embrioni allevati in condizioni-diapausa inducono a 11 e 21 giorni dopo la deposizione delle uova rivelato 3.128 geni differenzialmente espressi tra questi due periodi di tempo (Figura 4).

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Figura 1: fluorometria profili di esempio di alta qualità (A) e di bassa qualità (B) estrazioni di RNA da A. albopictus. L'asse x rappresenta le dimensioni dei frammenti nucleotidiche, e l'asse y rappresenta le letture fluorescenti. Notare la differenza nella scala y tra i pannelli (A) e (B). Le frecce indicano le posizioni dei diversi RNA ribosomiale. Le bande apparenti vicino alla band marcatore verde indicano il degrado.

Figura 2

Figura 2: Sintesi del flusso di lavoro di bioinformatica dalla preparazione leggere al differenziale espressione Ogni casella rappresenta un passo nella sezione bioinformatica di questo protocollo, accompagnato dal numero corrispondente di ogni fase del protocollo..


Figura 3:. Istogramma di lunghezze contig da una Trinità de novo montaggio trascrittoma La lunghezza media è 1,023.1 contig. Si noti che la distribuzione di lunghezze contig è fortemente sbilanciata verso contig più brevi; questo è tipico di de novo montaggio trascrittoma.

Figura 4
Figura 4: Log 2 -fold-variazione rispetto abbondanza di espressione genica TMM-normalizzato di diapausa pharate larve in 11 giorni contro 21 giorni dopo la deposizione delle uova Ogni punto indica un Unigene;. unigeni differentemente espressi sono in rosso. Unigeni con una maggiore espressione a 11 giorni dopo la deposizione delle uova hanno valori pieghevole cambiamento positivo, dovecome unigeni con una maggiore espressione di 21 giorni dopo la deposizione delle uova hanno valori pieghevole variazione negativa.

Programma / Risorsa URL del sito web (accessibile 2014/01/13)
perl http://www.perl.org/get.html
pitone http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec core ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Trinità http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Trinitàsceneggiatura normalizzazione http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 script di valutazione https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (che comprende makeblastdb e BLASTX) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
linebreak https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Guida per l'utente Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabella 1: programmi e le risorse utilizzate per tegli bioinformatica procedure in questo protocollo. gli URL di accedere facilmente ciascuna delle risorse necessarie in questo protocollo.

Trattamento Replicare Numero di uova dal 1 ° botola Numero di uova dal 2 botola No. embrionate, uova non schiuse % Diapausa
SD 1 10 0 68 87.18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97.67
SD 4 5 0 46 90.20
SD 5 6 0 79 92.94
LD 1 79 4 9 9.78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

Tabella 2:. Calcoli incidenza diapausa Risultati da cinque repliche per fotoperiodo di calcoli incidenza diapausa. Numero delle larve schiuse da due tratteggi separati sono inclusi, come lo sono il numero di uova embrionate, non-nati, che sono tutti necessari per calcolare l'incidenza diapausa.

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Discussion

Questo protocollo presenta i metodi per scoprire i geni differenzialmente espressi a causa photoperiodically diapausa indotta in A. albopictus. Il protocollo è significativo in quanto combina in modo unico allevamento di zanzare e di bioinformatica tecniche per rendere tutti gli aspetti sperimentali di un programma di fisiologia molecolare accessibile agli utenti alle prime armi - in particolare quelli incentrati sulla risposta diapausa photoperiodic. Metodi esistenti, a nostra conoscenza, non forniscono più dettagli nel protocollo allevamento - che spesso è necessario individuare gli errori di allevamento - né si forniscono informazioni sul design sperimentale durante la fase di allevamento che permettano l'analisi bioinformatica successo a valle. I metodi qui presentati sono stati ottimizzati per A. albopictus, in particolare i metodi di allevamento, che generalmente prendono sei settimane da una generazione di laboratorio a quella successiva. Tuttavia, in applicazioni future questo metodo potrebbe essere adattato con modestorettifiche di altre specie di zanzare che esibiscono diapausa photoperiodic 23. Inoltre, il disegno sperimentale generale e bioinformatica workflow sono applicabili allo studio di altri polyphenisms.

Diversi punti non descritti nel protocollo devono essere considerati quando allevamento A. albopictus larve. Primo, A. albopictus può essere trovato in una grande varietà di habitat contenitori naturali e artificiali, come descritto in precedenti lavori 36, 37. un sacco di pneumatici usati sono una fonte comune di larve per stabilire colonie di laboratorio. Popolazioni raccolti sopra 32N di latitudine in Nord America si può aspettare a mostrare una forte risposta diapausa 13. Il A. ceppo albopictus utilizzato in questo protocollo è stato raccolto da Manassas, VA, ed è stato allevato in un ambiente di laboratorio per più di otto generazioni prima di manipolazione sperimentale. In secondo luogo, l'illuminazione negli armadi fotoperiodo deve essere scelto con cura. Bulbi in armadicon funzioni di illuminazione incorporato può causare picchi di temperatura all'interno del cabinet quando l'illuminazione si accende o spegne. Osservazione aneddotica suggerisce questi picchi di temperatura possono compromettere la risposta diapausa. Per evitare questo, built-in funzioni di illuminazione deve essere disabilitato e armadi devono essere dotati di una lampadina fredda fluorescente a 4 watt. Terzo, larve sono sensibili a H 2 O e qualità alimentare abbondanza. Pertanto, oltre al seno può portare a un accumulo di batteri e mortalità larvale. In quarto luogo, ci sono metodi alternativi alla zanzare femmina sangue-feed adulti. Membrane di vetro sono un sistema alternativo membrana artificiale 38, 39, anche se il sistema HemoTek comporta meglio nell'esperienza degli autori. Animali vivi (di solito pollo o roditori) possono essere utilizzati anche 38 - in questo caso, è indispensabile per ottenere la prima certificazione appropriata in Animal Care and Use Committee Istituzionale (IACUC). In quinto luogo, anche se non vi è alcuna chiara evidenza pubblicata tha uova sono fotosensibili 15, osservazioni aneddotiche suggeriscono che le uova provenienti da un trattamento fotoperiodo mostra SD lievemente ridotta incidenza diapausa quando esposto a un fotoperiodo LD entro 10 giorni dalla deposizione delle uova. Così, memorizzare sia uova SD e LD in condizioni SD per produrre una risposta diapausa massima nelle uova SD e evitare effetti confondenti di fotoperiodo (SD vs LD) durante la conservazione delle uova.

L'alta qualità RNA è essenziale per la generazione di dati di RNA-Seq alta qualità. Abbondante cura deve essere assunto durante l'estrazione di RNA per evitare qualsiasi contaminazione nucleasi. Low campioni di RNA di qualità, come quello illustrato nella Figura 1B, non sono adatti per il sequenziamento. Valutare la qualità dell'RNA prima dell'invio dei campioni per il sequenziamento è imperativo. Bande caratteristiche di molecole di RNA potrebbero essere visibili diversi tipi di tessuto insetto utilizzati per l'estrazione di RNA, come le quattro bande di dimensioni inferiori 18S indicati nella RNA elettroferogramma alta qualitànella Figura 1A. Modelli coerenti di bande di RNA diversi dai due bande a 18S attraverso campioni sotto trattamenti biologici distinti indicano può fortemente che queste bande non derivano dal degrado, ma rappresentano la composizione biologica delle molecole di RNA nei tipi di tessuto specifiche scelte nel disegno sperimentale.

Il flusso di lavoro di bioinformatica qui delineato consente a un utente con una certa abilità da riga di comando e di script per ottenere un elenco di geni differenzialmente espressi da dati Illumina sequenziamento generati da librerie di RNA replicati da due contrastanti condizioni sperimentali. Mentre questo esempio riguarda geni differenzialmente espressi causa di fotoperiodo, questo flusso di lavoro può essere applicato a qualsiasi disegno sperimentale con due o più trattamenti, in ogni organismo. Ci sono molti altri modi per arrivare a una lista di geni espressi in modo differenziale; tuttavia, questo protocollo è probabile che sia l'approccio più semplice per l'utente inesperto. Altro exbioinformatici ingl potrebbero voler adottare misure supplementari per migliorare la contiguità e la ridondanza del loro assemblaggio. I biologi con poca o nessuna esperienza di bioinformatica possono anche completare almeno parte di questo gasdotto nel iPlant 40 Discovery Ambiente, che è un ambiente di analisi guidato grafica-interfaccia utente gratuito. E 'probabile che la funzionalità di iPlant crescerà più grande per il futuro, al fine di accogliere pieno RNA-Seq condotte da de novo assemblee trascrittoma. Infine, ricordiamo che la Guida per l'utente eccellente del discute a fondo i molti modi per utilizzare levigabordi 41 (Tabella 1) per l'analisi di espressione differenziale.

In alcuni casi, errori di assemblee possono generare contigs chimerici. Ci sono diversi metodi che possono aiutare a identificare questi errori di assemblee, per esempio, Uchime 42. Tuttavia, dalle esperienze passate, il numero di chimere rilevate è estremamente bassa (<0,1%); quindi, employinga programma di rilevazione chimera non può valere lo sforzo supplementare.

L'elaborazione ad alta velocità, i dati sequenziamento di prossima generazione richiede la capacità di 1) archiviare grandi quantità di dati (per un singolo progetto,> 500 Gb); 2) manipolare i file di grandi dimensioni che non possono essere aperti in word processor tradizionali o fogli di calcolo; 3) effettuare analisi che richiedono grandi quantità di RAM, ad esempio, per de novo di montaggio; e 4) analisi di grandi set di dati, sia attraverso programmi guidati da un'interfaccia a riga di comando (che richiede la capacità di installare questi programmi, che spesso non banale), oppure attraverso suite di analisi con interfacce grafiche (ad esempio Galaxy 43 o 40 iPlant ). I ricercatori con una certa competenza in linea di comando Unix e un linguaggio di scripting sarà ottenere il massimo beneficio da accesso a un cluster di calcolo locale - sia dell'Università di proprietà, tramite un collaboratore, o acquistato per il proprio laboratorio. Ad esempio, l'abflusso di lavoro ove è stato realizzato utilizzando un Macintosh di proprietà di laboratorio (12 core, 64 GB di RAM, disco rigido 1 TB), e un gruppo di computer dell'Università di proprietà per il montaggio Trinità. Se le risorse simili non sono disponibili, i ricercatori possono ancora girare a iPlant di effettuare analisi su larga scala a costo zero, e con relativamente minore investimento in formazione a causa dell'ambiente interfaccia grafica. Tuttavia, coloro che svolgono e interpretare le analisi ancora bisogno di capire i presupposti di ogni programma utilizzato.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

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Genetica , diapausa photoperiodic RNA-Seq allevamento di zanzare
Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em
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Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

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