Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961

Protocol

1. Larve stell av Two A. albopictus grupper til voksenlivet

  1. Satt to fotoperiode skap med programmerbar belysning ved 21 ° C for optimal Diapause uttrykk 16 og ca 80% relativ fuktighet.
    1. Program ett kabinett for en 16L: 8D lys: mørke syklus (en ikke-Diapause induserende LD fotoperiode). Still inn andre kabinett for en 8L: 16D lys: mørke syklus (Diapause induserende) 13.
    2. Programmets lysene på 'samtidig i begge skap for å synkronisere døgnrytmen tid mellom fotoperioder.
  2. Beregne mengden av egg som trengs for å utføre forsøket. Satse på 300-500 egg per bur. Minst tre replikere Diapause bur og tre replikere ikke-Diapause bur er nødvendig for RNA generasjon. Dette utgjør til ca 1,800-3,000 egg per eksperiment.
    1. Hatch eggene ved å senke egg papirer til ca. 500 ml avionisert H 2 O.
    2. Legg <em> ca. 1 ml mat slurry bestående av bakken hundemat og artemia som tidligere beskrevet 24. Dekk beholder med mesh, og holde mesh på plass med en gummistrikk.
    3. Plasser i LD daglengde kabinett for ca. 24 timer.
  3. Overføring klekket larver til 10 x 10 x 2 cm Petri retter fylt med ca. 90 ml avionisert H 2 O.
    1. Opprettholde ca. 30 larver per parabolen. Overføre larver å rengjøre retter hver 48-72 timer, for eksempel hver mandag, onsdag og fredag ​​(MWF) 24.
    2. Fôr ca. 1 ml mat slurry som består av bakken hundemat og artemia i avionisert vann hver MWF som tidligere beskrevet 24.
  4. Sett opp 03:57 voksne bur for hver daglengde behandling, der hvert bur består av en biologisk replikere.
    1. Fra motsatte sider av 9,5 L bøtter, kuttet ut en 10-ved-14 cm hull, og et annet hull med 15 cm diameter. Cover den første med mesh. Skjær omtrent en fots lengde av en ortopedisk strømpe, og lim ene enden rundt innsiden av det andre hullet.
    2. Skjær fotenden av strømpen av og knute stengt - åpen bare når tilgang til det indre av buret er nødvendig. For buret lokket, kuttet ut alt av interiøret, slik at bare rim, og erstatte den indre plast med mesh 24.
    3. Legg merke til daglengde, replikere nummer, bur startdato, og annen informasjon som er relevant for forsøket med permanent markør på siden av buret.
  5. Linje bunnen av de voksne bur med vått filter papir. Fukt filterpapiret med nok deionisert H2O for å øke lokal fuktighet i buret, men unngå stående vann, som kan stimulere egglegging på filterpapiret 24. Kontroller filterpapir daglig for tørking, re-vått når det er nødvendig.
  6. Å produsere nok egg for en RNA bibliotek, inkluderer minst 100 kvinner / 9.5 L cage, med ikke mer enn 500 mygg pr bur.
  7. Samle puppe MWF og plasser i en liten kopp av ren H 2 O med en tetthet på ikke mer enn 50 puppe per 25 ml H 2 O. Overfør puppe cup til en voksen buret. Plasser merdene i respektive daglengde kabinett - A. albopictus puppe er lysfølsomme 15.
  8. Sikre daglig at H 2 O i kopper er ren og klar, og fjerne døde puppe, fordi oppbygging av døde puppe kan forårsake massedødelighet. Fjern H 2 O kopper etter at alle puppe dukke opp.
  9. Plasser økologiske rosiner på toppen mesh av buret for å gi sukker for fremkom voksne. Overvåke rosiner, og endre dem hver 3-5 dager for å forhindre mugg opphopning.

2. Vedlikehold av voksne til Tillat Mating og Rognproduksjon

  1. Oppretthold bur ved høy luftfuktighet (ca. 80%) ved foring av buret bunnen med et fuktig filterpapir, og gir tilgang til ikke-mugne rosinene, som beskrevet ovenfor (sections 1.5 og 1.9).

3. Blood-fôring

  1. Forberede seg til blod-fôr kvinner mellom 05:58 dager etter eklosjonshormon for å sikre at kvinner har blitt utsatt for minst åtte entydige korte dager før egglegging begynner for nesten 100% Diapause egg 14.
  2. Forberede Hemotek Membrane Feeding system. Plugg fôring enhetene til strømforsyningen. Juster temperaturen til hver enhet til 37 ° C ved hjelp av justeringsskruen. Bruke et elektronisk termometer og sonden for å måle temperaturen til mateenheten under kalibrering.
  3. Forberede måltidet reservoaret. Strekke en firkant av kollagen fôring membran over åpningen av måltidet reservoaret og fest den med en O-ring. Trekke hjørnene for å fjerne rynker nøye; å klippe over membranen med en saks.
    MERK: Kollagen membranen kan ikke fungere godt for alle myggarter, og det kan være nødvendig å prøve flere typer å finne den optimale membran hvis arbeider med enandre enn A. arter albopictus. Parafilm fungerer godt med Culex pipiens.
    1. Dersom blod blir lagret i frossen tilstand tines ved romtemperatur i minst 1 time før bruk.
    2. Hold reservoaret så membranen vender ned, er ustøttede og for fylle portene vendt opp. Bruke en overførings pipette eller sprøyte for å fylle reservoaret med ca. 3 ml fullblod fra kyllinger som har natriumsitrat som en anti-koagulant. Forsegle fylle porter med plastplugger.
  4. Fest forberedt reservoaret til materen ved å skru den på bolten på varmeoverføring plate på bunnen av materen. Snu mater og plassere den på toppen av buret, membransiden ned, slik at myggen kan mates gjennom mesh av buret. Hold materen på buret i ca 45 min å maksimere fôring.

4. Stimulere egglegging

  1. Fire til fem dager etter blodmåltid, utstyre hvert bur med en mørk farget 50 ml copp foret med ubleket frøspiring papir (egg papir) eller strukturert ikke-bleket papir håndkle og fyll halvveis med avionisert vann 9. Hvis mer enn 250 mygg er i et bur, bruke to kopper.
    MERK: For små bur eller enkelt kvinnelige ampuller, kan "hay infusjon" i egglegging containere øke egglegging på grunn av lukt av den mikrobielle flora 25.

5. Samle og Store Egg

  1. Starte egg samling innen 4-5 dager etter blod fôring fordi eggproduksjon topper vanligvis cirka fem dager etter blod fôring, og deretter avtar i løpet av neste uke.
  2. Variere egg samling frekvens på nødvendigheter av eksperimentet. For generelle formål, samle egg papirer på en MWF tidsplan. Fjerne egg papirer fra hver merd og erstatte med nytt papir. Plassere nylig fjernet papirer i petriskåler og lagrer i SD daglengde skap for å unngå konfunderende effekter av egg lagring.
  3. Tillate egg papirer å re Hoved våt for to dager etter egglegging å tillate serøse cuticle formasjon, noe som øker egg uttørking motstand 26.
  4. Omtrent 48 timer etter innsamling, tørre egg i friluft. Tørk papiret slik at det er slapp og litt fuktig å ta på, men ikke så våt at papiret er mørkt fra H 2 O eller stimulerer klekking av egg.
    MERK: En 6.5 "x 4" papir kan ta ca 3,5 timer for å tørke. Vær forsiktig med å over tørr egg papirer, da dette vil resultere i egg uttørking 27.
  5. Reserve flere egg fra både LD og SD fotoperioder for å vurdere Diapause forekomst og tolke photoperiodic effekt (se Måle Diapause, seksjon 6).
  6. For langtidslagring, holde egg papirer ved 21 ° C og ca 80% fuktighet i petriskåler. Hold petriskåler i en Tupperware lagring container med en kolbe med vann for å opprettholde lokal fuktighet som embryoutvikling tar fire til fem dager ved 21 ° C.
ove_title "> 6. Mål Diapause Forekomst

  1. Bruke flere reserverte embryoer (se Stimulere egglegging, seksjon 4) som er 7-20 dager gamle til å kvantifisere Diapause respons.
  2. Registrere antall egg som er tilstede på hvert egg papir.
  3. Stimulere egg til å klekkes etter helt senke individuelle egg papirer i en 90 ml petriskål med ca 80 ml ​​avionisert H 2 O. Legg ca 0,25 ml mat slurry.
  4. Etter 24 timer telle antall skraverte første stadium larver. Plasser petriskål på en svart overflate for å visualisere larver og plassere en lyskilde på den ene siden av fatet. Larver vil bevege seg bort fra lyskilden, noe som åpner for en klar oversikt over enkelte larver. Fjerne enkelte larver med en pipette mens du teller for å hindre gjenforteller enkelte larver.
  5. Sted egg papirer i en ny petriskål og re-tørr. Re-luke egg etter ~ 1 uke og igjen telleapparat egg klekket bruker metoden ovenfor.
  6. Sted egg papirer med de resterende u n-klekket eggene i nye 90 ml petriskåler med ca 80 ml ​​bleking løsning 28. Sørg for at egg papirer er helt nedsenket i bleke løsningen og la under en avtrekkshette over natten for å unngå lukt av blekemiddel.
    MERK: Bleking løsning kan lagres for ~ 1 uke ved 4 ° C, men skal ellers gjøres frisk.
  7. Inspisere egg ved hjelp av et lysmikroskop som bleking vil fjerne chorion og tillate visualisering av embryonene, un-klekket egg. Når egget er embryon, vil egget har et off-white farge med øyne som opptrer som to små sorte prikker motsatt hverandre på ryggsiden. Telleapparat antall un-skraverte, embryon egg 13.
  8. Bestem Diapause forekomst med følgende formel:% Diapause = no. embryon un-klekket egg / (nr. klekket egg + no. embryon un-klekket egg) x 100 13.

7. RNA Utvinning fra egg / pharate Larver

ontent "> MERK: Bruk Trizol i en laminær hette.

  1. Brush mygg egg inneholder utviklings embryoer eller pharate larver på distinkte utvikling tidspunkter fra egg papirer til glass kverner ved hjelp av en kamel-hårbørste. Male egg i Trizol (1 ml per 50-100 mg vev) til det er helt pulverisert. Bruk minst 400 egg per biblioteket for å gi tilstrekkelig RNA.
    1. Alternativt knipse fryse egg i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i mikrosentrifugerør i opptil en måned før sliping i Trizol.
  2. Utføre RNA ekstraksjon i Trizol fulgt av isopropanol nedbør i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Behandl benk med RNase dekontaminering løsning eller andre midler for å fjerne eventuelle gjenværende nukleaser for å unngå RNA-degradering.
    1. Behandle den utpakkede RNA med DNase. Henhold til produsentens instruksjoner, inkuber RNA prøver med DNase i 30 min ved 37 ° C. Bruke en & #181; l DNase i opp til 10 ug av RNA i en 50 pl reaksjons. Øke mengden av DNase hvis det er mer enn 10 ug av RNA i en reaksjon.
    2. Inaktivere DNase ved tilsetning av 5 pl suspendert DNase inaktive reagens. Inkuber i 5 min ved værelsestemperatur, blandes tre ganger i løpet av inkubasjonsperioden (forsiktig virvling).
    3. Sentrifuger ved 10000 x g i 1,5 min. Overfør supernatanten inneholdende de behandlede RNA prøver til friske rør for etterfølgende trinn.
  4. Vurdere kvaliteten på de totale RNA prøver av fluorometri. Sende prøvene til en spesialitet anlegg med passende instrument for denne oppgaven. Anlegget vil utføre on-chip gel elektroforese for å bestemme størrelsen på RNA-arter i prøven, visualisert ved fluorescerende fargestoff innpodet i brikken. Resultatene vil bli returnert som en elektroferogrammet.
    1. Bestemme integriteten av det totale RNA prøver av nærvær eller fravær av nedbrytningsprodukter, som vist ved tilstedeværelsen of topper mellom 18S og 5S ribosomale RNA topper på den resulterende elektroferogrammet (Figur 1b).

8. RNA sekvense

  1. Send total RNA prøver med tilstrekkelig høy kvalitet (figur 1A) og mengde (vanligvis> 3 mikrogram per bibliotek) til en kommersiell sekvense senter for bygging av beriket parvise end mRNA biblioteker og mRNA sekvensering, følgende standardprotokoller.
  2. Hvis mer enn ett kjørefelt blir brukt for å sekvensere et enkelt eksperiment, delt individuelle bibliotekene i to baner for sekvensering å gjøre rede for teknisk variasjon blant baner under sekvensering.

9. lllumina Les Rengjøring

MERK: Figur 2 oppsummerer bioinformatikk del av denne protokollen. For en fullstendig liste over alle programmer og ressurser som brukes i bioinformatikk i denne protokollen, se tabell 1. Itillegg inneholder Supplemental File en kommandolinje eksempler for hver av følgende bioinformatikk protokolltrinn.

  1. Bruk ssaha2 29 (tabell 1) for å identifisere forekomster av 95% identitet eller høyere til NCBI UniVec Kjerne database (tabell 1), A. albopictus rRNA sekvens (GenBank # L22060.1), og sekvense adaptere (detaljert kommandolinje eksemplene i Supplemental Fil 1). Fjern lese par med kampene som bruker Perl eller en lignende scripting verktøyet, for eksempel ved å tilpasse den medfølgende Perl script (Supplemental Fil 2).
  2. Ren rester leser med SolexaQA pakke 30 (tabell 1; Opplysning Fil 1): trim regioner med en Phred poengsum tilsvarer mindre enn 20 bruker standardinnstillingene for DynamicTrim.pl.
    1. Fjern leser kortere enn 25 bp med LengthSort.pl på både forover og bakover leser samtidig. Vurdere kvaliteten på de rensede fastq filer med FastQC (tabell 1

10. Digital Normalisering

  1. Utføre en runde med digital normalisering på renset leser bruker khmer verktøy 31 (Tabell 1; Opplysning Fil 1), spesielt normalize-by-median.py (med k-mer størrelse 20, en dekning cut-off på 20, og x = 1e10).
  2. Alternativt, hvis en maskin med høy RAM er tilgjengelig (hundrevis av GBS), bruker Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl script (tabell 1).

11. De Novo transkriptomet Assembly

  1. Få tilgang til en datamaskin eller datamaskin klynge med opptil 256 GB med RAM og 24 CPUer, avhengig av størrelsen av forsamlingen.
  2. Bruk Trinity 32 (tabell 1; Opplysning Fil 1) for å montere den digitalt normalisert lese satt inn contigs. For å redusereminnebruk, bruke --min_kmer_cov to.

12. Montering Evaluering

  1. Kjør assemblathon_stats.pl fra Assemblathon2 prosjekt 33 på Trinity contig utgang. Dette skriptet utfører enkle beregninger som er relevante for å vurdere montering kvalitet, for eksempel antall av stillas, N50, montering sammensetning, og mer (tabell 1, Supplemental File 1).

13. Merknader til Assembled transkriptomet

  1. Utføre Blastx (tabell 1) av forsamlingen mot en referanseprotein sett; for mygg, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, og Aedes aegypti er egnede referanser. Spesifikt, formatere referanseproteinet fasta fil for blast, etterfulgt av blastx (Supplemental Fil 1).

14. Kart Leser til sammenstilling Bruke RSEM 34 (tabell 1)

  1. Lag en fil 'avskrift-til-gen-kart ", derFørste kolonne inneholder referanse genet IDer, og den andre kolonnen de contig IDer. I et regneark redaktør, bytte første og andre kolonner fra Blastx utgang, og skrive disse kolonnene til en .txt-fil. Bruk linebreak program for å konvertere linjeskift i den resulterende .txt-fil til Unix-format.
  2. Opprette en referanse datasett fra transkriptom fasta filen ved hjelp av rsem-forberede referanse manus, gitt i RSEM pakke (Supplemental Fil 1).
  3. Beregne uttrykket verdiene stilles inn separat for hvert bibliotek bruker rsem-calculate-uttrykk kommando, gitt i RSEM pakke (Supplemental Fil 1). Som leser, bruker de sammenkoblede fastq filer som følge av leserensetrinn (trinn 9.2).
    1. Hvis RNA fra en biologisk replikere ble delt i to baner for sekvensering, omfatter både fastq filer i uttrykket beregning for å generere en enkelt fil.
  4. Konvertere uttrykket resultatene fra hvert bibliotek til en matrise lett behandles av andre programs bruk av den medfølgende script rsem-generere-data-matrise, gitt i RSEM pakke (Supplemental Fil 1).

15. Differential Expression Analysis

  1. Installere R og Edger (tabell 1).
  2. Bruk read.delim å laste RSEM resultatene fra trinn 14.3 (Supplemental Fil 1). Om nødvendig, avrunder de teller til nærmeste heltall.
    MERK: edger guide anbefaler å begrense datasettet til gener med høy nok uttrykk for å oppdage betydning.
  3. Å formatere dataene for Edger, generere en DGEList objekt fra det belastede datafil (Supplemental Fil 1). Deretter normalisere data ved hjelp av TMM normalisering (Supplemental Fil 1). Anslå de vanlige og tagwise dispersjoner av data (Supplemental fil 1).
  4. Identifisere differensielt uttrykte gener med en Benjamini-Hochberg korrigert p-verdi <0,05 (Supplemental Fil 1). Plott fordelingen av log-fold-endring vs. overflod (Supplemental Fil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorometri av to representative RNA prøver viste to band på ca 2000 nt (figur 1A, B). Den insekt 28S ribosomalt RNA består av to polynukleotidkjedene holdes sammen av hydrogenbindinger, som er lett forstyrret av kort oppvarming eller agenter som forstyrrer hydrogenbindinger 35. De resulterende to komponenter er tilnærmet den samme størrelse som den 18S ribosomale RNA. Den andre RNA-prøve viste høye nivåer av nedbrytning (figur 1B).

Fotoperiodisk behandling av en representativ gruppe A. albopictus mygg resulterte i høy Diapause forekomst i kort-dagers-steilet mygg, og lav Diapause forekomst i lang-dagers-steilet mygg, selv om det var noe variasjon mellom replikater (tabell 2). For eksempel replikere SD2 viser lavere (80%) Diapause forekomst enn de gjenværende replikater (87,18% - 97,67%). Dette replikere hadde også den minste sampl e størrelsen, så det anbefales å sette av et tilstrekkelig antall egg (> 150) for Diapause måling for å få et nøyaktig resultat.

Post-sekvense lese rengjøring på én representant biblioteket fra voksen A. albopictus hunner fjernet et betydelig antall leser (fra 83.853.322 til 52.736.065 total leser for en representant bibliotek). Digital normalisering ytterligere redusert antall totale leser til 41435934. En Trinity montering av disse leser generert 76377 contigs, med en N50 av 1879, mener contig lengde på 1,023.1, og en maksimal contig lengde på 20 892 (figur 3). Differensial uttrykk analyser fra en lignende arbeidsflyt embryoer alet opp i henhold Diapause-induserende forholdene på 11 og 21 dager etter egglegging avslørt 3128 differensielt uttrykte gener mellom disse to tidsperioder (figur 4).

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>

Figur 1: fluorometri profiler av eksempel høy kvalitet (A) og lav kvalitet (B) RNA utdrag fra A. albopictus. X-aksen representerer størrelsen på nukleotid-fragmenter, og y-aksen representerer de fluorescerende opplesninger. Legg merke til forskjellen i den y-akseskalaen mellom panelene (A) og (B). Piler markerer posisjoner av de forskjellige ribosomale RNA. De tilsynelatende band nær grønn markør bandet indikere degradering.

Figur 2

Figur 2: Oppsummering av bioinformatikk arbeidsflyt fra lese forberedelse til differensial uttrykk Hver boks representerer et skritt i bioinformatikk i denne protokollen, ledsaget av tilsvarende antall hver protokoll trinn..


Figur 3:. Histogram av contig lengder fra en treenighet de novo transkriptom montering Den gjennomsnittlige contig lengde er 1,023.1. Legg merke til at fordelingen av contig lengder er tungt skjevt mot kortere contigs; dette er typisk for de novo transkriptom montering.

Figur 4
Figur 4: Logg 2 ganger-endring vs. overflod av TMM-normalisert genuttrykk av Diapause pharate larver på 11 dager vs. 21 dager etter egglegging Hvert punkt angir en unigene;. forskjellig uttrykt unigenes er i rødt. Unigenes med høyere uttrykk på 11 dager etter egglegging har positive fold-change verdier, hvorsom unigenes med høyere uttrykk 21 dager etter egglegging ha negative fold-change verdier.

Program / ​​Resource Website URL (åpnes 1/13/2014)
perl http://www.perl.org/get.html
python http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Kjerne ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Trinity http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Trinitynormalisering script http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon to evaluerings skript https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (som inkluderer makeblastdb og blastx) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
linebreak https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger Brukerveiledning http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabell 1: Programmer og ressurser brukes for than bioinformatikk prosedyrer i denne protokollen. URLer er oppført å enkelt få tilgang til hver av de ressursene som trengs i denne protokollen.

Behandling Replikere Antall egg fra 1. luke Antall egg fra 2. luke No. embryonene, unhatched egg % Diapause
SD 1 10 0 68 87,18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97,67
SD 4 5 0 46 90.20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9,78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

Tabell 2:. Diapause insidens beregninger Resultater fra fem replikater per daglengde av Diapause forekomst beregninger. Antall klekket larver fra to separate hatchings er inkludert, som er antall un-skraverte, embryon egg, som alle er nødvendige for å beregne Diapause forekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen presenterer metoder for å oppdage differensielt uttrykte gener grunn photoperiodically indusert Diapause i A. albopictus. Protokollen er betydelig ved at det kombinerer unikt mygg oppdrett og bioinformatikk teknikker for å gjøre alle eksperimentelle aspekter av en molekylær fysiologi program tilgjengelig for nybegynnere - spesielt for de som fokuserer på photoperiodic Diapause respons. Eksisterende metoder, til vår kunnskap, ikke gi så mange detaljer i oppfostringen protokollen - som ofte er nødvendig for å identifisere oppdretts feil - heller ikke de gir innsikt i eksperimentell design under stell scenen som vil gjøre det mulig vellykket bioinformatiske analyse nedstrøms. De metodene som presenteres her har blitt optimalisert for A. albopictus, spesielt oppdrettsmetoder, som vanligvis tar seks uker fra ett laboratorium generasjon til den neste. Men i fremtidige søknader denne metoden kan tilpasses med beskjedenjusteringer i andre myggarter som viser photoperiodic Diapause 23. Videre generell eksperimentell design og bioinformatikk arbeidsflyt gjelder for studiet av andre polyphenisms.

Flere punkter ikke er beskrevet i protokollen bør vurderes når oppdragelse A. albopictus larver. Først A. albopictus kan finnes i et bredt utvalg av naturlige og kunstige beholder habitat som beskrevet i foregående papirer 36, 37. brukt dekk masse er en vanlig kilde til larver for å etablere laboratorie kolonier. Populasjoner innsamlet over 32N breddegrad i Nord-Amerika kan forventes å vise en sterk Diapause respons 13. A. albopictus belastning brukes i denne protokollen ble samlet inn fra Manassas, VA, og ble oppdratt i et laboratorium setting for mer enn åtte generasjoner før eksperimentell manipulasjon. For det andre bør belysning i fotoperioden skap velges med omhu. Pærer i skapmed innebygd belysning funksjoner kan føre til temperatur toppene innenfor kabinettet når belysningen slås på eller av. Anekdotiske observasjoner tyder disse temperatur pigger kan forstyrre Diapause respons. For å unngå dette, bør innebygd lysfunksjoner deaktiveres og skap bør være utstyrt med en 4-watt kul-fluorescerende pære. For det tredje, larver er følsomme for H 2 O kvalitet og mat overflod. Derfor kan over-fôring føre til bakteriell akkumulering og larve dødelighet. Fjerde, det finnes alternative metoder til blod-fôr voksne hunnmyggen. Glass membraner er et alternativ kunstig membran system 38, 39, selv om den HemoTek systemet utfører bedre i forfatternes erfaring. Levende dyr (vanligvis kylling eller gnager) kan også brukes 38 - i dette tilfellet, er det viktig å først få riktig sertifisering fra din Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Femte, selv om det ikke er klare publisert bevis thpå egg er lysfølsomme 15, anekdotiske observasjoner tyder på at egg fra et SD daglengde behandling utstillings noe redusert Diapause forekomst når de utsettes for en LD fotoperiode innen 10 dager etter egglegging. Dermed lagre både SD og LD egg henhold SD forhold for å produsere en maksimal Diapause respons i SD egg og unngå confounding effekt av fotoperiode (SD vs LD) under egg lagring.

Høy RNA kvalitet er viktig for frembringelse av høy kvalitet RNA-Seq data. Rikelig forsiktighet bør tas i løpet av RNA ekstraksjon for å unngå enhver nukleasen forurensning. Lav kvalitet RNA prøver, slik som det som er vist i Figur 1B, er ikke egnet for sekvensering. Vurdere RNA kvalitet før du sender prøvene for sekvensering er viktig. Karakteristiske bånd av RNA-molekyler kan være synlige for forskjellige typer av insekt vev anvendt for RNA-ekstraksjon, som for eksempel de fire bånd som er mindre enn 18S vist i høykvalitets RNA elektroferogrammeti Figur 1A. Konsistente mønstre av RNA andre enn de to band på 18S tvers av prøvene under distinkte biologisk behandling band kan sterkt indikerer at disse bandene ikke fører fra degradering, men representerer biologiske sammensetningen av RNA-molekyler i de spesifikke vevstyper valgt i den eksperimentelle design.

Den bioinformatikk arbeidsflyten skissert her kan en bruker med noen kommandolinje og skript ferdigheter til å få en liste over differensielt uttrykte gener fra Illumina sekvense data generert fra replikert RNA biblioteker fra to kontrasterende eksperimentelle forhold. Mens dette eksempel er differensielt uttrykte gener på grunn av fotoperiode, kan dette arbeidsflyt kan anvendes på en hvilken som helst eksperimentell design med to eller flere behandlinger, i en hvilken som helst organisme. Det er mange andre måter å komme frem til en liste med forskjellig uttrykt gener; Men er denne protokollen sannsynlig å være den mest grei tilnærming for nybegynneren. Mer exerfares bioinformatikere kan være lurt å ta ekstra tiltak for å bedre contiguity og redundans av deres montering. Biologer med liten eller ingen bioinformatikk erfaring kan også gjennomføre minst en del av denne rørledningen innenfor iPlant 40 Discovery Environment, som er en gratis grafisk-brukergrensesnitt drevet analyse miljø. Det er sannsynlig at iPlant funksjonalitet vil vokse seg større i fremtiden for å imøtekomme fulle RNA-Seq rørledninger fra de novo transkriptom forsamlinger. Til slutt, merk at den utmerkede brukerhåndboken grundig drøfter mange måter å bruke edger 41 (tabell 1) for differensial uttrykk analyse.

I noen tilfeller kan mis-forsamlinger generere kimære contigs. Det er flere metoder som kan bidra til å identifisere disse mis heter, for eksempel, Uchime 42. Men fra tidligere erfaringer, er antall detekterte kimærer svært lavt (<0,1%); derfor employinga chimera deteksjon program kan ikke være verdt den ekstra innsatsen.

Behandling av høy gjennomstrømning, neste generasjons sekvense data krever evne til å 1) lagre store mengder data (for et enkelt prosjekt,> 500 Gb); 2) manipulere store datafiler som ikke kan åpnes i tradisjonelle tekstbehandlere eller regneark-programmer; 3) gjennomføre analyser som krever store mengder RAM, for eksempel for de novo forsamlingen; og 4) analysere store datasett, enten gjennom programmer drevet av et kommandolinjegrensesnitt (som krever evne til å installere disse programmene, som ofte ikke-trivielle), eller gjennom analyse suiter med grafiske brukergrensesnitt (f.eks Galaxy 43 eller iPlant 40 ). Forskere med noen ferdigheter i Unix kommandolinje og et skriptspråk vil få mest mulig nytte av tilgang til en lokal databehandling klynge - enten Universitetet eide, via en samarbeidspartner, eller kjøpes for deres eget laboratorium. For eksempel above arbeidsflyt ble oppnådd ved hjelp av et laboratorium eide Macintosh (12 kjerner, 64 GB RAM, 1 TB harddisk), og et universitet-eide dataklynge for Trinity montering. Dersom tilsvarende ressurser ikke er tilgjengelige, kan forskerne likevel slå til iPlant å utføre storskala analyser uten kostnad, og med relativt lavere investering i trening på grunn av det grafiske grensesnittet miljø. Men de som utfører og tolke analysene fortsatt trenger å forstå forutsetningene for hvert program som brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

Genetikk , photoperiodic Diapause RNA-Seq mygg oppdrett
En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter