Protocol
1. личинок Разведение двух А. albopictus Группы во взрослую жизнь
- Установите два Фотопериод шкафы с программируемым освещения на 21 ° C для оптимального выражения диапаузы 16 и примерно 80% относительной влажности.
- Программа один шкаф для 16L: 8D свет: темно цикл (без диапаузы вызывая LD фотопериод). Установите второй шкаф для 8L: 16D свет: темно цикл (диапаузы вынуждающего) 13.
- 'Огни на "программу в то же время в обоих шкафов для синхронизации циркадного времени между фотопериодов.
- Рассчитайте количество яиц, необходимых для проведения эксперимента. Стремитесь к 300-500 яиц в клетке. По крайней мере, трех повторных диапаузы клетки и трех повторных без диапаузы клетки необходимы для выработки РНК. Это составляет приблизительно до 1,800-3,000 яиц в эксперименте.
- Люк яйца путем погружения яиц бумаги в примерно 500 мл деионизированной H 2 O.
- Добавить <EM> прибл. 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок, как описано выше 24. Обложка контейнер с сеткой, и держать сетку в месте с резинкой.
- Место в LD светового дня шкафу в течение примерно 24 часов.
- Передача вылупившихся личинок до 10 х 10 х 2 см чашки Петри, заполненные приблизительно 90 мл деионизированной H 2 O.
- Поддерживать около 30 личинок на блюдо. Трансфер личинок чистую посуду каждый 48-72 ч, например, каждый понедельник, среду и пятницу (MWF) 24.
- Поток около 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок в деионизированной воде каждый MWF, как описано выше 24.
- Настройка 3:57 взрослых клеток для каждой обработки в течение светового дня, где каждый клетка содержит биологическую репликации.
- С противоположных сторон 9.5 л ведра, вырезать один 10-By-14 см отверстие, и другое отверстие диаметром 15 см. КомпанияVer первый с сеткой. Сокращение длины одной ноги ортопедического чулок, и приклейте один конец вокруг внутренней другое отверстие.
- Отрежьте конец ноги чулок выходные и узлов Шут - открыть только тогда, когда доступ внутрь клетки необходим. Для крышки клетки, вырезать все интерьере, оставив только обод, и заменить внутреннюю пластика с сеткой 24.
- Обратите внимание на фотопериод, повторить номер, клетки дату начала и другую информацию, относящуюся к эксперименту с перманентным маркером на стороне клетки.
- Линия нижней части взрослых клетках с влажной фильтровальной бумаге. Смочите фильтровальную бумагу с достаточно деионизированной H 2 O, чтобы увеличить местную влажность в клетке, но избежать стоячей воде, которые могут стимулировать яйцекладку на фильтровальной бумаге 24. Проверить фильтровальную бумагу в день в течение сушки, повторно мокрым, когда это необходимо.
- Для получения достаточных яйца РНК библиотеке, включают в себя, по меньшей мере 100 женщин / 9,5 л CaGE, с не более, чем 500 комаров в клетке.
- Сбор куколки МЧЗ и место в маленькой чашке чистой H 2 O при плотности не более 50 куколок на 25 мл H 2 O. Передача куколки чашку взрослого клетке. Место клеток в соответствующей светового дня кабинета - А. albopictus куколки светочувствительная 15.
- Убедитесь в день, что H 2 O в чашках чист и ясен, и удалить мертвые куколки, потому что наращивание мертвой куколки может привести к массовой гибели. Удалить H 2 O чашки после того как все куколки появляются.
- Поместите органических изюм на верхнем сетки клетку, чтобы обеспечить сахар для появившихся взрослых. Монитор изюм, и менять их каждые 3-5 дней для предотвращения накопления плесени.
2. Поддержание взрослых Разрешить спаривания и производства яиц
- Поддержание клеток при высокой влажности (прибл. 80%), выравнивая дно клетки с влажной фильтровальной бумагой, и обеспечивают доступ к не-плесенью изюма, как описано выше (SectiДополнения 1.5 и 1.9).
3. Кровь грудью
- Подготовка к крови кормовых женщин между 5:58 дней после вылупления, чтобы убедиться, что женщины были выставлены, по крайней мере восемь однозначных коротких дней, прежде чем яйцекладка начинается в течение почти 100 яиц% диапаузирующих 14.
- Подготовка системы кормления Hemotek мембраны. Подключите кормовых единиц на блок питания. Отрегулируйте температуру каждого блока до 37 ° С, используя регулировочный винт. Использование электронного термометра и зонда для измерения температуры блока питания во время калибровки.
- Подготовьте резервуар еды. Протяните квадрат коллаген подачи мембраны над отверстием резервуара еды и закрепите его с уплотнительным кольцом. Осторожно потяните углы, чтобы убрать морщины; обрезать лишний мембрану с ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген мембрана не может хорошо работать для всех видов комаров, и это может быть необходимо попробовать несколько видов, чтобы найти оптимальное мембрану при работе скроме А. видов albopictus. Парафильмом хорошо работает с Комар обыкновенный.- Если кровь хранили замороженной, оттепели при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед использованием.
- Держите резервуар так мембрана обращена вниз, без поддержки, и порты наполнении вверх. Использование передачи пипетки или шприца, чтобы заполнить резервуар с приблизительно 3 мл цельной крови от цыплят, который имеет цитрат натрия в качестве антикоагулянта. Печать отверстия для наполнения с пластиковыми заглушками.
- Прикрепите подготовленную резервуар для фидера, привинтив его шпильки на теплообменной пластины на нижней части питателя. Обратить подачи и поместите его на верхней части клетки, мембраны стороной вниз, так что комары могут питаться через сетку клетки. Держите устройство подачи на клетке в течение приблизительно 45 мин, чтобы максимизировать кормление.
4. Стимулировать откладки яиц
- Четыре-пять дней после еды в крови, оснастить каждую клетку с темного цвета 50 мл сдо выложены небеленой прорастания семян бумаги (бумаги яйцо) или текстурированной небеленый бумажным полотенцем и заполнить наполовину дистиллированной водой 9. Если более чем 250 комаров в клетке, используйте две чашки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких клетках или одного женского флаконах, "сено настой" в яйцекладки контейнеров может увеличиться откладки яиц из-за запаха микробной флоры 25.
5. Сбор и магазин Яйца
- Начать сбор яиц в течение 4-5 дней кормления крови, потому что производство яиц, как правило, пики примерно через пять дней после питания кровью, а затем спадает в течение следующей недели.
- Вары яйцо частоту сбора на предметы первой необходимости эксперимента. Для общих целей, собирать яйца документы по установленным расписанием MWF. Удалить из яиц документы из каждой клетки и замените свежим бумаги. Поместите недавно удаленные документы в чашках Петри и хранить в SD в течение светового дня шкафу, чтобы избежать смешанное воздействие хранения яиц.
- Разрешить яйцо документы повторно Основной влажными в течение 2 дней после яйцекладки, чтобы образование серозный кутикулы, которая повышает устойчивость яйцо усыхание 26.
- Примерно через 48 часов после сбора, сухие яйца на открытом воздухе. Высушите бумагу так, что она является мягким и слегка влажной на ощупь, но не настолько мокрой, что бумага темно от H 2 O или стимулирует вылупления яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: "х 4" бумага 6,5 может занять около 3,5 ч для просушки. Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно сухой яичный работ, так как это приведет в яичном высыхания 27. - Резервные дополнительные яйца от обоих LD и SD фотопериодов для оценки заболеваемости диапауза и интерпретировать фотопериодическую эффект (см Измерение диапаузы, раздел 6).
- Для длительного хранения, держать яйца с докладами на 21 ° C и приблизительно 80% влажности в чашках Петри. Хранить чашки Петри в контейнер для хранения Tupperware с колбу воды для поддержания местной влажности, как эмбриональное развитие происходит 4:56 дней при 21 ° С.
- Используйте дополнительные защищены эмбрионы (см Стимулировать откладки яиц, раздел 4), которые 7-20 дней для количественной оценки ответа диапауза.
- Запишите количество яиц, находящихся на каждое яйцо бумаги.
- Стимулировать яйца вылупиться, полностью погружая отдельные документы яйцо в чашку 90 мл Петри с приблизительно 80 мл деионизированной H 2 O. Добавьте примерно 0,25 мл пищевой кашицы.
- После 24 часов подсчитать количество вылупившихся первый личинок возрастной стадии. Поместите чашку Петри на черной поверхности, чтобы визуализировать личинок и поместить источник света на одной стороне тарелки. Личинки будут двигаться от источника света, что позволяет четкого подведения итогов индивидуального личинок. Удаление отдельных личинок с помощью пипетки, считая для предотвращения пересчета индивидуальный личинок.
- Место яйцо документы в новом чашку Петри и повторной сухой. Re-люк яйца после ~ 1 недели и снова подсчитать яйца вылупившихся используя данный метод.
- Место яйцо бумаги с оставшимся U н-вылупились яйца в новых 90 мл чашки Петри с приблизительно 80 мл отбеливающего раствора 28. Убедитесь, что яйцо документы полностью погружен в отбеливания решения и оставить под вытяжкой в течение ночи, чтобы избежать запаха хлорки.
Примечание: отбеливающий раствор может храниться в течение ~ 1 недели при 4 ° С, но в противном случае должны быть свежими. - Проверьте яйца с помощью светового микроскопа в качестве отбеливания будет ясно хориона и позволяют визуализировать с эмбрионами, ООН-вылупился яйца. Если яйцо эмбрионов и, яйцо будет иметь совсем белый цвет с глазами появляются как два маленьких черных точек друг напротив друга на спинной стороне. Tally количество не-вылупились, яйцах с эмбрионами 13.
- Определить частоту диапауза по следующей формуле:% диапаузы = нет. эмбрионом ООН-вылупившиеся яйца / (нет. вылупившиеся яйца + нет. эмбрионом ООН штриховкой яиц) х 100 13.
7. Экстракция РНК из яиц / pharate личинок
ontent "> Примечание: Используйте Trizol в капюшоне ламинарного потока.- Кисть комаров яйца, содержащие развивающихся эмбрионов или pharate личинок в различных точках времени разработки из яичного работ на стеклянные шлифовальных использованием верблюжьей шерсти. Измельчить яйца в TRIZOL (1 мл на 50-100 мг ткани) до полного измельчают. Используйте по крайней мере 400 яиц в библиотеку, чтобы дать достаточного количества РНК.
- Кроме того, оснастки заморозить яйца в жидком азоте и хранили при -80 ° С в микропробирок на срок до месяца перед помолом в TRIZOL.
- Выполните извлечение РНК в TRIZOL затем изопропанол осадков в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Лечить скамейки раствором РНКазы дезактивации или других агентов, чтобы удалить любые остаточные нуклеазы, чтобы избежать деградации РНК.
- Лечить извлеченный РНК с ДНКазы. В соответствии с инструкциями производителя, инкубировать образцов РНК с ДНКазы в течение 30 мин при 37 ° С. Используйте 1 & #181; л ДНКазы на срок до 10 мкг РНК в реакции 50 мкл. Увеличение количества ДНКазы, если есть больше, чем 10 мкг РНК в одной реакции.
- Деактивированы ДНКазы путем добавления 5 мкл приостановлено ДНКазную инактивации реагента. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре, смешивая три раза в течение инкубационного периода (нежным вортексе).
- Центрифуга при 10000 х г в течение 1,5 мин. Передача супернатант, содержащий обработанные образцы РНК свежие пробирки для последующих стадий.
- Оценка качества общего образцов РНК флуорометрии. Отправить образцы к специальности объекта с соответствующим инструментом для решения этой задачи. Объект будет выполнять гель-электрофореза на-чипе для определения численности видов РНК в образце, визуализированных флуоресцентным красителем привили в чипе. Результаты будут возвращены как electropherogram.
- Определить целостность общего образцов РНК в присутствии или в отсутствие продуктов распада, о чем свидетельствует наличие OF пиков между 18 и 5S рибосомных РНК пики на полученной electropherogram (рис 1b).
8. РНК Секвенирование
- Отправить общие образцы РНК с достаточно высоким качеством (рис 1а) и количества (обычно> 3 мкг на библиотеку) к коммерческой секвенирования центра для строительства, обогащенных парно-концевых библиотеках мРНК и мРНК последовательности, следующих стандартных протоколов.
- Если более чем одна полоса используется для секвенирования одного эксперимента, разделить отдельные библиотеки в две полосы для секвенирования для учета технического различий между полосами во время секвенирования.
9. lllumina Почитать очистки
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены биоинформатики часть этого протокола. Для получения полного списка всех программ и ресурсов, используемых в разделе биоинформатики этого протокола, обратитесь к таблице 1. ВКроме того, Справочная файла 1 содержит примеры командной строки для каждого из следующих шагов протокола биоинформатики.
- Используйте ssaha2 29 (таблица 1), чтобы определить матчи 95% идентичности или выше с базой данных NCBI Univec ядра (Таблица 1), А. albopictus рРНК (GenBank # L22060.1) и секвенирования адаптеры (примеры подробная командной строки, приведенные в Дополнительной файла 1). Удалить прочитанные пары с совпадений с использованием Perl или аналогичного инструмента сценариев, например, путем адаптации при условии Perl скрипт (Справочная файла 2).
- Удалите остатки читает с пакетом SolexaQA 30 (Таблица 1; Справочная файла 1): отделка области с PHRED оценка эквиваленте менее 20, используя настройки по умолчанию DynamicTrim.pl.
- Удалить читает меньше, чем 25 б.п. с LengthSort.pl на прямом и обратном читает одновременно. Оцените качество очищенных fastq файлов с FastQC (табл 1
10. Цифровой Нормализация
- Выполните один раунд цифровой нормализации на очищенную читает с помощью инструмента кхмерской 31 (таблица 1; Справочная файла 1), в частности, normalize-by-median.py (с использованием размера K-мерный 20, покрытия отсечку 20 и Х = 1e10).
- Кроме того, если машина с высокой памяти доступно (сотни ГБ), используйте normalize_by_kmer_coverage.pl сценарий Троицы (таблица 1).
11. De Novo Транскриптом Ассамблея
- Получить доступ к компьютеру или компьютерной кластера с до 256 Гб оперативной памяти и 24 процессоров, в зависимости от размера сборки.
- Используйте Троицы 32 (таблице 1; Справочная файла 1), чтобы собрать цифровой нормализованное чтения набор в контигов. Для сниженияиспользование памяти, использовать --min_kmer_cov 2.
12. Ассамблея Оценка
- Запустите assemblathon_stats.pl из проекта Assemblathon2 33 на выходе арендуемая Троицы. Этот сценарий выполняет основные вычисления, относящиеся к оценке качества сборки, такие как количество лесов, N50, монтаж композиции и более (табл 1; Справочная файла 1).
13. Аннотация собранного Транскриптом
- Выполнение BLASTX (таблица 1) узла с набором ссылка белка; для комаров, дрозофилы, Anopheles gambiae, Комар обыкновенный, и Комар желтолихорадочный подходящие ссылки. В частности, формат файла FastA ссылка белка за взрыв, а затем BLASTX (Справочная файла 1).
14. Карта Читает Ассамблее Использование RSEM 34 (Таблица 1)
- Создайте файл 'стенограмма к генной карте », в которомПервый столбец содержит идентификаторы контрольного гена, а вторая колонка арендуемая IDS. В табличном редакторе, поменяйте местами первый и второй столбцы из вывода BLASTX, и писать эти колонки в файл .txt. Используйте программу LineBreak преобразовать разрывы строк в результате .txt файла в формате Unix.
- Создайте эталонный набор данных из файла FastA транскрипций, используя rsem-подготовить справочную сценарий, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).
- Рассчитать значения выражения отдельно для каждой библиотеки, используя команду rsem просчитать-выражения, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1). Как гласит, использовать парные fastq файлов, полученный на стадии чтения очистки (этап 9.2).
- Если РНК из биологического репликации была разделена на две полосы для секвенирования, включают в себя как fastq файлов в расчете выражения для создания одного файла.
- Преобразование результатов выражение из каждой библиотеки к матрице легко обрабатывается другой рrograms с использованием предоставленного сценария rsem генерировать-DATA-матрицу, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).
15. Дифференциальная Анализ экспрессии
- Установите R и обрезки (таблица 1).
- Используйте read.delim загрузить результаты RSEM, начиная с шага 14,3 (Справочная файла 1). При необходимости, округлить счетчики до ближайшего целого числа.
ПРИМЕЧАНИЕ: руководство обрезки рекомендует ограничить набор данных генов с достаточно высокой экспрессии обнаружить значение. - Чтобы отформатировать данные для обрезки, формирования объекта DGEList из загруженного файла данных (Справочная файла 1). Затем, нормировать данные, используя ТММ нормализацию (Справочная файла 1). Оценить общие и tagwise дисперсии данных (Справочная файла 1).
- Определить дифференциально выраженные гены с Benjamini-Hochberg исправить значение р <0,05 (Справочная файла 1). Участок распределение лог-кратным-изменений по сравнению с обилием (Справочная файла 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Флуориметрии из двух репрезентативных образцов РНК показали две полосы примерно 2000 нуклеотидов (1А, В). 28S насекомых рибосомальной РНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, удерживаемых вместе водородными связями, которые легко разрушается при кратковременном нагревании или агентов, которые нарушают водородные связи 35. В результате два компонента примерно такого же размера, как рибосомной РНК 18S. Второй образец РНК показали высокие уровни деградации (фиг.1В).
Фотопериодическая лечение представительной группы А. albopictus комары привели к высокой заболеваемости диапаузы в краткосрочной день, выращенных комаров и низкой частотой диапаузы в долгосрочной день, выращенных комаров, несмотря на некоторый разброс между повторами (Таблица 2). Например, репликацию SD2 показывает (80%) диапауза частоту ниже, чем в остальных повторах (87,18% - 97,67%). Это Репликация также имели наименьший SAMPL е размер, поэтому рекомендуется отложить достаточное количество яиц (> 150) для измерения диапаузы, чтобы получить точный результат.
После секвенирования читать очистки по одному представителю библиотеки от взрослой А. albopictus женщины удалена значительное число операций чтения (из 83853322 по 52736065 Общее читает одного представителя библиотеки). Цифровой нормализация дальнейшее сокращение количество общей читает 41435934. Троица узел из них гласит генерируется 76377 контигов, с N50 от 1879, средняя арендуемая длиной 1,023.1, и максимальной длиной арендуемая из 20892 (рис 3). Дифференциальная экспрессия анализ с аналогичным процесса эмбрионов, выращенных в соответствии с диапаузирующих индуцирующего условиях при 11 и 21 дней после яйцекладки выявленных 3128 дифференциально экспрессированных генов между этими двумя временными периодами (фиг.4).
/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 1: флюорометрия профили, например, высокого качества (A) и низкого качества (B) РНК выписки из А. albopictus. X-ось представляет размеры фрагментов нуклеотидных и Y-ось представляет флуоресцентных измерений. Обратите внимание на разницу в масштабе Y-оси между панелями (А) и (В). Стрелками указаны положения различных рибосомных РНК. Кажущиеся полосы рядом с зеленым маркером группы указывают деградации.
Рисунок 2: Обзор рабочего процесса биоинформатики из прочитанного подготовки к дифференциальным выражением Каждая коробка представляет собой шаг в разделе биоинформатики этого протокола, в сопровождении соответствующего числа каждого шага протокола..
Рисунок 3:. Гистограмма арендуемая длиной от Троицы De Novo транскриптома сборки средняя длина арендуемая является 1,023.1. Обратите внимание, что распределение арендуемая длины серьезный перекос в сторону коротких контигов; это типично De Novo транскриптома сборки.
Рисунок 4: Войти 2-кратный-изменений по сравнению с обилием ТММ-нормированной экспрессии генов диапаузы pharate личинок 11 дней против 21 дней после яйцекладки Каждая точка обозначает Unigene;. дифференциально выраженные unigenes в красный цвет. Unigenes с высшим выражением на 11 дней после яйцекладки имеют положительные значения раскладной изменения, гдекак unigenes с высшим выражением 21 дней после яйцекладки иметь отрицательные значения раскладной изменений.
| Программа / ресурсов | Ссылка на сайт (доступ 1/13/2014) |
| Perl | http://www.perl.org/get.html |
| питон | http://www.python.org/download/ |
| ssaha2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI Univec Основные | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| Кхмерский | https://github.com/ged-lab/khmer |
| Троица | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| Троицанормализация сценарий | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| Assemblathon 2 сценариев оценки | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| BLAST + (которая включает в себя makeblastdb и BLASTX) | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| LINEBREAK | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| Руководство обрезки пользователя | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| R | http://www.r-project.org/ |
| Обрезки | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
Таблица 1: Программы и ресурсы, используемые для тон биоинформатики процедуры в этом протоколе. ссылки по легко получить доступ к каждому из ресурсов, необходимых в данном протоколе.
| Лечение | Копировать | Количество яиц с 1-го люка | Количество яиц, из 2-го люка | No. эмбрионами, невылупившиеся яйца | % Диапауза |
| SD | 1 | 10 | 0 | 68 | 87.18 |
| SD | 2 | 3 | 0 | 12 | 80.00 |
| SD | 3 | 1 | 0 | 42 | 97.67 |
| SD | 4 | 5 | 0 | 46 | 90.20 |
| SD | 5 | 6 | 0 | 79 | 92.94 |
| LD | 1 | 79 | 4 | 9 | 9.78 |
| LD | 2 | 28 | 0 | 4 | 12.50 |
| LD | 3 | 92 | 1 | 6 | 6.06 |
| LD | 4 | 30 | 0 | 5 | 14.29 |
| LD | 5 | 43 | 0 | 3 | 6,52 |
Таблица 2:. Диапауза расчеты заболеваемости Результаты от пяти повторов в фотопериоде расчетов заболеваемости диапаузы. Число вылупившихся личинок из двух отдельных штриховкой включены, как и число программ ООН, штриховки, яйцах с эмбрионами, все из которых необходимы для подсчета случаев диапауза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет методы, чтобы обнаружить дифференциально выраженные гены из-за photoperiodically индуцированной диапаузы в А. albopictus. Протокол имеет важное значение в том, что она уникально сочетает в себе комаров воспитание и методы биоинформатики, чтобы сделать все экспериментальные аспекты молекулярной программы физиологии, доступной для начинающих пользователей - в частности для тех, сосредоточив внимание на фотопериодическом ответ диапаузы. Существующие методы, насколько нам известно, не обеспечивает как много деталь в протоколе выращивания - что часто бывает необходимо определить Разведение ошибки - они не дают возможность судить о опытно-конструкторских во время стадии выращивания, которые позволят успешно биоинформационного анализ вниз по течению. Методы, представленные здесь, были оптимизированы для А. albopictus, особенно методы выращивания, которые обычно принимают за шесть недель от одного поколения лабораторию для следующей. Тем не менее, в будущих приложениях этот метод может быть адаптирован с скромнеекорректировки других видов комаров, которые обладают фотопериодическую диапаузы 23. Кроме того, общее опытно-конструкторских и биоинформатики рабочий применимы к изучению других polyphenisms.
Несколько точек детально не в протоколе должны быть учтены при выращивании A. albopictus личинки. Во-первых, А. albopictus можно найти в самых разнообразных природных и искусственных сред обитания контейнерных, как описано в предыдущих работах 36, 37. изношенной шины лотов общим источником личинок для установления лабораторных колоний. Популяции, собранные выше 32N широты в Северной Америке можно ожидать проявляют сильную реакцию диапауза 13. А. albopictus штамм, используемый в данном протоколе была собрана из Манассас, штат Вирджиния, и был воспитан в лабораторных условиях в течение более восьми поколений, предшествующих экспериментальных манипуляций. Во-вторых, освещение в фотопериода шкафов должны быть выбраны с осторожностью. Луковицы в шкафахс встроенным освещением функций может привести к температуры шипы в шкафу, когда освещение включается или выключается. Рассказы наблюдение предполагает, эти температурные скачки могут нарушить ответ диапауза. Чтобы предотвратить это, встроенным освещением функций должны быть отключены и шкафы должны быть оснащены 4-ваттной охлаждения люминесцентной лампы,. В-третьих, личинки чувствительны к H 2 O качества и пищевой изобилии. Таким образом, за кормление может привести к бактериальной накопления и смертности личинок. В-четвертых, существуют альтернативные методы в крови кормить взрослых самок комаров. Стеклянные мембраны альтернативой искусственным мембранная система 38, 39, хотя система HemoTek работает лучше в опыте авторов. Живые животные (как правило, курица или грызунов) также могут быть использованы 38 - в этом случае, важно, чтобы сначала получить соответствующую сертификацию от вашего Уходу за животными и использованию комитета (IACUC). В-пятых, хотя нет никаких четких опубликованных данных йна яйца светочувствительная 15, анекдотические наблюдения показывают, что яйца от экспоната лечения фотопериод SD немного снижается заболеваемость диапауза при воздействии LD светового дня в течение 10 дней яйцекладки. Таким образом, хранить и SD и LD яйца в условиях SD для получения максимального ответа диапаузы яиц SD и избежать ошибочных выводов по результатам фотопериода (SD vs. LD) во время хранения яиц.
Высокое качество РНК является существенным для генерации РНК-Seq данных высокого качества. Обильные следует позаботиться во время экстракции РНК, чтобы избежать загрязнения нуклеазную. Образцы РНК с низким качеством, например, как показано на фиг.1В, не подходят для секвенирования. Оценка качества РНК перед отправкой образцов для секвенирования является обязательным условием. Характерные полосы молекул РНК может быть открыты для различных типов ткани насекомых, используемых для выделения РНК, таких как четырех полос меньше, чем 18S, показанных на высококачественной РНК electropherogramна фиг.1А. Последовательные образцы, кроме двух полос на всей 18S образцов при различных биологических обработок РНК полос может сильно указывают, что эти полосы не приводит к деградации, но представляют биологическую состав молекул РНК в специфических типах тканей, выбранных в экспериментальной конструкции.
Рабочий биоинформатики описанный здесь позволяет пользователю с некоторыми из командной строки и сценариев навыков, чтобы получить список дифференциально выраженных генов из данных Illumina секвенирования, полученных от тиражируемых библиотек РНК из двух противоположных условий эксперимента. Хотя этот пример относится гены дифференциально выраженные в связи с фотопериода, этот рабочий процесс может быть применен к любой эксперимента с двумя или более обработок в любом организме. Есть много других способов, чтобы прибыть на список дифференциально выраженных генов; Однако, этот протокол может быть самый простой подход для начинающего пользователя. Более эксслучившихся bioinformaticians можете принять дополнительные меры по улучшению примыкание и избыточность их сборки. Биологи, практически не биоинформатики опыт может также выполнить по крайней мере часть этого газопровода в рамках iPlant 40 Discovery окружающей среды, которая является бесплатный графический пользователя интерфейс среды приводом анализ. Вполне вероятно, что функциональность iPlant будет расти больше в будущем для того, чтобы вместить полный РНК-Seq трубопроводы от De Novo транскриптом сборок. Наконец, отметим, что руководство отличный пользователя тщательно рассматриваются многие способы использования обрезки 41 (таблица 1) для дифференциального анализа экспрессии.
В некоторых случаях, неправильное сборки могут получения химерных контигов. Есть несколько способов, которые могут помочь выявить эти MIS-узлов, например, Uchime 42. Тем не менее, из прошлого опыта, число обнаруженных химер очень низка (<0,1%); Поэтому, employinга программа химера обнаружения не может быть стоит дополнительных усилий.
Обработка высокой пропускной следующего поколения секвенирования данных требует способности к 1) хранить большие объемы данных (для одного проекта,> 500 Гб); 2) работать с крупными файлами данных, которые не могут быть открыты в традиционных текстовых процессоров или электронных таблиц программ; 3) выполнить анализ, требуют большого количества оперативной памяти, например, для де Ново собраний; и 4) анализировать большие массивы данных, либо с помощью программ, управляемых через интерфейс командной строки (которая требует возможность установки этих программ, которые зачастую нетривиальная), или с помощью анализа люксы с графическим интерфейсом пользователя (например, Galaxy 43 или iPlant 40 ). Исследователи с какой-то владения Unix командной строке и скриптовый язык будет получить максимальную выгоду от доступа к локальной вычислительного кластера - либо университет собственности, через сотрудника, или купить их собственной лаборатории. Например, ABОве рабочий осуществляли с использованием лабораторного собственности Macintosh (12 ядер, 64 Гб оперативной памяти, 1 Тб жесткий диск), и университет принадлежащего вычислительный кластер для сборки Троицы. Если подобные ресурсы не доступны, исследователи могут еще обратиться к iPlant выполнять крупномасштабные анализы без затрат, так и с относительно низкой инвестиций в обучении за счет графического интерфейса среды. Тем не менее, те, кто выполняет и интерпретации анализов еще нужно понять предположения каждой программы используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
- Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
- Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
- Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
- Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
- Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
- Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
- Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
- Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
- Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
- Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
- Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
- Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
- Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
- Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
- Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
- Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
- Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
- Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
- Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
- Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
- Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
- Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
- Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
- Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
- Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
- Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
- Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
- Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
- Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
- Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
- Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
- Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
- Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
- Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
- Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
