Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

الهجرة الخلية هي ظاهرة البيولوجية التي تشارك في عدد كبير من الفسيولوجية، مثل التئام الجروح والاستجابات المناعية، والعمليات الفيزيولوجية المرضية، مثل السرطان. فحص الهجرة مصفوفة 3D الكولاجين هو أداة مرنة لتحليل خصائص المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا داخل في مثل الفسيولوجية للبيئة 3D.

Abstract

القدرة على الهجرة هي السمة المميزة لمختلف أنواع الخلايا ويلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، والاستجابات المناعية. ومع ذلك، الهجرة الخلية هي أيضا آلية رئيسية في سرطان تمكين هذه الخلايا السرطانية تنفصل عن الورم الرئيسي لبدء الانتشار النقيلي. خلال السنوات الماضية وقد وضعت مختلف المقايسات الهجرة الخلية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا. لأن السلوك الحركي الخلايا تختلف بشكل ملحوظ بين ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) بيئة يمكن افتراض أن تحليل هجرة الخلايا التي هي جزء لا يتجزأ ضمن بيئة 3D سيحقق في الهجرة الخلية أكثر أهمية البيانات. ميزة لل3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة وصفها هي أن الخلايا هي جزء لا يتجزأ ضمن شبكة 3D الفسيولوجية للألياف الكولاجين التي تمثل عنصرا رئيسيا في المصفوفة خارج الخلية. نظرا ليتم قياس الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة السماح تحديد العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية / الكريات البيضاء، والخلايا الجذعية، والخلايا السرطانية. وبالمثل، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ أيضا مجموعات الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في شعرية الكولاجين. نستنتج أن 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة هي طريقة تنوعا لتحليل هجرة الخلايا في بيئة 3D الفسيولوجية مثل.

Introduction

مثل انصهار الخلية (لمحة عامة نرى 1،2) الهجرة الخلية هي ظاهرة بيولوجية أخرى التي تشارك في عدد كبير من العمليات الفسيولوجية بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح والاستجابات المناعية (للمراجعة رؤية 3). ومع ذلك، فإن القدرة على الهجرة هي أيضا شرط أساسي لخلايا الورم إلى metastasize (للمراجعة نرى 3،4).

الهجرة الخلية هي عملية معقدة، غير مفهومة تماما العملية التي يتم من إخراج التفاعل بين عدة مسارات نقل الإشارة التي بدأها مختلف يجند (على سبيل المثال، السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو والهرمونات ومكونات المصفوفة خارج الخلية) مستقبلات (مثل مستقبلات التيروزين كيناز، مستقبلات chemokine، integrins) التفاعلات 5 مما تسبب في نهاية المطاف إعادة تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين مع ما يصاحب ذلك اجتثاث وإعادة التجميع المجمعات التصاق التنسيق وإنتغرين بوساطة إشارات 6.

وقد تم تطوير ق = "jove_content"> تحليل الهجرة الخلية عدة في المختبر والمجراة المقايسات الهجرة خلية في العقود الماضية، بما في ذلك فحص غرفة بويدن / transwell 7، الصفر فحص / فحص 8-10 التئام الجروح، ثلاثي الأبعاد ( 3D) الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11 وكذلك حيوي داخلي التصوير / المجهري (للمراجعة نرى 12). كل من هذه المقايسات الهجرة الخلية لديه إيجابيات وسلبيات، على سبيل المثال، بشأن التكاليف والحاجة لمعدات والمناولة أو موثوقية البيانات التي تم الحصول عليها.

كل من غرفة بويدن / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح الفحص سهلة ومنخفضة التكلفة وفحوصات متطورة لقياس الهجرة الخلية في المختبر 7-10. في غرفة بويدن / والمصنف transwell خلايا فحص على رأس لإدراج تحتوي على مسام (حوالي 8 ميكرون في القطر) - ما يسمى المقصورة العلوية 7. اختياري، يمكن أن تكون مغلفة مع إدراج متر خارج الخليةمكونات ATRIX، على سبيل المثال، فبرونيكتين، والكولاجين وغيرها، لتحاكي بيئة أكثر الفسيولوجية. وبالمثل، يمكن زراعة الخلايا البطانية فوق إدراج، وبالتالي محاكاة حاجز الخلايا البطانية 13. تلك الخلايا التي مرت من خلال المسام خلال فترة زمنية محددة في أقل مقصورة إيواء وسائل الإعلام والمكملات الغذائية، مثل عوامل النمو وكيموكينات، وتستخدم باعتبارها من قراءة لقياس الهجرة الخلية (أو التسرب).

في مقايسة خدش / هي المصنفة التئام الجروح فحص خلايا في لوحات، ونمت لconfluency 10. في اعتماد لوحات تجريبية يمكن وضع ما قبل المغلفة مع مكونات المصفوفة خارج الخلية، مثل فبرونيكتين. بعد إنشاء نقطة الصفر / الجرح عن طريق كشط الخلايا وحيدة الخلية أحادي الطبقة من كل جانب من الصفر / الجرح يمكن أن تهاجر إلى الفجوة، وبالتالي ملء / 10 فإنه شفاء. يتم تحديد المسافة بين الجانبين من الصفر / الجروحفي الاعتماد من الوقت ويستخدم كأساس التدريجي قراءة لنشاط الهجرة من الخلايا 10. ومع ذلك، للتمييز بين تكاثر الخلايا (التي يمكن أن يؤدي أيضا إلى ملء / الشفاء من الصفر / الجرح) وهجرة الخلايا فمن المستحسن أن الجمع بين الفحص مع مرور الزمن المجهري الفيديو وحيدة الخلية تتبع 10.

ومع ذلك، فإن كلا من غرفة بويدن / transwell فحص والصفر فحص / فحص التئام الجروح، والكمال بدلا بشأن بيئة الخلوية الفسيولوجية مثل. في غرفة بويدن / فحص خلايا transwell يجب أن تهاجر من خلال المسام البلاستيك، في حين أنه في نقطة الصفر هي المصنفة فحص / فحص خلايا التئام الجروح على مغلفة مسبقا لوحة من البلاستيك ثنائية الأبعاد. وبالمثل، فمن المسلم به جيدا أن سلوك الهجرة يختلف بشكل ملحوظ بين بيئة ثنائية الأبعاد 3D و3. على سبيل المثال، التصاقات ثلاثي الأبعاد مصفوفة من الخلايا الليفية تختلف من الالتصاقات البؤرية وييفي تتميز على اثنينركائز الابعاد في محتواها من α5β1 وintegrins αvβ3، paxillin، مكونات هيكل الخلية الأخرى، والتيروزين الفسفرة من الالتصاق البؤري كيناز 14. وبالمثل، كما عرض جزءا لا يتجزأ من الخلايا في بيئة 3D سلوك الهجرة غيرت 15. وبالتالي لتحليل الهجرة الخلية بشكل أكثر دقة ينصح فحص الهجرة السماح لقياس هجرة الخلايا واحد ضمن بيئة الفسيولوجية أو تشبه الفسيولوجية-3D.

حيوي داخلي التصوير / المجهري هو الذهب القياسية لقياس الهجرة الخلية في سياق الفسيولوجية 3D. هذا لا ينتمي فقط إلى خارج الخلية التفاعلات خلية مصفوفة، ولكن أيضا إلى التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا البطانية تسرب خلال 16 أو الاتجار اللمفاويات ضمن العقدة الليمفاوية 17، والتي، حتى الآن، هو ممكن نظرا ل تحسين تقنيات مضان المجهري، مثل 2 الفوتونمتحد البؤر المجهر الليزر، واستخدام الأصباغ الفلورية الحيوية وسلالات الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المشتقات 12،16،17. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع حيوي داخلي التصوير / المجهري مع خلية تتبع اليدوي والآلي 18. ومع ذلك، بسبب الحاجة ل2 الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر وكذلك الحيوانات (والنماذج الحيوانية المعدلة وراثيا المناسبة) حيوي داخلي التصوير / المجهري هو أسلوب بدلا كثيفة التكلفة.

للتغلب على القيود المفروضة على بويدن غرفة / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح فحص وتحليل الهجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D تم تطوير 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11،19. وبالتالي، يتم تضمين الخلايا المهاجرة ضمن شبكة ألياف الكولاجين 3D، والذي يشبه إلى المزيد من المجراة الوضع. سوية، بسبب ضيق الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة يقاس السماح للdetermiأمة من العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية وكريات الدم البيضاء 11،20، الجذعية المكونة للدم / الخلايا الاصلية 21-24، والخلايا السرطانية 5،25-29. بالإضافة إلى خلايا مفردة أو مجموعات الخلية أيضا يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في الكولاجين شعرية 30،31.

يعرض هذا البروتوكول لمحة عامة عن تقنية بسيطة، ولكنها قوية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D - طريقة في المختبر العائد في النتائج التي هي قريبة من الوضع في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد دوائر الهجرة

  1. إعداد هلام شمع البارافين / النفط (1: 1) قد ذاب المزيج والحرارة حتى يصبح الخليط. باستخدام فرشاة الطلاء ورسم 2-3 طبقات من هلام شمع البارافين / النفط (1: 1) خلط في منتصف شريحة زجاجية وفقا لأرقام 1B-1D.
    ملاحظة: نحن نستخدم الشرائح الزجاجية المشتركة (76 × 26 × 1.0-1.5 ملم (W / D / H))
  2. تطبيق شمع البارافين / هلام البترول مزيج ذاب بسرعة على الشريحة الزجاجية لتجنب تصلب أثناء الرسم. ضمان هلام طبقة شمع البارافين / البترول حوالي 2-2.5 سم طولا و 0.3-0.5 سم في العرض. يجب أن يكون سمك طبقة هلام شمع البارافين / البترول حوالي 0.1-0.15 سم.
  3. إضافة ساترة للشمع البارافين طدت / مزيج هلام البترول وختم ذلك مع 2-3 طبقات البارافين مزيج هلام الشمع / البترول (أرقام 1E، 1F). استخدام 4-8 دوائر الهجرة لتجربة الهجرة الخلية المشتركة. غرف مكان الهجرة طن وضع رأسي في رفوف.

2. إعداد الكولاجين مزيج تعليق خلية

  1. الحصاد (على سبيل المثال، مع 0.25٪ التربسين / EDTA) وعدد الخلايا من الفائدة. resuspend الخلايا في وسائل الإعلام كاملة تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) والمضادات الحيوية والمكملات الغذائية الموصى بها. 4-8 إعداد 1.5 مل أنابيب رد فعل و 20 ميكرولتر تعليق الخلية التي تحتوي على 4-6 × 10 4 خلايا (يعتمد على العدد الكلي للخلايا على نوع من الخلايا لتحليلها) وملء تصل إلى 50 ميكرولتر مع وسائل الإعلام كاملة.
    ملاحظة: مركبات إضافية (مثل عوامل النمو، كيموكينات، مثبطات، الخ) تضاف إلى تعليق الخلية. استخدام الحلول الأسهم المناسبة مثل أن الحجم النهائي من تعليق خلية لا يتجاوز 50 ميكرولتر.
  2. إعداد المبلغ الإجمالي من 452 ميكرولتر تعليق الكولاجين النهائي لأربع تجارب الهجرة الخلية. إضافة 50 ميكرولتر MEM 10X (درجة الحموضة 5،1-5،5) و 27 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم (درجة الحموضة 9،0-9،5) إلى أنبوب 1.5 مل رد فعل وتخلط جيدا. مراقبة بدوره اللون الأصفر البرتقالي من حل لالمكثفة الأرجواني (درجة الحموضة 9،0-9،5). إضافة تعليق الكولاجين 375 ميكرولتر السائل إلى 10X MEM / بيكربونات الصوديوم حل وتخلط جيدا. الرقم الهيدروجيني للتعليق الكولاجين النهائي يجب أن يكون حوالي 7.5 (المشار إليها بواسطة اللون الأرجواني الفاتح).
    ملاحظة: التحقق من درجة الحموضة من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني حوالي 7.5 مكان الحل بيكربونات الصوديوم مع الغطاء مفتوحا في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) ويتم المشبعة مع CO 2 وزيادة درجة الحموضة (حوالي 9،0-9،5). درجة الحموضة من الكولاجين مزيج تعليق خلية هو أمر حاسم لاستقرار الشبكة الكولاجين. إذا كانت منخفضة جدا شعرية الكولاجين سينهار خلال تجربة الهجرة الخلية.
    ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، استخدام الكولاجين السائل (درجة الحموضة 1،9-2،2) من هند الأبقار (2،9-3،3 ملغ / مل الكولاجين، 95٪ نوع الكولاجين الأول، 5٪ الكولاجين النوع الرابع). أمثلة على بروتوكولات إعداد شعرية المزيد من الكولاجين باستخدامنوع الكولاجين أنا من مصادر أخرى، مثل الخنازير أو الفئران، ترد في 32،33. لا تغيير على حجم الحلول المستخدمة حيث سيؤدي ذلك إلى تغيير تركيز الكولاجين النهائي من 1.67 ملغ / مل من شعرية. وهناك تركيز أعلى أو أدنى الكولاجين له تأثير على كثافة ألياف الكولاجين ومتوسط ​​المسافة بينهما مصاحبة مع الخلايا سلوك الهجرة 34.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الكولاجين النهائي إلى 50 ميكرولتر تعليق خلية ومزيج thoroughly.The تعليق الكولاجين النهائي (1.67 ملغ / مل الكولاجين) هو لزج قليلا. لنقل المبلغ الصحيح (100 ميكرولتر)، ماصة الحل الكولاجين النهائي مرة واحدة صعودا وهبوطا قبل نقله إلى تعليق الخلية.
    ملاحظة: عندما يتم الجمع بين الكولاجين مزيج تعليق خلية مع 10X MEM / بيكربونات الصوديوم حل وتغيرت قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 ألياف الكولاجين تبدأ على الفور في بلمرة.
  4. نقل مزيج الكولاجين تعليق خلية النهائي من عشرأنابيب رد فعل ه إلى غرف الهجرة. بلطف استفادة الغرفة الهجرة لتوزيع بالتساوي مزيج الكولاجين خلية تعليق على الجزء السفلي من الغرفة الهجرة (الشكل 1H). وضع دوائر الهجرة في وضع رأسي في رفوف واحتضان لمدة حوالي 30 دقيقة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) للسماح البلمرة من ألياف الكولاجين.
  5. لاحظ أن الكولاجين شعرية بلمرة هي عكر قليلا ولكن لا يزال يجري ضوء اللون الأرجواني. تملأ غرف الهجرة مع المتوسطة كاملة أو متوسطة الكامل مع ملاحق من الفوائد وختم الغرفة الهجرة مع هلام شمع البارافين / النفط مزيج (أرقام 1I، 1J).

3. تسجيل وتحليل الهجرة الخلية

يصف هذا القسم تسجيل هجرة الخلية الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو وتحليل الهجرة الخلية اليدوي تتبع الخلية.

  1. التبديل على المجهر وهيئة التعليم العالي مرحلة المجهرثالثا. ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الهدف 10X. وضع غرفة الهجرة تحت المجهر والتركيز حوالي 50 خلية أو أكثر في مجال الرؤية.
  2. الهجرة الخلية قياسية في وضع الوقت الفاصل باستخدام كاميرا متعددة تطبيق برنامج المراقبة بالفيديو. حفظ الأفلام الهجرة الخلية في شكل مناسب، على سبيل المثال، "*. افي" أو "* وسائل التحقق". ربط ملفات الأفلام الهجرة الخلية إلى قاعدة بيانات تحتوي على معلومات داعمة، مثل نوع من الخلايا والظروف التجريبية.
    ملاحظة: نحن تسجيل الخلايا الليمفاوية وHSPCs لمدة تصل إلى 2 ساعة باستخدام عامل الوقت الفاصل بين 1:80، مما يعني أن 0.75 ثانية في الوقت الفاصل بين يساوي 1 دقيقة في الوقت الحقيقي. الخلايا السرطانية هي خلايا تتحرك ببطء، وهكذا سجلت لمدة 16 ساعة على الأقل باستخدام عامل الوقت الفاصل بين 1: 1،800 (0.5 ثانية في الوقت الفاصل بين يساوي 15 دقيقة في الوقت الحقيقي).
  3. تحليل الأفلام الهجرة الخلية باستخدام تطبيق البرمجيات تتبع الخلية المناسبة، مثل الإضافات يماغيج البرمجيات(وتعطى لمحة عامة في 18). للاطلاع على تحليل غير متحيز فإنه من الأهمية الحاسمة أن الخلايا سيتم اختيارها عشوائيا دون علم ما إذا كانت الخلايا المهاجرة هي نشطة أم لا.
    ملاحظة: نحن نستخدم تطبيق البرمجيات الذاتي المتقدمة يدويا تتبع مسارات لا يقل عن 30 خلايا لكل تجربة باتباع خلايا تتحرك بدقة مع مؤشر الماوس (الذي يتوضع إلى النواة). في حين تتبع، ويتم تحديد إحداثيات س ص للخلايا تتبع تلقائيا وفقا لاستخدام وضع مرور الزمن. الخلايا الليمفاوية ليتم تحديد / HSPCs XY-إحداثيات كل 0.75 ثانية (يساوي 1 دقيقة الحقيقي)، في حين أن للخلايا السرطانية يتم تحديد XY-إحداثيات كل 0.5 ثانية (يساوي 15 دقيقة الحقيقي).
  4. تحديد ما مجموعه 60 س ص إحداثيات لكل خلية لتجربة الهجرة الخلية نموذجية. هذا يساوي 1 ساعة الوقت الحقيقي للاللمفاويات / HSPCs و 15 ساعة في الوقت الحقيقي لخلايا الورم. أ "،" يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك بين TWس نقاط الوقت، في حين أن "القيمة العددية" يشير إلى المسافة في "بكسل" انتقلت خلية بين 2 نقطة الساعة (الشكل 2A).
    ملاحظة: يتطلب تتبع خلية يدوي الخبرة. خاصة الخلايا المهاجرة بسرعة يصعب تتبع وكل نوع من الخلايا المعرض سلوك المهاجرة المتميزة التي قد يكون سببها عوامل تستكمل. في حالة انقسام الخلايا في حين تتبع، واختيار عشوائي خلية واحدة ابنة لمواصلة تتبع. الخلايا التي تهاجر من مجال البصر أو الموت في حين تتبع ليست مهملة، ولكنها تعتبر لتحليلها.

تحليل البيانات 4.

  1. تحليل بيانات تتبع الخلية باستخدام تطبيق البرامج المناسبة، على سبيل المثال، برنامج جدول بيانات.
    1. تحليل بيانات تتبع الخلية عن طريق نسخ خلية تتبع البيانات الخام (الشكل 2A)، في قالب جدول الذاتي المصممة. مضاعفة مجموع "القيم العددية"، التي تمثلالمسافة الإجمالية قد هاجروا زنزانة مع عامل التصحيح لتحويل "بكسل" إلى "ميكرون".
    2. تحديد معلمتين الهجرة الخلية: النشاط الحركي (أي ما يعادل معدل الهجرة) ووقت حركة نشطة (أرقام 2C، 2D).
    3. تحديد الخلايا التي هاجروا أقل من 25 ميكرون (مستوى عتبة للحد من عدد الخلايا إيجابية كاذبة) وخلايا غير متحركة. استبدال "القيم العددية" هذه الخلايا مع "".
      ملاحظة: "النشاط الحركي" (أو معدل الهجرة) معلمة تمثل النسبة المئوية للخلايا من السكان خلية تتبع التي انتقلت بين نقطتين الوقت (الشكل 2D). يتم تعريف "القيمة العددية" كما خلية تتحرك، في حين "،" يعرف باسم خلية غير متحركة. المعلمة "الوقت من حركة نشطة" (بالتوقيت النشطة) يمثل نسبة مئوية من إجمالي الوقت قد هاجر خلية في إعادةlation إلى الإطار الزمني للفترة المراقبة (الشكل 2C). أ "القيمة العددية" تشير إلى أن خلية انتقلت، في حين "،" يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك. يتم استخدام هذه المعلمة أيضا على تحديد عدد الخلايا التي لم تتحرك.
  2. حساب الدلالة الإحصائية وعرض بيانات الهجرة الخلية.
    1. حساب الدلالة الإحصائية للنشاط الحركي يعني من الخلايا (معدل الهجرة) باستخدام اختبار مان ويتني U. النظر ف قيمة <0.05 مهمة.
    2. عرض النشاط الحركي يعني من الخلايا كما XY-الرسم البياني، BoxPlot الرسم، أو رسم تخطيطي شريط الرسم البياني. عرض البيانات القائمة على خلية واحدة، مثل الوقت من حركة نشطة أو السرعة، ورسم تخطيطي شريط الرسم البياني أو الرسم البياني.
      ملاحظة: إذا لم يتضمن تطبيق برنامج جداول البيانات المختارة مخطط أو رسم بياني الرسم البياني أداة BoxPlot يجب إجراء البحث على الانترنت لتبحث عن مناسبة توtorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

و3D-الكولاجين فحص الهجرة مصفوفة تستخدم جنبا إلى جنب مع الوقت الفاصل الفيديو المجهري وتتبع الخلية بمساعدة الكمبيوتر يسمح لتحديد مختلف المعايير الهجرة الخلية بما في ذلك المعلمة القائمة على السكان (على سبيل المثال، يعني النشاط الحركي) والمعلمات القائم على خلية واحدة (على سبيل المثال، وقت حركة نشطة، السرعة والمسافة هاجر). يتم إعطاء مثال على مجموعات بيانات تتبع الخلية التي تم الحصول عليها، وتجهيز البيانات وعرض البيانات في الشكل 2. خلية تتبع ملف البيانات تشبه الجدول (الشكل 2A). كل عمود لتقف على خلية واحدة تتبع، حيث لكل تجربة الهجرة الخلية يتم تعقب 30 خلية. الصفوف تحتوي على معلومات عما إذا كان قد تحرك خلية أو ليس بين نقطتين الوقت. انتقلت مجموع "القيم العددية"، تمثل المسافة في "بكسل" خلية بين نقطتين الوقت، هي المسافة الإجمالية قد هاجرت هذه الخلية. يتم ضرب من قبل ميلانعامل orrection لتحويل "بكسل" إلى "ميكرون". وتعرف الخلايا التي هاجروا أقل من 25 ميكرون كخلايا غير تتحرك للحد من عدد الخلايا إيجابية كاذبة. يتم حساب سرعة (ميكرون / دقيقة) من كل خلية بقسمة "المسافة الإجمالية هاجر" ب "إجمالي الوقت (دقيقة) من فترة المراقبة".

لوصف السلوك الحركي الخلايا تستخدم عادة معلمتين. النشاط الحركي (الشكل 2D) يمثل النشاط الحركي (أو معدل الهجرة) يعني من السكان خلية تحليلها، في حين أن وقت الحركة النشطة (الشكل 2C) يمثل الوقت الكلي قد هاجر خلية ضمن فترة المراقبة. يستخدم المعلمة الأخيرة أيضا على تحديد عدد الخلايا التي لم تتحرك. ويعزى السبب لاستخدام معلمتين الهجرة خلية للتحليل إلى حقيقة أن النشاط الحركي من الخلايا يمكن أن يكون سببها احآليات الإقليم الشمالي. هناك ثلاثة احتمالات كيف، على سبيل المثال، وهو عامل النمو، ويمكن أن "حمل" الهجرة الخلية: أ) بالمقارنة مع السيطرة المزيد من الخلايا يهاجرون، ب) لم يتغير عدد الخلايا في الانتقال بالمقارنة مع السيطرة، ولكن عامل النمو تعامل خلايا تظهر وقت زيادة حركة نشطة، مما يعني أن هذه الخلايا سوف تهاجر لفترة أطول، وج) مجموعة من أ) و ب).

الرسم البياني في الشكل 2B تخطيطي يوضح كيفية حساب النشاط ووقت تحركي حركة نشطة. في هذا المثال يتم عرض الأنشطة المهاجرة من 120 الخلايا (التي تساوي أربعة تجارب مستقلة). يشير كل الماس أن خلية انتقلت بين نقطتين على الأقل مرة (بغض النظر عن المسافة قد هاجروا الخلية!). تم إضافة خطوط رمادية لهذا المخطط لإظهار أن السكان تحليل الخلايا يتكون من خلايا تتحرك وغير متحركة. المعلمة "locomالنشاط otory "يمثل النشاط الحركي من السكان خلية تحليلها في اعتماد كل نقطة زمنية (الشكل 2D). على سبيل المثال، النشاط الحركي من 10٪ في تي = 5 ساعة يشير إلى أن بين ر = 4.45 ساعة و t = 5 ساعة تحركت 10٪ من الخلايا تحليلها. عند عرضها باعتبارها XY-الرسم على النشاط تحركي المعلمة يشير إلى ديناميكية السكان خلية تحليلها. إمكانية أخرى لعرض النشاط الحركي للسكان الخلية المخطط BoxPlot (الشكل 2F).

ويرتبط المعلمة "الوقت من حركة نشطة" (بالتوقيت النشطة) إلى الوقت الإجمالي انتقلت خلية أثناء فترة المراقبة، حيث وقت نشط "0" يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك (الشكل 2C). الوقت نشط في الخلايا يمكن عرضها كما رسم بياني.

تفاعل EGFR / HER2 / PLC-γ1 وHER2 / HER3 / PI3K إشارات يساهم فيالنمط الظاهري المهاجرة من EGFR / HER2 / HER3 الثدي إيجابي الخلايا السرطانية 25. مطلوب PI3K إشارات لجيل من الفوسفاتيديل-3،4،5-trisphosphate (PIP3)، الذي يعمل بمثابة مرساة لجزيء PLC-1، وبالتالي تجنيد هذا الإنزيم إلى غشاء البلازما ليتم تفعيلها من خلال تحركات مستقبلات التيروزين 35. أدى تحفيز MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) خلايا سرطان الثدي فقط EGFR إيجابية في المدى الطويل PLC-γ1 يصاحب ذلك التيروزين الفسفرة مع IP3 المستدام ومستويات إنتاج مديرية الشؤون الجغرافية التذبذبات الكالسيوم الجيبية 27. على النقيض من ذلك، EGFR / HER2 MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) خلايا سرطان الثدي الإيجابية عرض التذبذبات الكالسيوم عابرة الأساسية بعد العلاج EGF بسبب المدى القصير تفعيل التيروزين PLC-γ1 وIP3 المدى القصير ومديرية الشؤون الجغرافية دوران 27 تشير ارتبط هذا التعبير HER2 إلى فرق حركية PLC-γ1 والإشارات.

تحليل السلوك المهاجرة من MDA-HER2 وMDA-Nكشفت EO سرطان الثدي خطوط الخلايا أن كلا من خطوط الخلايا أظهرت نشاط مماثل تحركي العفوي (MDA-HER2: 23،0-28،9٪، متوسط: 26.7٪ مقابل MDA-NEO: 19،3-24،4٪، متوسط: 21.5٪، أرقام 3A-3D ). الوقت المعلمة نشط، وهو ما يمثل وقت حركة نشطة من الخلايا واحد فيما يتعلق فترة الملاحظة، كشفت عن وجود عدد أكبر قليلا من خلايا تتحرك بشكل عفوي MDA-HER2 (64٪، الشكل 3E) بالمقارنة مع خلايا سرطان الثدي MDA-الأجسام القريبة من الأرض ( 53٪، الشكل 3F). التحفيز مع 100 نانوغرام / مل EGF أدى إلى زيادة كبيرة في النشاط الحركي كل من خطوط الخلايا. النشاط المهاجرة من EGF تعامل رفع MDA-HER2 إلى 30،4-35،2٪ (متوسط ​​33.7٪، أرقام 3A، 3C)، الذي ينسب إلى كل من زيادة عدد خلايا تتحرك (100 نانوغرام / مل EGF: 81٪ مقابل التحكم: 64٪)، والوقت زيادة الحركة النشطة. على سبيل المثال، كمية من الخلايا MDA-HER2 اظهار وقت نشط من 40٪ كانارتفعت من 20٪ (السيطرة) إلى 28٪ (100 نانوغرام / مل EGF). تم الحصول على بيانات مشابهة للخلايا MDA الجدد سرطان الثدي، والتي تم زيادة النشاط الهجرة إلى 25،2-35،2 (متوسط ​​30.4٪، أرقام 3B، 3D) على التحفيز صندوق تعديل العولمة الأوروبي. سوية، المزيد من الخلايا MDA الجدد هاجرت ردا على التحفيز EGF (100 نانوغرام / مل EGF: 66٪ مقابل التحكم: 53٪) وعرض الوقت تحول النمط النشط (الشكل 3F). على سبيل المثال، تمت زيادة كمية خلايا امتلاك الوقت نشط بشكل ملحوظ من 60٪ إلى 30٪ في وجود صندوق تعديل العولمة الأوروبي بالمقارنة مع الخلايا MDA-الأجسام القريبة من الأرض غير المعالجة (13٪).

أسفرت علاج MDA-HER2 وخلايا سرطان الثدي MDA-الأجسام القريبة من الأرض مع PLC-γ1 المانع U73122 في تثبيط كلا من الهجرة العفوية وEGF يسببها الخلايا (الشكل 3A-D). ومع ذلك، بالمقارنة مع خلايا سرطان الثدي MDA-الأجسام القريبة من الأرض كان تأثير كابح من U73122 على الهجرة العفوية الخلايا MDA-HER2 بدلا المعتدل، ولكن مع ذلككبيرة (التحكم: 23،0-28،9٪، متوسط: 26.7٪ مقابل 2 ميكرومتر U73122: 17،8-21،5٪، متوسط: 20.0٪، الشكل 3C). تحليل الوقت المعلمة نشط كشف كمية زيادة طفيفة من خلايا تتحرك في غير وجود U73122 (التحكم: 36٪ مقابل 2 ميكرومتر U73122: 48٪، الشكل 3E). وبالمثل، منعت العلاج U73122 صندوق تعديل العولمة الأوروبي بفعل الهجرة من MDA-HER2 خلايا سرطان الثدي (100 نانوغرام / مل EGF: 30،4-35،2٪، 33.7٪ مقابل متوسط ​​100 نانوغرام / مل EGF + 2 ميكرومتر U73122: 19،3-24،1٪، 22.6 متوسط ٪، الشكل 3C). وفقا لU73122 فقط تعامل الخلايا MDA-HER2 وبدلا عزا هذا التأثير المثبط لزيادة كمية من الخلايا غير متحركة، لكن ليس على النمط النشط الوقت غيرت (الشكل 3C). في الواقع، كان تحولا طفيفا نحو الساعة المتزايد للحركة نشطة في اكتشاف الخلايا المهاجرة MDA-HER2 يعالجون مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي وU73122 (الشكل 3C).

على النقيض من ذلك، أسفرت علاج الخلايا MDA-الأجسام القريبة من الأرض مع 2 ميكرومتر U73122 في انخفاض ملحوظ النشاط الحركي 5.6٪ إلى 10.7٪ (الوسيط: 9.3٪، الشكل 3F) الذي يعزى في المقام الأول إلى زيادة كمية غير تتحرك الخلايا (التحكم: 47٪ مقابل 2 ميكرومتر U73122: 79٪، الشكل 3F). وبالمثل، تم حظر الهجرة EGF الناجم عن خلايا سرطان الثدي MDA-الأجسام القريبة من الأرض بشكل ملحوظ من قبل U73122 إلى 1،1-7،4٪ (الوسيط: 4.8٪)، والذي يعزى إلى زيادة كمية من الخلايا غير متحركة (100 نانوغرام / مل EGF: 34 ٪ مقابل 100ng / مل EGF + 2 ميكرومتر U73122: 70٪)، وكذلك إلى وقت انخفضت النمط النشط (الشكل 3F).

الشكل 1
الرقم 1. محة تخطيطية إعداد غرف الهجرة الخلية. يتم إعداد (AE) وغرفة الهجرة الخلية عن طريق رسم مرتين إلى ثلاث طبقات من paraffi ذابن الشمع / مزيج هلام البترول على شريحة زجاجية. (F، G) تتم إضافة ساترة ومختومة مع مزيج البارافين ذاب الشمع هلام / النفط (H) يتم وضع دائرة الهجرة في وضع رأسي تليها إضافة خلايا الكولاجين تعليق. بعد ذلك، يتم وضع دائرة الهجرة في حاضنة السماح للتعليق خلايا الكولاجين لتتبلمر. (I، J) يتم تعبئة الغرفة الهجرة مع وسائل الإعلام ومختومة مع شمع البارافين ذاب / مزيج هلام البترول في الجانب الرابع. بعد ذلك، يتم وضع دوائر الهجرة تحت المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2. محة تخطيطية للتحليل بيانات الهجرة الخلية. (A) ملف بيانات تتبع الخلية. عشريتم تحديد ه الأنشطة المهاجرة من 30 خلية في التجربة، حيث يتم تحليل 60 نقاط زمنية. أ "،" يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك بين نقطتين، في حين أن "القيمة العددية" تشير حركة الخلية. (B) هذا الرسم التخطيطي نسخة من البيانات الواردة في (A). يشير كل الماس أن انتقلت بين نقطتين الوقت؛ خط يشير إلى حركة أطول. أدرجت الخطوط الرمادية لتصور أن سكان الخلية يتكون من خلايا غير تتحرك وتتحرك الخلايا (التي، مع ذلك، وجعل توقف). (C) وقت حركة نشطة (الوقت النشطة) يمثل نسبة مئوية من إجمالي الوقت خلية لها هاجر بالنسبة إلى الوقت الإجمالي لفترة المراقبة. زمن نشط بنسبة 20٪ والوقت ما مجموعه 15 ساعة يشير إلى أن هذه الخلية قد انتقل في المجموع لمدة 3 ساعة. يتم استخدام هذه المعلمة أيضا على تحديد عدد الخلايا غير متحركة، وهو ما يعادل وقت نشط 0٪. (D) (E) بدلا من ذلك، يمكن عرض النشاط الحركي للخلايا تحليلها كما رسم تخطيطي BoxPlot. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
وعولج الشكل 3. بيانات الهجرة الخلية التمثيلية للMDA-HER2 وخلايا سرطان الثدي MDA-الأجسام القريبة من الأرض. الخلايا مع 100 نانوغرام / مل EGF، 2 ميكرومتر U73122 أو مع أحد المشاركين mbination من الاثنين معا. (A، B) يعني النشاط الحركي من MDA-HER2 (A) وMDA-NEO (B) الخلايا في الاعتماد على الوقت. (C، D) BoxPlot الرسم البياني للنشاط الحركي نفسه، يمثل ساعة 2 ل الفاصل الزمني 13 ساعة (انظر شريط في (A، B)) من MDA-HER2 (C) وMDA-NEO (D) الخلايا. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام -test مان وWhitney- U. *** = P <0.001. (E، F) المؤامرات الرسم البياني من الوقت نشط من MDA-HER2 (E) وMDA-NEO (F) الخلايا. زمن نشط من 0٪ إلى أن الخلايا لم تتحرك خلال فترة المراقبة. مربوط، وهو وقت نشط من 20٪ يشير إلى أن، معتبرا فترة مراقبة 15 ساعة، تحركت هذه الخلايا لمدة تصل إلى 3 ساعة. أظهرت هي متوسط ​​لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة.بياض "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

القدرة على الهجرة هي السمة المميزة للخلايا السرطانية 4. دون القدرة على الانفصال عن الورم الرئيسي وللهجرة من خلال المحيطة الخلايا السرطانية الأنسجة الضامة لن تكون قادرة على البذور الآفات الثانوية، والتي هي السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان تقريبا. بسبب هذه العلاقة العديد من الدراسات التي تركز على هجرة الخلايا السرطانية. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد الجزيئات المستهدفة جديدة ومسارات الهدف الذي منع الهجرة كفاءة الخلايا السرطانية، وبالتالي إضعاف أو تباطؤ تشكيل ورم خبيث. مثال لمثل هذا الجهد قد يكون حاصرات β، والتي ثبت لمنع النقيلي انتشار خلايا سرطان الثدي في المختبر والمجراة في 36 والتي ارتبطت مع تحسين البقاء على قيد الحياة خالية من الانتكاس في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي الثلاثي السلبي الخلايا السرطانية 37. لقد أثبتت مؤخرا أن الخلايا الهجينة، التي تستمد من spontaneالأحداث الانصهار بين الأوس الثدي الظهارية البشرية خط الخلايا وسرطان الثدي خط الخلية البشرية، ولكن ليس الخلايا الأبوية، استجاب إلى chemokine CCL21 مع زيادة النشاط الهجرة 26. ارتبط CCL21 مع تشكيل العقدة الليمفاوية الانبثاث من أنواع السرطان المختلفة، بما في ذلك الثدي 38، مما يوحي بأن الانصهار خلية يمكن أن يكون عملية كيف الورم (الهجين) خلايا يمكن أن يكتسب خصائص النقيلي 39،40.

و3D فحص الهجرة الكولاجين مصفوفة لديه العديد من الفوائد بالمقارنة مع الغرفة بويدن / transwell فحص والصفر فحص / فحص التئام الجروح. أولا، يتم تضمين الخلايا في بيئة الفسيولوجية 3D. وكما ذكر أعلاه، فإن سلوك الهجرة الخلايا يختلف بشكل ملحوظ بين بيئة ثنائية الأبعاد 3D و3،14،15. وبالتالي فإنه يمكن استنتاج أن سلوك الخلايا المهاجرة جزءا لا يتجزأ من داخل شعرية الكولاجين 3D يشبه أكثر إلى الوضع في الجسم الحي من locomالنشاط otory الخلايا الزحف على سطح ثنائي الأبعاد. وثانيا، بسبب ضيق الوقت الفاصل بين تسجيل الفيديو أنه من الممكن لتحليل الهجرة من عدة خلايا على مدى زمني معين، والذي يسمح بتحديد مختلف المعلمات هجرة الخلية. على النقيض من ذلك، في غرفة بويدن / transwell فحص تعتبر تلك الخلايا فقط للتحليل التي انتقلت إلى انخفاض المقصورة. ليست مدرجة تلك الخلايا التي تهاجر على سبيل المثال، على رأس الغشاء في تحليل البيانات على الرغم من أنها المهاجرة نشطة.

الكولاجين مصفوفة 3D يمكن دمجها مع أجهزة ميكروفلويديك، التي بالإضافة إلى محاكاة المصفوفة خارج الخلية أيضا لا تحاكي السائل الخلالي، وهو ما ثبت أن تؤثر على التشكل والهجرة من مختلف أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، الخلايا السرطانية والخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة 41. كشفت بيانات Haessler آخرون أن تدفق الخلالي يزيد من نسبةمن الخلايا التي تصبح المهاجرة وكذلك يزيد من سرعة migrational في حوالي 20٪ من الخلايا 42. بالإضافة إلى دراسة السلوك الكيميائي للخلايا، على سبيل المثال، الكريات البيض / الخلايا الليمفاوية أو خلايا الورم، وإعداد ميكروفلويديك 3D هو أيضا أداة مناسبة لدراسة دخول الوعاء الخلايا السرطانية وحاجز غشائي وظيفة 43.

على الرغم من أن الفحص 3D الهجرة الكولاجين مصفوفة هو أداة مناسبة لتحليل هجرة الخلايا ردا على التحفيز أو مثبطات أو مزيج من الاثنين معا لا بد من الإشارة إلى أن هذا الاختبار تفعل أيضا بعض القيود. على سبيل المثال، يستخدم فقط نوع الكولاجين الأول لمحاكاة المصفوفة خارج الخلية، التي، مع ذلك، هو خليط معقد من عدة مكونات منها البروتيوغليكان، غير البروتيوغليكان (على سبيل المثال، حمض الهيالورونيك)، ألياف الكولاجين، وكذلك وفبرونيكتين laminin والتي يختلف تكوين مزيد ملحوظ بين الأنسجة الضامة المختلفة في مختلف الأجهزة 45 نتيجة التفاضلية. على سبيل المثال، تسبب التحفيز β1 إنتغرين تفعيل إرك حيدات في حين لم β2 التحفيز لا 46. وبالمثل، كان مطلوبا PI3K لβ1-integrin-، ولكن ليس β2-integrin-، بوساطة تفعيل NF-46 كيلوبايت. من ناحية أخرى، نوع الكولاجين الكولاجين الأول هو الأكثر وفرة في جسم الإنسان 47 مما يدل على أن الهجرة من خلايا يتم تشغيل جزء كبير منها من هذا النوع الكولاجين.

نقطة حرجة أخرى في فك رموز الخلايا المهاجرة النشاط هو الإجراء تتبع الخلية. للحصول على بيانات صحيحة وموضوعية وهي ملزمة أن يتم تحليل مسار الخلايا واحد بدقة. يتم تنفيذ تتبع خلية يدويا باليد، الذي يطالب تجربة تتبع الخلية لالحصول على بيانات موضوعية. لزيادة تحسين البيانات وتجنب عددا هاما من خلايا إيجابية كاذبة نحن نستخدم مستوى قطع من 25 ميكرون، وهو ما يعني أن الخلايا التي هاجرت أقل من 25 ميكرون استبعدت من تحليل البيانات. وبالمثل، يتم اختيار الخلايا عشوائيا لتتبع دون معرفة ما إذا كانت الهجرة نشطة أم لا لتجنب بيانات متحيزة.

خلال السنوات الماضية تم تطوير العديد من التطبيقات البرمجية تتبع خلية الآلي، حيث البعض منهم هي مناسبة لتحليل الخلايا والجسيمات تتبع في وضع 3D 18. والاستفادة من هذه التطبيقات هي أن الخلايا المهاجرة يتم تحليل حقا بطريقة موضوعية. بسبب أنه سيكون من المثير للاهتمام مقارنة بيانات تتبع خلية الآلي مع مصنوعة يدويا بيانات تتبع الخلية.

كما ذكر أعلاه، فإن الذهب القياسية لتحليل الهجرة الخلية في سياق الفسيولوجية 3D هو استخدام واي التصوير حيوي داخلي مجتمعةال 2 الفوتون الليزر المسح المجهري متحد البؤر. ميزة هذا الاختبار هي أن الخلايا المهاجرة هي جزء لا يتجزأ ضمن بيئة الفسيولوجية التي تتألف من عوامل محددة قابلة للذوبان، والهرمونات وغيرها، مكونات المصفوفة خارج الخلية وكذلك خلية الى خلية التفاعلات. ومن الجدير بالملاحظة أن نرى الأفلام تبين كيفية الاتجار بالبشر الخلايا الليمفاوية ضمن العقدة الليمفاوية 17، كيف الخلايا المناعية والتواصل مع الآخرين كل 48 أو كيفية توزيع العقاقير في الجسم الحي على مستوى خلية واحدة 12،49.

ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع التصوير حيوي داخلي 2 الفوتون الليزر متحد البؤر المسح المجهري هو أسلوب بدلا باهظة التكاليف نظرا لحاجة المجهر المناسب والنماذج الحيوانية المناسبة. وبالمثل، فإنه ليس حقا مناسبة لدراسة تأثير العوامل القابلة للذوبان واحدة / مثبطات على هجرة خلايا معينة أو تحليل الهجرة الخلية المرتبطة شلالات نقل الإشارة. لهذه الأغراض خلية ميلينصح المقايسات جريشن السماح للتحليل أنواع الخلايا المنفصلة التي يمكن تعديلها أبعد من ذلك، على سبيل المثال overexpression أو ضربة قاضية الجزيئات المستهدفة، في ظروف تجريبية محددة. بسبب العلاقة المحورية بين بيئة 3D والسلوك الحركي للخلايا نستنتج أن 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة وبالتالي طريقة تنوعا لدراسة هجرة الخلايا في بيئة في المختبر والمقرب من الوضع في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 92، الهجرة الخلية، 3D الكولاجين مصفوفة، وتتبع خلية
تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter