Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

Abstract

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים מסוגים שונים וממלא תפקיד מכריע במספר תהליכים פיסיולוגיים, הכוללים התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, ואת תגובה חיסונית. עם זאת, נדידת תאים היא גם מנגנון מפתח בסרטן מאפשר לתאי הסרטן אלה להתנתק מהגידול הראשוני להתחיל גרורתי מתפשט. בתוך השנים האחרונות מבחני נדידת תאים שונים פותחו כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של. בגלל התנהגות locomotory של תאים שונים במידה ניכרת בין שני ממדים (2D) וזה הסביבה תלת ממדי (3D) ניתן להניח כי הניתוח של ההגירה של תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D יניב בנדידת תאים משמעותית יותר נתונים. היתרון של assay ההגירה תאר 3D מטריקס קולגן הוא שתאים מוטבעים בתוך רשת 3D פיזיולוגית של סיבי קולגן המייצגים את המרכיב העיקרי של מטריקס. בשלנדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדדת מאפשרת הקביעה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים / לויקוציטים, תאי גזע, ותאים סרטניים. כמו כן, גם צבירי תאים או spheroids יכולים להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לסריג קולגן. אנו מסיקים כי assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא שיטה תכליתית כדי לנתח את ההגירה של תאים בתוך סביבת 3D פיזיולוגית דמוית.

Introduction

כמו איחוי תאים (לסקירה לראות 1,2) נדידת תאים היא תופעה ביולוגית אחרת, כי הוא מעורב בשפע של תהליכים פיסיולוגיים כוללים התפתחות עוברית, לריפוי פצעים ותגובה חיסונית (לסקירה ראה 3). עם זאת, היכולת להעביר גם תנאי מוקדם לתאים סרטניים לשלוח גרורות (לסקירה ראה 3,4).

נדידת תאים היא מורכבת, עדיין לא הבין באופן מלא תהליך שמנוהל על ידי יחסי הגומלין של מספר מסלולי העברת אותות ביוזמת יגנד השונים (למשל, ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, הורמונים, רכיבי מטריצה ​​תאיים) קולטן (למשל, טירוזין קינאז רצפטור, קולטנים chemokine, integrins) אינטראקציות 5 סופו של דבר גורמים לארגון מחדש של שלד התא במקביל אקטין עם דה והרכבה מחדש של מתחמי הידבקות מוקד וintegrin בתיווך איתות 6.

= "Jove_content" של> כדי לנתח תא הגירה כמה במבחנה ובמבחני נדידת תאי vivo פותחו בעשורים האחרונים, ובכלל זה assay התא / transwell בוידן 7, assay / פצע שריטה ריפוי assay 8-10, תלת ממדים ( 3D) assay מטריצת הקולגן הגירת 11 כמו גם הדמיה / מיקרוסקופיה intravital (לסקירה ראה 12). לכל אחד ממבחני נדידת תאים אלה יתרונות וחסרונות, לדוגמא, עלויות הנוגעות וצורך של ציוד, טיפול או לאמינות של הנתונים שהתקבלו.

שתי קאמרי / assay transwell בוידן וassay השריטה / assay ריפוי הפצע הם, בעלות נמוכה קלה ומבחנים מפותחים למדוד נדידת תאים במבחנה 7-10. בתא בוידן / transwell תאי assay הם זורעים על גבי נקבוביות להכניס מכילים (כ 8 מיקרומטר קוטר) - העליון התא שנקרא 7. אופציונאלי, להוסיף יכול להיות מצופה עם מ תאירכיבי Atrix, למשל, פיברונקטין, קולגן, וכו ', כדי לחקות את הסביבה פיזיולוגית יותר. כמו כן, תאי האנדותל ניתן יהיו לגדל על גבי העלון, ובכך מחקה את מחסום תא האנדותל 13. תאים אלה שעברו את הנקבוביות במרווח זמן שהוגדר לתא התחתון מחסה תקשורת ותוספים, כגון גורמי גדילה וכמוקינים, משמשים כקריאה החוצה לכמת נדידת תאים (או extravasation).

בassay השריטה / פצע תאי assay ריפוי הם זורעים בצלחות וגדלים לconfluency 10. בתלות של צלחות הגדרה הניסיוניות ניתן מראש מצופה עם רכיבי מטריצה ​​תאיים, כגון פיברונקטין. לאחר יצירת שריטה / פצע על ידי גירוד התאים בודדים monolayer תא מכל צד של השריטה / פצע יכול לנדוד לתוך הפער, ובכך ממלא / ריפוי זה 10. המרחק בין שני הצדדים של השריטה / פצעים נקבעבתלות של זמן ומשמש כקריאה החוצה לפעילות הנדידה של התאים 10. עם זאת, להבחין בין התפשטות תאים (שגם עלולה לגרום למילוי / ריפוי של השריטה / פצע) ונדידת תאים מומלץ לשלב את assay עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו ותא בודד מעקב 10.

עם זאת, שניהם קאמרי בוידן / assay transwell וassay / פצע שריטה ריפוי assay, הוא די מושלמים הנוגע לסביבה סלולרית פיזיולוגית דמוית. בתא בוידן / תאי assay transwell צריכים להעביר דרך נקבובית פלסטיק, ואילו בשריטת assay / ריפוי פצע תאי assay הם זורעים על צלחת פלסטיק מצופה מראש דו ממדים. כמו כן, הוא מוכר היטב שהתנהגות הנדידה שונה במידה ניכרת בין סביבה דו ממדית ו3D 3. למשל, הידבקויות תלת ממדי מטריצה ​​של fibroblasts שונים מהידבקויות מוקד ופיברילציה מאופיינות בשנימצעי -dimensional בתוכנם של α5β1 וintegrins αvβ3, paxillin, רכיבי cytoskeletal אחרים, וזרחון טירוזין קינאז של הידבקות מוקד 14. כמו כן, תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D מוצגים גם התנהגות נדידה שינה 15. כך לנתח נדידת תאים בצורה מדויקת יותר assay הגירה מומלץ מאפשר למדוד את ההגירה של תאים בודדים בתוך סביבה פיזיולוגית או דמוית פיזיולוגית 3D.

ההדמיה / מיקרוסקופיה Intravital היא הזהב סטנדרטי למדידת נדידת תאים בהקשר פיסיולוגי 3D. זה רק שאינו שייך לאינטראקציות מטריצת תאים תאיים, אלא גם ליחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים, כגון תאים סרטניים ותאי האנדותל במהלך extravasation 16 או סחר הלימפוציטים בתוך הבלוטה לימפה 17, אשר, למועד, הוא אפשרי בשל טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משופרות, כגון 2-פוטוןמיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר, השימוש בצבעים חיוניים ניאון וזני עכבר מהונדסים מבטא נגזרי חלבוני ניאון 12,16,17. בנוסף, הדמיה / מיקרוסקופיה intravital יכולה להיות משולבת עם תא ידני ואוטומטי מעקב 18. עם זאת, בשל הצורך של מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal 2 פוטונים, כמו גם בעלי החיים (ומודלים של בעלי חיים מהונדסים מתאימים) הדמיה / מיקרוסקופיה intravital היא טכניקה ולא עלות אינטנסיבית.

כדי להתגבר על המגבלות של החדר / assay transwell בוידן וassay ריפוי assay / פצע שריטה ולנתח את ההגירה של סוגי תאים שונים בתוך סביבת 3D assay הגירת מטריצת קולגן 3D פותח 11,19. ובכך, תאים נודדים מוטבעים בתוך רשת קולגן סיבי 3D, אשר מזכיר יותר לin vivo מצב. בצמדים, בשל נדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדד מאפשר determiאומה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים ולויקוציטים 11,20, גזע hematopoietic / תאי אב 21-24, ותאי גידול 5,25-29. בנוסף לתאים בודדים גם תא אשכולות או spheroids יכול להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לקולגן סריג 30,31.

פרוטוקול זה מציג סקירה על טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של בסביבת 3D - שיטה במבחנה מניב בתוצאות שאינן קרובים למצב in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 הכנת לשכות הגירה

  1. הכן ג'לי פרפין / נפט (1: 1) לערבב וחום עד לקבלת התערובת נמס. שימוש במכחולים ולצייר 2-3 שכבות של ריבת פרפין / הנפט (1: 1) מערבב באמצע שקופית הזכוכית בהתאם לדמויות 1B-1D.
    הערה: אנו משתמשים בשקופיות זכוכית נפוצות (76 x 26 x 1.0-1.5 מ"מ (W / D / H))
  2. החל תערובת ג'לי פרפין / נפט נמסה במהירות בשקופית הזכוכית, כדי למנוע התמצקות תוך כדי ציור. להבטיח את שכבת ג'לי פרפין / נפט היא על 2-2.5 סנטימטר באורך ו0.3-0.5 סנטימטר ברוחב. עובי שכבת ג'לי פרפין / הנפט צריך להיות על .1-0.15 סנטימטר.
  3. הוסף coverslip לפרפין הקרושה / תערובת וזלין ולאטום אותו עם שניים עד שלוש שכבות (1E דמויות, 1F) פרפין תערובת ג'לי שעווה / נפט. השתמש 4-8 תאי הגירה לניסוי נדידת תאים נפוצים. תאי הגירת מקום in תנוחה זקופה במעמד.

2 הכנת Mix תא ההשעיה קולגן

  1. קציר (לדוגמא, עם 0.25% טריפסין / EDTA) ולספור תאים של עניין. Resuspend תאי תקשורת מלאה המכילה עוברי עגל בסרום (FCS), אנטיביוטיקה ומומלצת תוספים. הכן 4-8 1.5 מ"ל צינורות תגובה ו20 השעיה תא μl המכילה 4-6 x 10 4 תאים (המספר הכולל של תאים תלוי בסוג התא להיות מנותח) ולמלא עד 50 μl עם תקשורת מלאה.
    הערה: תרכובות נוספות (לדוגמא, גורמי גדילה, כמוקינים, מעכבים, וכו ') מתווספות להשעית התא. השתמש בפתרוני המלאי מתאימים כך שהנפח הסופי של השעיה תא אינו עולה על 50 μl.
  2. הכן סכום כולל של 452 השעיה קולגן הסופית μl לארבעה ניסויי נדידת תאים. הוסף 50 μl 10x MEM (pH 5.1-5.5) ו27 μl של .7.5% פתרון סודיום ביקרבונט (pH 9.0-9.5) לצינור תגובה 1.5 מ"ל ומערבבים היטב. שים לב לתורו בצבע פתרון מצהוב כתומה לסגול העז (pH 9.0-9.5). הוסף השעיה קולגן 375 μl נוזל ל10x ממ / פתרון סודיום ביקרבונט ומערבבים היטב. PH של ההשעיה קולגן הסופית צריך להיות על 7.5 (מסומן בצבע סגול בהיר).
    הערה: בדוק את pH של תמיסת סודיום ביקרבונט 7.5%. אם pH הוא כ 7.5 מקום פתרון סודיום ביקרבונט עם מכסה פתוח בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) להיות רווי עם CO 2 ולהגדיל את רמת החומציות (כ 9.0-9.5). PH של תערובת תא ההשעיה קולגן הוא חיוני ליציבות של רשת קולגן. אם זה נמוך מדי סריג קולגן יקרוס במהלך ניסוי נדידת תאים.
    הערה: לקבלת פרוטוקול זה, להשתמש בקולגן הנוזלי (pH 1.9-2.2) מאחורי שור (2.9-3.3 מ"ג / מ"ל ​​קולגן, 95% קולגן סוג I, 5% IV סוג קולגן). דוגמאות לפרוטוקולי הכנת סריג קולגן נוסף באמצעותסוג אני קולגן ממקורות אחרים, כגון חזירי או עכברוש, ניתנים ב32,33. אין לשנות את הכרכים של הפתרונות המשמשים כזה ישנה את ריכוז קולגן האולטימטיבי של 1.67 מ"ג / מ"ל ​​של הסריג. יש ריכוז קולגן גבוה יותר או נמוך יותר השפעה על הצפיפות של סיבי קולגן והמרחק ביניהם הממוצע במקביל לתאי התנהגות 34 נודד.
  3. הוספה של ההשעיה קולגן הסופית להשעיה תא 50 μl 100 μl ולערבב thoroughly.The השעיה סופית קולגן (1.67 מ"ג / מ"ל ​​קולגן) היא מעט צמיגה. כדי להעביר את הסכום הנכון (100 μl), פיפטה פתרון קולגן הסופי פעם אחת למעלה ולמטה לפני העברתה להשעית התא.
    הערה: ברגע שתערובת תא ההשעיה קולגן בשילוב עם פתרון 10x ממ / סודיום ביקרבונט וערך pH השתנה ל7.5 סיבי קולגן מייד להתחיל לפלמר.
  4. העבר את תערובת תא הסופית ההשעיה קולגן מהצינורות תגובת דואר לתאי ההגירה. לטפוח בעדינות את תא ההגירה לחלק באופן שווה את תערובת תא ההשעיה קולגן בחלק התחתון של חדר ההגירה (איור 1H). מניחים את תאי ההגירה בתנוחה זקופה במעמד ודגירה על 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר פילמור של סיבי קולגן.
  5. שים לב שסריג קולגן polymerized הוא מעט עכור, אבל עדיין להיות בצבע סגול בהיר. למלא את תאי הגירה עם מדיום מלא או בינוני מלא עם תוספים של עניין ולאטום את חדר ההגירה עם תערובת ג'לי פרפין / נפט (איורים 1 ט, י 1).

.3 הקלטה וניתוח של נדידת תאים

סעיף זה מתאר את ההקלטה של ​​נדידת תאים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות וידאו וניתוח של נדידת תאים על ידי מעקב סלולארי מדריך ל.

  1. לעבור על המיקרוסקופ וחימום הבמה מיקרוסקופter. כוון את הטמפרטורה ל37 C °. השתמש אובייקטיבי 10X. הנח תא הגירה תחת מיקרוסקופ ולהתמקד 50 כ תאים או יותר בשדה הראייה.
  2. הגירה רשומה תא במצב הזמן לשגות באמצעות תוכנת מעקב וידאו מרובה מצלמה. לשמור סרטי נדידת תאים בפורמט מתאים, למשל, "* אבי" או ".mov *". קישור קבצי סרט נדידת תאים למאגר מידע המכיל מידע תומך, כגון סוג תא ותנאי ניסוי.
    הערה: אנו מקליטים לימפוציטים וHSPCs עד שעה 2 באמצעות גורם הזמן לשגות של 1:80, מה שאומר ש0.75 שניות בזמן לשגות שווה ל1 דקות בזמן אמת. תאי גידול הם תאים שנעו לאט ולכן נרשמו לפחות 16 שעות באמצעות גורם הזמן לשגות של 1: 1,800 (0.5 שניות בזמן לשגות שווה ל15 דקות בזמן אמת).
  3. לנתח סרטי נדידת תאים באמצעות יישום מתאים מעקב תא תוכנה, כמו תוספי תוכנת ImageJ(סקירה כללית ניתן ב18). לניתוח בלתי מוטה זה הוא בעל חשיבות מכרעת כי תאים ייבחרו באופן אקראי ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים או לא.
    הערה: אנו משתמשים ביישום תוכנה מפיתוח עצמי כדי לעקוב באופן ידני את הנתיבים של לפחות 30 תאים לכל ניסוי על ידי ביצוע התאים נעו בצורה מדויקת עם סמן העכבר (שממוקם לגרעין). תוך מעקב, xy-הקואורדינטות של התאים עליהם המעקב באופן אוטומטי שנקבעו בהתאם למצב בזמן לשגות בשימוש. לימפוציטים מסוג xy-קואורדינטות / HSPCs נקבעות כל שניה 0.75 (שווה בזמן אמת 1 דקות), ואילו לתאי גידול xy-הקואורדינטות נקבעות כל שניה 0.5 (שווה לזמן אמת 15 דקות).
  4. לקבוע כולל של 60 xy-קואורדינטות לכל תא לניסוי נדידת תאים טיפוסי. זה שווה לשעה 1 בזמן אמת לימפוציטים / HSPCs ו15 שעה בזמן אמת לתאים סרטניים. "," מצביע על כך שתא לא זז בין two נקודות זמן, ואילו "ערך מספרי" מציין את המרחק ב" פיקסלים "תא עבר בין 2 נקודות זמן (איור 2 א).
    הערה: מעקב תא ידני דורש ניסיון. במיוחד תאים מהירים נודדים קשים לעקוב וכל תערוכת סוג תא התנהגות נדידה שונה שעשויים להיות מופעלת על ידי גורמים בתוספת. במקרה של חלוקת תא תוך מעקב, באופן אקראי לבחור תא בת אחת להמשך מעקב. תאים שנודדים אל מחוץ לשדה הראייה או למות תוך מעקב אינו מוזנח, אך נחשבים לניתוח.

ניתוח .4 נתונים

  1. ניתוח נתוני מעקב תא באמצעות יישום מתאים תוכנה, למשל, תוכנת גיליונות אלקטרוניים.
    1. ניתוח נתוני מעקב תא על ידי העתקת תא מעקב נתונים גולמיים (איור 2 א), לתבנית של גיליון אלקטרוני בעיצוב עצמי. להכפיל סכום של "הערכים המספריים", המייצג אתהמרחק הכולל של תאים שנדדו עם גורם תיקון להמיר "פיקסל" לתוך "מיקרומטר".
    2. לקבוע שני פרמטרים נדידת תאים: פעילות locomotory (שהוא שווה ערך לשיעור הגירה) ושעה של תנועה אקטיבית (2C דמויות, 2D).
    3. זהה את התאים שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר (רמת סף כדי לצמצם את מספרם של תאים חיוביים שגויים) כתאים שאינם זז. החלף את "ערכים מספריים" של תאים אלה עם ",".
      הערה: הפרמטר (או שיעור הגירה) "פעילות locomotory" מייצגת את אחוז התאים של אוכלוסיית תאי מעקב שנעו בין שתי נקודות זמן (איור 2 ד). "ערך מספרי" מוגדר כתא מרגש, ואילו "," מוגדר כתא שאינו זז. הפרמטר "הזמן של תנועה פעילה" (זמן פעיל) מייצג את אחוז הזמן הכולל תא הגר מחדשויסות למסגרת של תקופת התצפית (איור 2 ג) הזמן. "ערך מספרי" מצביע על כך שתא עבר, ואילו "," מצביע על כך שתא לא זז. פרמטר זה נמצא בשימוש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שלא עברו.
  2. לחשב מובהקות סטטיסטיות ונתונים נדידת תאי תצוגה.
    1. לחשב מובהקות סטטיסטיות של פעילות locomotory הממוצעת של התאים (שיעור ההגירה) באמצעות מבחן Mann-Whitney U. שקול p-value <0.05 משמעותיים כ.
    2. להציג את פעילות locomotory הממוצעת של תאים כxy-תרשים, תרשים BoxPlot, או כתרשים תרשים בר. להציג נתונים יחידים המבוסס על תאים, כגון זמן של תנועה או מהירות פעילה, כתרשים תרשים בר או כמו היסטוגרמה.
      הערה: אם יישום תוכנת גיליון אלקטרוני שנבחר אינו מכיל כלי תרשים או תרשים היסטוגרמה BoxPlot חיפוש מקוון יש לבצע למחפש tu המתאיםtorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן המשמש בשילוב עם הזמן לשגות וידאו מיקרוסקופיה ומעקב תא בעזרת מחשב מאפשר לקביעת פרמטרים שונים נדידת תאים כוללים גם פרמטר המבוסס על האוכלוסייה (למשל, אומר שפעילות locomotory) ופרמטרים המבוסס על תא בודדים (לדוגמא, זמן של פעיל תנועה, מהירות, מרחק היגר). דוגמא לסטים שהושגו מעקב תא נתונים, עיבוד נתונים והצגת הנתונים מובאות באיור 2. תא מעקב קובץ נתונים דומה שולחן (איור 2 א). כל עמודה מייצגת תא מעקב אחד, לפיה לכל ניסוי נדידת תאים 30 תאים מתבצעים מעקב. השורות מכילה מידע אם תא עבר או לא בין שתי נקודות זמן. הסכום של "הערכים המספריים", המייצגים את המרחק בתא "פיקסל" עבר בין שתי נקודות זמן, הוא המרחק הכולל תא זה יש להעביר. הוא מוכפל בacגורם orrection להמיר "פיקסל" לתוך "מיקרומטר". תאים שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר מוגדרים כתאים שאינם זז כדי לצמצם את מספרם של התאים חיוביים שגויים. המהירות (מיקרומטר / min) של כל תא מחושב על ידי החלוקה "מרחק כולל נדד" על ידי "זמן כולל (דקות) של תקופת ההסתכלות".

כדי לאפיין את התנהגות locomotory של תאים בדרך כלל שני פרמטרים משמשים. פעילות locomotory (איור 2 ד) מייצגת את פעילות locomotory (או שיעור הגירה) הממוצעים של אוכלוסיית התא נותחה, ואילו זמן תנועה פעילה (איור 2 ג) מייצג את הסך כל זמן תא הגר בתוך תקופת התצפית. הפרמטר האחרון משמש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שלא עברו. הסיבה לשימוש בשני פרמטרים נדידת תאים לניתוח מיוחסת לעובדה שפעילות locomotory של תאים יכולה להיות מופעלת על ידי differeמנגנוני NT. ישנן שלוש אפשרויות כיצד, למשל, גורם גדילה, יכול "לגרום" נדידת תאים: א) בהשוואה לשליטה יותר תאים נודדים, ב) מספר נע תאים בהשוואה לשליטה לא השתנה, אבל גורם גדילה שטופל תאי תערוכת זמן מוגבר של תנועה פעילה, מה שאומר שתאים אלה יעברו לפרקים זמן ארוך יותר, וג) שילוב של) ו ב).

התרשים באיור 2B סכמטי מדגים כיצד פעילות locomotory והשעה של תנועה פעילה מחושבת. בדוגמא זו פעילות הנדידה של 120 תאים (שהוא שווה לארבעה ניסויים בלתי תלויים) מוצגות. כל יהלום מצביע על כך שתא עבר בין לפחות שתי נקודות זמן (ללא קשר למרחק התא הגר!). הקווים האפורים נוספו לתרשים זה כדי להראות שהאוכלוסייה ניתחה של תאים מורכב ממרגשת ותאים שאינם זז. הפרמטר "locomפעילות otory "מייצגת את פעילות locomotory של אוכלוסיית התא נותחה בתלות של כל נקודה (איור 2 ד) זמן. לדוגמא, פעילות locomotory של 10% ב t = 5 שעות מצביעה על כך שבין t = 4.45 שעה וt = 5 שעות 10% מהתאים ניתחו עברו. כאשר מוצג כxy-תרשים פעילות locomotory הפרמטר מציינת את dynamicity של אוכלוסיית התא נותחה. אפשרות נוספת כדי להציג את פעילות locomotory של אוכלוסיית תא היא תרשים BoxPlot (איור 2F).

הפרמטר "הזמן של תנועה פעילה" (זמן פעיל) מתואם לזמן הכולל תא עבר במהלך תקופת התצפית, לפיה זמן פעיל של "0" מצביע על כך שתא לא זז (איור 2 ג). הזמן הפעיל של התאים יכול להיות מוצג כמו היסטוגרמה.

משחק הגומלין של EGFR / HER2 / PLC-γ1 וHER2 / HER3 / איתות PI3K תורם לפנוטיפ נדידה של EGFR / תאי סרטן שד חיובי HER2 / HER3 25. איתות PI3K נדרש לדור של phosphatidyl-3,4,5-trisphosphate (PIP3), אשר משמש כמולקולת עוגן לPLC-1, ובכך לגייס אנזים זה לקרום הפלזמה שתופעל על ידי טירוזין קינאז רצפטור 35. גירוי של תאים אך ורק EGFR החיוביים מד"א-MB-468-NEO (MDA-NEO) סרטן השד הביא במקביל זירחון טירוזין PLC-γ1 ארוך טווח עם IP3 המתמשך ורמות DAG ייצור תנודות סידן סינוסי 27. בניגוד לכך, EGFR / תאים חיוביים HER2 מד"א-MB-468-HER2 (MDA-HER2) סרטן השד מוצג תנודות סידן חולפות בסיס לאחר טיפול EGF בשל טווח קצר הפעלת PLC-γ1 טירוזין וIP3 לטווח קצר ומחזור DAG 27 המציין שביטוי HER2 היה בקורלציה להפרש קינטיקה PLC-γ1 ואיתות.

ניתוח של התנהגות הנדידה של מד"א-HER2 ומד"א-Nשורות תאי סרטן שד איו גילו כי שני שורות התאים הציגו פעילות locomotory ספונטנית דומה (MDA-HER2: 23.0 - 28.9%, חציון: 26.7% לעומת מד"א-NEO: 19.3-24.4%, חציון: 21.5%; הציורים A3-3D ). זמן הפרמטר הפעיל, המייצג את הזמן של תנועה האקטיבית של תאים בודדים בהשוואה לתקופת ההתצפית, חשף מספר מעט גבוה יותר של תאי MDA-HER2 באופן ספונטני נעו (64%; איור 3E) בהשוואה לתאי סרטן שד מד"א-NEO ( 53%; איור 3F). גירוי עם 100 ng / EGF מ"ל הביא לפעילות locomotory גדל באופן משמעותי בשתי שורות התאים. פעילות הנדידה של EGF טופלה מד"א-HER2 שהועלה ל30.4-35.2% (33.7% חציון; איורים 3 א, 3 ג), שיוחס לשניהם מספר גדל של תאים נעו (100 ng / ml EGF: 81% לעומת שליטה: 64%) וזמן מוגבר של תנועה פעילה. לדוגמא, כמות תאי MDA-HER2 מציגה זמן פעיל של 40% היהעלה מ 20% (שליטה) ל28% (100 ng / ml EGF). נתונים דומים התקבלו עבור תאי MDA-NEO סרטן השד, אשר פעילות נודדות הוגדלה ל 25.2-35.2 (30.4% חציון; 3B דמויות, 3D) על גירוי EGF. בצמדים, יותר תאים MDA-NEO הגרו בתגובה לגירוי EGF (100 ng / ml EGF: 66% לעומת שליטה: 53%) ומוצג דפוס פעיל זמן השתנה (איור 3F). לדוגמא, הסכום של תאים בעלי זמן פעיל של 60% הוגדל במידה ניכרת ל30% בנוכחות של EGF, בהשוואה לתאים שלא טופלו במד"א-NEO (13%).

טיפול של מד"א-HER2 ותאי סרטן שד מד"א-NEO עם U73122 מעכב PLC-γ1 הביא עיכוב של שתי ההגירה המושרית הספונטנית וEGF של התאים (איור 3A-D). עם זאת, בהשוואה לתאי סרטן שד מד"א-NEO ההשפעה המעכבת של U73122 על ההגירה הספונטנית של תאי MDA-HER2 הייתה מתונה למדי, ובכל זאתמשמעותית (שליטה: 23.0-28.9%, חציון: 26.7% לעומת 2 מיקרומטר U73122: 17.8-21.5%, חציון: 20.0%; איור 3 ג). ניתוח של זמן הפרמטר הפעיל חשף כמות מעט מוגברת של תאים שאינם זז בנוכחות U73122 (שליטה: 36% לעומת 2 מיקרומטר U73122: 48%; איור 3E). בדומה לכך, טיפול U73122 חסם את הגירת EGF המושרית של תאי סרטן שד מד"א-HER2 (100 ng / ml EGF: 30.4-35.2%, 33.7% 100 EGF החציון לעומת ng / ml + 2 מיקרומטר U73122: 19.3-24.1%, 22.6 חציון %; איור 3 ג). בהתאם לאך ורק U73122 טופל תאי MDA-HER2 השפעה מעכבת זה ולא ייחס לכמות מוגברת של תאים שאינם זז, אבל לא דפוס פעיל זמן שינה (איור 3 ג). למעשה, שינוי קל לכיוון זמן מוגבר של תנועה הפעילה היה להבחין במעבר שטופלו תאי MDA-HER2 עם EGF וU73122 (איור 3 ג).

בניגוד לכך, טיפול בתאי MDA-NEO עם U73122 2 מיקרומטר הביאו במידה ניכרת ירידה בפעילות locomotory של 5.6 10.7% (חציון: .9.3%; איור 3F) שיוחס בעיקר לכמות מוגברת של תאים שאינם זז (שליטה: 47% U73122 לעומת 2 מיקרומטר: 79%; איור 3F). כמו כן, ההגירה המושרית EGF של תאי סרטן שד מד"א-NEO נחסמה במידה ניכרת על ידי U73122 1.1 7.4% (חציון: 4.8%), שיוחס לכמות מוגברת של תאים שאינם זז (100 ng / ml EGF: 34 % לעומת 100ng / מ"ל EGF + 2 מיקרומטר U73122: 70%), כמו גם לדפוס פעיל זמן ירד (איור 3F).

איור 1
איור 1 סקירה סכמטי של הכנת תאי נדידת תאים. (AE) קאמרי נדידת תאים הוא הוכן על ידי ציור שני שלוש שכבות של paraffi מותךn שעווה / נפט ג'לי לערבב על גבי זכוכית. (F, G) coverslip הוא הוסיף וחתם עם תערובת ג'לי שעווה / נפט פרפין המותך. (H) קאמרי ההגירה היא לשים בתנוחה זקופה ואחריו הוסיף קולגן התאים השעיה. בהמשך לכך, תא ההגירה ממוקם בחממה מאפשרת ההשעיה קולגן התאים לפלמר. (אני, J) קאמרי ההגירה מלא עם תקשורת ונחתם בתערובת ג'לי שעווה / נפט פרפין מומס בצד הרביעי. לאחר מכן, תאי הגירה ממוקמים מתחת למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 סקירה סכמטי של ניתוח נתונים נדידת תאים. קובץ () מעקב סלולארי נתונים. הפעילויות נודדות הדואר של 30 תאים נקבעה לניסוי, לפיה 60 נקודות זמן מנותחות. "," מצביע על כך שתאים לא עברו בין שתי נקודות, ואילו "ערך מספרי" מציין תנועת תא. (ב) תרשים זה הוא נוף סכמטי של הנתונים המוצגים ב(). כל יהלום מצביע על כך שעבר בין שתי נקודות זמן; קו מציין תנועה ארוכה יותר. הקווים האפורים נכללו לדמיין שאוכלוסיית התא מורכבת מלא נע תאים והעברת תאים (אשר, עם זאת, לעשות הפסקות). (C) זמן של תנועה פעילה (זמן פעיל) מייצג את אחוז הזמן הכולל תא יש היגר ביחס לזמן הכולל של תקופת התצפית. זמן פעיל של 20% וזמן כולל של 15 שעה מצביע על כך שהתא הזה עבר בסך הכל עבור 3 שעות. פרמטר זה נמצא בשימוש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שאינם זז, שהוא שווה ערך לזמן פעיל של 0%. (D) (E) לחלופין, פעילות locomotory של התאים ניתחו יכולה להיות מוצג כתרשים BoxPlot. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
.3 נתונים איור נציג נדידת תאים של מד"א-HER2 ותאי סרטן שד מד"א-NEO. תאים טופלו ב100 ng / ml EGF, 2 מיקרומטר U73122 או עם שיתוף mbination של שניהם. (A, B) ממוצע פעילות locomotory של מד"א-HER2 () ומד"א-NEO (B) תאים בתלות לעת. תרשים BoxPlot של פעילות locomotory הממוצעת, המייצג את שעה 2 ל( C, D) 13 מרווח זמן שעה (ראה בר ב( A, B)) תאים של מד"א-HER2 (C) ומד"א-NEO (ד '). מובהקות סטטיסטיים חושבו באמצעות -test מאן-Whitney- U. *** = P <0.001. (E, F) חלקות היסטוגרמה של הזמן הפעיל של מד"א-HER2 (E) ותאי MDA-NEO (F). זמן פעיל של 0% מציין שתאים לא עברו במהלך תקופת התצפית. בצמדים, זמן פעיל של 20% מציין כי, בהתחשב בתקופת תצפית של 15 שעה, תאים אלה עברו לתקופה של עד 3 שעות. מוצגים הם הממוצעים של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים סרטניים 4. ללא היכולת להתנתק מהגידול הראשוני ולנדוד דרך תאי גידול רקמות חיבור שמסביב לא תוכל זרע נגעים משניים, המהווים את הגורם העיקרי למותם של כמעט כל חולי הסרטן. בגלל הקשר הזה מחקרים רבים מתמקדים בנדידת תאי הסרטן. המטרה של מחקרים אלה היא זיהוי של מולקולות רומן יעד ומסלולי יעד ביעילות לחסום נדידת תאים סרטניים, ובכך לפגוע או להאט את ההיווצרות גרורה. דוגמא למאמץ כזה יכול להיות β-חוסמי, אשר הוכחו לעכב גרורתי התפשטות תאי סרטן השד במבחנת in vivo 36 ואשר היו קשור עם הישרדות ללא הישנות משופרת בחולים עם חזה משולש שלילי תאי סרטן 37. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי תאים היברידיים, אשר נבעו מspontaneאירועי היתוך היחידות הארגוניות בין קו אנושי אפיתל שד תא ושורת תאי סרטן השד אנושית, אך לא התאים הוריים, הגיבו לCCL21 chemokine עם פעילות נדידה מוגברת 26. CCL21 נקשר עם היווצרות גרורות בלוטה לימפה של סוגי הסרטן שונים, כוללים סרטן השד 38, המצביעה על כך איחוי תאים יכול להיות תהליך כיצד תאים סרטניים (היברידי) יכולים לרכוש נכסים גרורתי 39,40.

יש assay הגירת מטריצת קולגן 3D מספר יתרונות בהשוואה לתא בוידן / assay transwell וassay / פצע השריטה ריפוי assay. ראשית, תאים מוטבעים בתוך סביבה פיזיולוגית 3D. כאמור לעיל, התנהגות הנדידה של תאים שונים במידה ניכרת בין סביבה דו ממדית ו3D 3,14,15. כך ניתן להסיק שהתנהגות הנדידה של תאים המוטבעות בתוך סריג קולגן 3D דומה יותר למצב בvivo מ locomפעילות otory של תאים זוחלים על משטח דו ממדי. שנית, בשל הקלטת וידאו הזמן לשגות זה אפשרי לנתח את הגירתם של מספר תאים על פני פרק זמן מסוים, המאפשר קביעת פרמטרים נדידת תאים שונים. בניגוד לכך, בassay התא / transwell בוידן רק תאים אלה נחשבים לניתוח שעבר לתא התחתון. תאים אלה שהם נודדים לדוגמא, בחלקו העליון של הקרום אינם נכללים בניתוח הנתונים למרות שהם נודדים פעילים.

מטריצת קולגן 3D יכולה להיות משולבת עם מכשירי microfluidic, אשר בנוסף לחיקוי המטריצה ​​תאית גם אין לחקות את נוזל ביניים, אשר הוכח להשפיע על המורפולוגיה וההגירה של תאים מסוגים שונים, כגון פיברובלסטים, תאים סרטניים, תאי האנדותל , ותאי גזע mesenchymal 41. נתונים של Haessler et al. גילו כי זרימת ביניים מגדילה את אחוזשל תאים שהופכים לנדידה, כמו גם מגביר את מהירות migrational בכ -20% מהתאים 42. בנוסף ללמוד את התנהגות chemotactic של תאים, למשל, כדוריות דם לבנות / לימפוציטים או תאי גידול, הגדרת microfluidic 3D הוא גם כלי מתאים ללמוד intravasation תאים סרטניים ומחסום אנדותל פונקצית 43.

למרות assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא כלי מתאים כדי לנתח את הנדידה של תאים בתגובה לגירוי או למעכב או לשילוב של שניהם זה חייב להיות ציין כי assay זה לעשות יש גם כמה מגבלות. לדוגמא, רק אני סוג קולגן משמש לחיקוי המטריצה ​​תאית, אשר, עם זאת, היא תערובת מורכבת ממספר רכיבים כוללים proteoglycans, שאינו proteoglycans (למשל, חומצה היאלורונית), סיבי קולגן, כמו גם פיברונקטין וlaminin וש הרכב משתנה במידה ניכרת נוסף בין רקמות חיבור שונות באיברים שונים 45 במקביל לתוצאת ההפרש. לדוגמא, גירוי β1-integrin נגרם הפעלה של Erk במונוציטים בעוד β2 גירוי לא עשה 46. כמו כן, PI3K נדרש לβ1-integrin-, אבל לא β2-integrin-, בתיווך הפעלת NF-κB 46. מצד השני, אני סוג קולגן הוא קולגן הנפוץ ביותר בגוף האדם 47 טוען כי ההגירה של תאים מופעלת בעיקר על ידי סוג קולגן זה.

עוד נקודה קריטית בפענוח פעילות נדידת התאים היא תהליך מעקב תא. כדי לקבל נתונים חוקיים ומטרתו היא חובה כי הדרך של תאים בודדים מנותחת בצורה מדויקת. מעקב תא מתבצע באופן ידני על ידי יד, הדורשת ניסיון מעקב תא ללקבל נתונים אובייקטיביים. כדי לשפר עוד יותר את הנתונים ולהימנע ממספר קריטי של תאים חיוביים כוזבים אנחנו משתמשים ברמת חתך של 25 מיקרומטר, מה שאומר שתאים, שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר הוצאו מניתוח הנתונים. כמו כן, תאים שנבחרו באקראי למעקב ללא ידיעה אם הם נודדים פעילים או לא, כדי למנוע נתונים מוטים.

בתוך השנים האחרונות מספר יישומי תוכנת מעקב תא האוטומטי פותחו, לפיה חלקם מתאימים לניתוח תא ומעקב אחר חלקיקים ב3D הגדרת 18. היתרון של יישומים כגון הוא שתאים נודדים באמת מנותחים באופן אובייקטיבי. בגלל שזה יהיה מעניין להשוות את נתוני מעקב תא אוטומטיים עם נתוני מעקב התא באופן ידני מתוצרת.

כפי שצוין לעיל, הזהב סטנדרטי לנתח נדידת תאים בהקשר פיסיולוגי 3D הוא השימוש של wi הדמיה intravital המשולבה 2-פוטון לייזר סריקה מיקרוסקופי confocal. היתרון של assay זה הוא שתאים נודדים מוטבעים בתוך סביבתם הפיזיולוגית המורכבת של גורמים ספציפיים מסיסים, הורמונים, וכו ', רכיבי מטריצה ​​תאיים, כמו גם אינטראקציות תא אל התא. זה מדהים לראות סרטים שמראים איך לימפוציטים הם סחר בתוך בלוטה לימפה 17, כיצד תאים חיסוניים מתקשרים עם כל 48 או אחרים איך סמים מופצים in vivo ברמת תא בודד 12,49.

עם זאת, בשילוב ההדמיה intravital עם מיקרוסקופיה confocal לייזר הסריקה 2 פוטון היא טכניקה ולא עלות יקרה בשל הצורך של מיקרוסקופ מתאים ומודלים של בעלי חיים מתאימים. כמו כן, זה לא ממש מתאים ללמוד את השפעתם של גורמים / מעכבים מסיסים יחידים בנדידה של תאים מסוימים או הניתוח של מפלים הולכים אותות נדידת תאים הקשורים. למיל תא מטרות אלהמבחני הגירה מומלצים המאפשרים הניתוח של סוגים דיסקרטיים תא, אשר עשוי להיות שונה עוד יותר, למשל ביטוי יתר או מציאה של מולקולות מטרה, בתנאי ניסוי שהוגדרו. בגלל מערכת היחסים המרכזיות בין סביבת 3D והתנהגות locomotory של תאים אנו מסיקים כי assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא אפוא שיטה תכליתית ללמוד הנדידה של תאים בהגדרה במבחנה שקרובה למצב in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

הנדסת ביוטכנולוגיה גיליון 92 נדידת תאים מטריצת קולגן 3D מעקב סלולארי
ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter