Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक तीन आयामी मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर सेल प्रवास का विश्लेषण

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

सेल प्रवास ऐसी कैंसर जैसे घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और pathophysiological प्रक्रियाओं, के रूप में, शारीरिक के ढेर में शामिल है कि एक जैविक घटना है. 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख एक 3 डी शारीरिक तरह के माहौल में भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी गुणों का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है.

Abstract

विस्थापित करने की क्षमता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक बानगी है और भ्रूण विकास, घाव भरने, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हालांकि, सेल प्रवास भी फैल मेटास्टैटिक शुरू करने के लिए प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए इन कैंसर कोशिकाओं को सक्रिय करने के कैंसर में एक महत्वपूर्ण तंत्र है. पिछले कुछ वर्षों के भीतर विभिन्न सेल प्रवास assays के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है. कोशिकाओं की locomotory व्यवहार स्पष्ट रूप से एक दो आयामी (2 डी) के बीच अलग है और तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण यह एक 3 डी वातावरण के भीतर एम्बेडेड रहे हैं कि कोशिकाओं के प्रवास के विश्लेषण अधिक महत्वपूर्ण सेल प्रवास में उपज होता है कि माना जा सकता है क्योंकि डेटा. वर्णित 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख का लाभ कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स के प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व कोलेजन फाइबर की एक शारीरिक 3D नेटवर्क के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. के कारणसमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी वास्तविक सेल प्रवास समर्थक प्रवासी कारकों या अवरोधकों के जवाब में कई माइग्रेशन मापदंडों के साथ ही उनके परिवर्तन के निर्धारण की अनुमति मापा जाता है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं, लिम्फोसाइटों / leukocytes सहित, इस तकनीक का उपयोग स्टेम विश्लेषण किया जा सकता है. इसी तरह, यह भी सेल समूहों या spheroids कोलेजन जाली में सेल क्लस्टर / अंडाकार आकृति से एकल कक्षों के उत्प्रवास के विश्लेषण के साथ मैट्रिक्स कोलेजन सहवर्ती भीतर एम्बेडेड जा सकता है. हम 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख एक मनोवैज्ञानिक की तरह 3 डी वातावरण के भीतर कोशिकाओं के पलायन का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी विधि है कि समाप्त.

Introduction

सेल संलयन (एक सिंहावलोकन के लिए 1,2 देखें) सेल प्रवास भ्रूण विकास, घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (समीक्षा के लिए 3 देखें) सहित शारीरिक प्रक्रियाओं के ढेर में शामिल है कि एक और जैविक घटना है की तरह. हालांकि, विस्थापित करने की क्षमता ट्यूमर कोशिकाओं (समीक्षा के लिए 3,4 देखें) metastasize करने के लिए एक शर्त भी है.

सेल प्रवास, एक जटिल, विभिन्न ligand (जैसे, साइटोकिन्स, chemokines, वृद्धि कारक, हार्मोन, बाह्य मैट्रिक्स घटकों) रिसेप्टर (जैसे, रिसेप्टर tyrosine kinases द्वारा शुरू की कई संकेत पारगमन रास्ते के परस्पर क्रिया द्वारा निर्देशित है कि नहीं अभी तक पूरी तरह समझ प्रक्रिया है अंततः डे और फोकल आसंजन परिसरों की दुबारा जोड़ना और साथ actin cytoskeleton सहवर्ती के पुनर्गठन के कारण केमोकाइन रिसेप्टर्स, integrins) बातचीत 5 6 संकेत Integrin की मध्यस्थता.

इन विट्रो में कई और vivo सेल प्रवास assays में सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए परख 8-10, तीन आयामी (चिकित्सा Boyden कक्ष / transwell परख 7, खरोंच परख / घाव सहित, पिछले दशकों में विकसित किया गया है 3 डी) मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख 11 के साथ ही intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी (समीक्षा के लिए 12 देखें). इन सेल प्रवास assays के प्रत्येक पेशेवरों और विपक्ष, जैसे, के विषय में लागत और उपकरणों की जरूरत है, से निपटने या प्राप्त आंकड़ों की विश्वसनीयता है.

Boyden कक्ष / transwell परख और खरोंच परख / घाव भरने परख दोनों विट्रो 7-10 में सेल प्रवास को मापने के लिए आसान, कम लागत और अच्छी तरह से विकसित assays हैं. तथाकथित ऊपरी डिब्बे 7 - Boyden कक्ष में / transwell परख कोशिकाओं एक डालने वाले pores (लगभग 8 मीटर व्यास में) के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. वैकल्पिक, डालने कोशिकी मीटर के साथ लेपित किया जा सकता हैAtrix घटकों, जैसे, fibronectin, मज्जा, आदि, एक अधिक शारीरिक वातावरण नकल करने के लिए. इसी तरह, endothelial कोशिकाओं जिससे एक endothelial सेल बाधा 13 नकल उतार डालने के शीर्ष पर उगाया जा सकता है. ऐसे वृद्धि कारकों और chemokines के रूप में मीडिया और पूरक आहार, शरण कम डिब्बे में एक निर्धारित समय अंतराल के दौरान छिद्रों के माध्यम से पारित कर दिया है कि उन कोशिकाओं, सेल प्रवास (या तरल पदार्थ का स्त्राव) यों एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में उपयोग किया जाता है.

खरोंच परख में / घाव भरने परख कोशिकाओं प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और confluency 10 हो गई हैं. प्रयोगात्मक सेटिंग प्लेटों की निर्भरता में ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है. खरोंच के प्रत्येक पक्ष से सेल monolayer एकल कक्षों scraping द्वारा घाव एक खरोंच / बनाने के बाद / घाव है, जिससे यह 10 चिकित्सा / भरने, खाई में माइग्रेट कर सकते हैं. खरोंच / घाव के दो पक्षों के बीच की दूरी निर्धारित किया जाता हैसमय की निर्भरता में और कोशिकाओं 10 के प्रवासी गतिविधि के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि, यह समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और एकल कक्ष 10 पर नज़र रखने के साथ परख गठबंधन करने के लिए सिफारिश की है और सेल प्रवास (भी खरोंच / घाव के भरने / उपचार में परिणाम सकता है) सेल प्रसार के बीच विभेद करने के लिए.

हालांकि, Boyden कक्ष / transwell परख और परख चिकित्सा खरोंच परख / घाव दोनों, एक शारीरिक तरह सेलुलर पर्यावरण के विषय में नहीं बल्कि अपूर्ण हैं. Boyden कक्ष में / transwell परख कोशिकाओं खरोंच में परख कोशिकाओं चिकित्सा परख / घाव एक दो आयामी पूर्व लेपित प्लास्टिक प्लेट पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जबकि एक प्लास्टिक ताकना के माध्यम से विस्थापित करने के लिए है. इसी तरह, यह अच्छी तरह से प्रवासी व्यवहार एक दो आयामी और 3 डी वातावरण के बीच 3 अलग किस्म कि मान्यता प्राप्त है. उदाहरण के लिए, fibroblasts की तीन आयामी मैट्रिक्स adhesions दो पर विशेषता फोकल और तंतुमय adhesions से अलगα5β1 और αvβ3 integrins, paxillin, अन्य cytoskeletal घटक है, और फोकल आसंजन kinase 14 के tyrosine फास्फारिलीकरण की उनकी सामग्री में -dimensional substrates. इसी तरह, एक 3 डी वातावरण के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं को भी एक बदल प्रवासी व्यवहार 15 का प्रदर्शन किया. इस प्रकार अधिक सही सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवास परख एक 3 डी शारीरिक या शारीरिक तरह पर्यावरण के भीतर एकल कक्षों के प्रवास को मापने के लिए अनुमति सिफारिश की है.

Intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी एक 3 डी शारीरिक संदर्भ में सेल प्रवास को मापने के लिए सोने का मानक है. यह केवल आज तक, की वजह से संभव हो सकता है, जो भी है लेकिन इस तरह के लिम्फ नोड 17, भीतर तरल पदार्थ का स्त्राव 16 या लिम्फोसाइट तस्करी के दौरान ट्यूमर कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत के लिए, बाह्य मैट्रिक्स सेल बातचीत से संबंधित नहीं है इस तरह के 2 फोटॉन के रूप में सुधार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक,लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेरिवेटिव 12,16,17 व्यक्त महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों और ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग. साथ ही, intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी मैनुअल और स्वचालित सेल 18 पर नज़र रखने के साथ जोड़ा जा सकता है. हालांकि, क्योंकि एक 2 फोटॉन लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग की जरूरत है और साथ ही जानवरों (और उपयुक्त ट्रांसजेनिक पशु मॉडल) के intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी एक नहीं बल्कि लागत गहन तकनीक है.

Boyden कक्ष / transwell परख और खरोंच परख / घाव भरने परख की सीमाओं को पार करने के लिए और 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख 11,19 विकसित किया गया था एक 3 डी वातावरण में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के पलायन का विश्लेषण करने के लिए. इस प्रकार, पलायन कोशिकाओं एक 3 डी कोलेजन फाइबर नेटवर्क, जो इन विवो को अधिक जैसा दिखता स्थिति के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. एकसाथ, समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी वास्तविक सेल प्रवास के कारण determi की अनुमति मापा जाता हैकई माइग्रेशन मापदंडों के साथ ही समर्थक प्रवासी कारकों या अवरोधकों के जवाब में उनके परिवर्तन की राष्ट्र. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं लिम्फोसाइटों और leukocytes 11,20, hematopoietic स्टेम / 21-24 पूर्वज कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं 5,25-29 सहित इस तकनीक का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा सकता है. एकल कक्षों के अलावा भी समूहों सेल या spheroids 30,31 जाली कोलेजन में सेल क्लस्टर / अंडाकार आकृति से एकल कक्षों के उत्प्रवास के विश्लेषण के साथ मैट्रिक्स कोलेजन सहवर्ती भीतर एम्बेडेड जा सकता है.

इन विवो स्थिति के करीब हैं कि परिणाम में उपज इन विट्रो विधि - इस प्रोटोकॉल एक 3 डी वातावरण में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक के बारे में एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रवासन मंडलों की 1. तैयारी

  1. मिश्रण जब तक मिश्रण और गर्मी से पिघल गया: एक पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली (1 1) तैयार करें. एक पेंट ब्रश का प्रयोग और पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली के 2-3 परतों आकर्षित (1: 1) आंकड़े 1 बी -1 डी के अनुसार कांच स्लाइड के बीच में मिश्रण.
    नोट: हम आम गिलास स्लाइड का उपयोग कर रहे हैं (76 x 26 x 1.0-1.5 मिमी (डब्ल्यू / डी / एच))
  2. ड्राइंग जबकि दृढ़ीभवन से बचने के लिए गिलास स्लाइड पर तेजी से पिघल पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण लागू करें. पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली परत लंबाई में लगभग 2-2.5 सेमी और चौड़ाई में 0.3-0.5 सेमी है सुनिश्चित करें. पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली परत की मोटाई के बारे में 0.1-0.15 सेमी होना चाहिए.
  3. जम पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण करने के लिए एक coverslip जोड़ें और दो ​​से तीन परतों मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण आयल (आंकड़े 1E, 1F) के साथ इसे सील. एक आम सेल प्रवास के प्रयोग के लिए 4-8 प्रवास कक्षों का प्रयोग करें. प्लेस प्रवास कक्षों मैंएक रैक में एक ईमानदार स्थिति N.

कोलेजन निलंबन सेल मिक्स की 2 तैयारी

  1. फसल (जैसे, 0.25% trypsin / EDTA के साथ) और ब्याज की कोशिकाओं गिनती. पूरा भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त मीडिया, एंटीबायोटिक दवाओं में कोशिकाओं Resuspend और पूरक आहार की सिफारिश की. 4-8 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब और 4-6 एक्स 10 4 कोशिकाओं (कोशिकाओं की कुल संख्या विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल के प्रकार पर निर्भर करता है) युक्त 20 μl सेल निलंबन को तैयार है और पूरा मीडिया के साथ 50 μl को भरने.
    नोट: अतिरिक्त यौगिकों (जैसे, वृद्धि कारक है, chemokines, inhibitors, आदि) सेल निलंबन को जोड़ रहे हैं. सेल निलंबन की अंतिम मात्रा 50 μl से अधिक नहीं है कि इस तरह के उचित स्टॉक समाधान का उपयोग करें.
  2. चार सेल प्रवास प्रयोगों के लिए 452 μl अंतिम कोलेजन निलंबन की कुल राशि तैयार करें. 50 μl 10x सदस्य (पीएच 5.1-5.5) और 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 27 μl (पीएच 9.0-9.5 जोड़ें) एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब को और अच्छी तरह से मिश्रण. तीव्र बैंगनी (पीएच 9.0-9.5) के लिए पीला, नारंगी से समाधान रंग बारी का निरीक्षण करें. 10x सदस्य / सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के लिए 375 μl तरल कोलेजन निलंबन जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. अंतिम कोलेजन निलंबन की पीएच के बारे में 7.5 होना चाहिए (एक हल्के बैंगनी रंग ने संकेत दिया).
    नोट: 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के पीएच की जाँच करें. पीएच के बारे में 7.5 जगह एक मशीन में एक खुले ढक्कन के साथ सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान है (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) सीओ 2 के साथ संतृप्त और पीएच (लगभग 9.0-9.5) में वृद्धि किया जाना है. कोलेजन निलंबन सेल मिश्रण का पीएच कोलेजन नेटवर्क की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है. यह बहुत कम है कोलेजन जाली सेल प्रवास प्रयोग के दौरान गिर जाएगा.
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, गोजातीय हिंद से तरल कोलेजन (पीएच 1.9-2.2) उपयोग (2.9-3.3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन, 95% कोलेजन प्रकार मैं, 5% कोलेजन प्रकार चतुर्थ). का उपयोग करते हुए आगे कोलेजन जाली तैयारी प्रोटोकॉल के उदाहरणऐसे सुअर या चूहे के रूप में अन्य स्रोतों से कोलेजन प्रकार मैं, 32,33 में दिए गए हैं. इस 1.67 मिलीग्राम / जाली की मिलीलीटर की अंतिम कोलेजन एकाग्रता बदल जाएगा के रूप में इस्तेमाल किया समाधान की मात्रा न बदलें. अधिक या कम कोलेजन एकाग्रता कोलेजन फाइबर का घनत्व और कोशिकाओं प्रवासी व्यवहार 34 के साथ सहवर्ती उन दोनों के बीच औसत दूरी पर एक प्रभाव है.
  3. 50 μl सेल निलंबन को अंतिम कोलेजन निलंबन की 100 μl जोड़ें और thoroughly.The अंतिम कोलेजन निलंबन (1.67 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन) मिश्रण थोड़ा चिपचिपा है. सही मात्रा में (100 μl) का स्थानांतरण करने के लिए, सेल निलंबन के लिए यह स्थानांतरित करने से पहले एक बार ऊपर और नीचे अंतिम कोलेजन समाधान पिपेट.
    नोट: कोलेजन निलंबन सेल मिश्रण पीएच मान 7.5 से बदल गया है 10x सदस्य / सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान और के साथ संयुक्त है एक बार कोलेजन फाइबर तुरंत भाजन लगते हैं.
  4. वें से अंतिम कोलेजन निलंबन सेल मिश्रण स्थानांतरणमाइग्रेशन कक्षों को ई प्रतिक्रिया ट्यूबों. धीरे उतना ही माइग्रेशन कक्ष (चित्रा 1H) के तल पर कोलेजन निलंबन सेल मिश्रण वितरित करने के लिए माइग्रेशन कक्ष टैप करें. एक रैक में एक ईमानदार स्थिति में माइग्रेशन कक्षों प्लेस और लगभग 30 मिनट के लिए सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) कोलेजन फाइबर के polymerization की अनुमति है.
  5. Polymerized कोलेजन जाली थोड़ा परेशान है लेकिन अभी भी हल्के बैंगनी रंग की जा रही है कि नोटिस. ब्याज की खुराक के साथ पूरा मध्यम या पूरा मध्यम के साथ माइग्रेशन कक्षों भरें और पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण (आंकड़े 1 मैं, 1J) के साथ माइग्रेशन चैम्बर सील.

3 रिकॉर्डिंग और सेल प्रवास का विश्लेषण

यह खंड पुस्तिका सेल ट्रैकिंग द्वारा समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और सेल प्रवास के विश्लेषण से सेल प्रवास की रिकॉर्डिंग का वर्णन है.

  1. माइक्रोस्कोप और खुर्दबीन मंच hea पर स्विचआतंकवाद. 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान को समायोजित करें. एक 10x उद्देश्य का प्रयोग करें. एक खुर्दबीन के नीचे प्रवास कक्ष प्लेस और देखने के क्षेत्र में लगभग 50 कोशिकाओं या अधिक ध्यान केंद्रित.
  2. एक बहु कैमरा वीडियो निगरानी सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग का उपयोग कर समय चूक मोड में रिकॉर्ड सेल प्रवास. उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त प्रारूप में सेल प्रवास फिल्मों को बचाने, "* .avi" या "* .mov". इस तरह के सेल प्रकार और प्रयोगात्मक शर्तों के रूप में, जानकारी का समर्थन करने वाले एक डेटाबेस के लिए सेल प्रवास फिल्म फ़ाइलों को लिंक.
    नोट: हम समय चूक में 0.75 सेकंड वास्तविक समय में 1 मिनट के बराबर होता है जिसका मतलब है कि 1:80 के समय चूक कारक, का उपयोग करने के लिए 2 घंटे के लिए लिम्फोसाइटों और HSPCs रिकॉर्डिंग कर रहे हैं. ट्यूमर कोशिकाओं को धीमी गति से आगे बढ़ कोशिकाओं रहे हैं और इस प्रकार 1 के समय चूक कारक का उपयोग कम से कम 16 घंटे के लिए दर्ज कर रहे हैं: 1800 (समय चूक में 0.5 सेकंड वास्तविक समय में 15 मिनट के बराबर होता है).
  3. ImageJ सॉफ्टवेयर प्लगइन्स की तरह एक उपयुक्त सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग, का उपयोग सेल प्रवास फिल्मों का विश्लेषण(एक सिंहावलोकन 18 में दी गई है). एक निष्पक्ष विश्लेषण के लिए यह कोशिकाओं सक्रिय है या नहीं प्रवासी हैं कि क्या कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से ज्ञान के बिना चयन किया जाएगा कि महत्वपूर्ण महत्व का है.
    नोट: हम स्वयं (नाभिक के लिए तैनात किया जाता है) माउस कर्सर के साथ सही ढंग से आगे बढ़ कोशिकाओं का पालन करके प्रयोग के अनुसार कम से कम 30 कोशिकाओं के रास्तों पर नज़र रखने के लिए एक स्वयं विकसित सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग का उपयोग कर रहे हैं. ट्रैकिंग, वहीं पर नज़र रखी कोशिकाओं की XY-निर्देशांक स्वतः खेतों में समय चूक मोड के अनुसार निर्धारित होते हैं. ट्यूमर कोशिकाओं के लिए XY-निर्देशांक (15 मिनट realtime के बराबर) प्रत्येक 0.5 सेकंड निर्धारित कर रहे हैं, जबकि लिम्फोसाइटों के लिए / HSPCs XY-निर्देशांक, (1 मिनट realtime के बराबर) प्रत्येक 0.75 सेकंड निर्धारित कर रहे हैं.
  4. एक ठेठ सेल प्रवास के प्रयोग के लिए सेल प्रति 60 XY-निर्देशांक के कुल निर्धारित करते हैं. यह ट्यूमर कोशिकाओं के लिए लिम्फोसाइटों / HSPCs और 15 घंटा वास्तविक समय के लिए 1 घंटा वास्तविक समय के बराबर है. एक "," एक सेल TW के बीच स्थानांतरित नहीं किया है कि इंगित करता हैओ समय अंक, एक "संख्यात्मक मूल्य" जबकि "पिक्सल" एक सेल 2 समय अंक (2A चित्रा) के बीच ले जाया गया है में दूरी को इंगित करता है.
    नोट: मैनुअल सेल ट्रैकिंग अनुभव की आवश्यकता है. विशेष रूप से तेजी पलायन कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मुश्किल हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार प्रदर्शनी पूरक कारकों से चालू किया जा सकता है कि एक विशिष्ट प्रवासी व्यवहार. ट्रैकिंग जबकि कोशिका विभाजन के मामले में बेतरतीब ढंग से ट्रैकिंग जारी रखने के लिए एक बेटी सेल का चयन करें. दृष्टि क्षेत्र से बाहर की ओर पलायन या ट्रैकिंग उपेक्षित नहीं कर रहे हैं, जबकि मरने, लेकिन विश्लेषण के लिए माना जाता है कि कोशिकाओं.

4 डेटा विश्लेषण

  1. जैसे एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग, एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करके सेल ट्रैकिंग डेटा का विश्लेषण.
    1. एक स्वयं बनाया गया स्प्रेडशीट टेम्पलेट में कच्चे डेटा (2A चित्रा) ट्रैकिंग सेल, कॉपी करके सेल ट्रैकिंग डेटा का विश्लेषण. का प्रतिनिधित्व, "संख्यात्मक मूल्यों 'का योग गुणाकुल दूरी एक सेल "माइक्रोन" में "पिक्सेल" कन्वर्ट करने के लिए एक सुधार कारक के साथ चले गए है.
    2. दो सेल प्रवास के मानकों का निर्धारण: और सक्रिय आंदोलन (आंकड़े -2 सी, 2 डी) के समय (माइग्रेशन दर के बराबर है) locomotory गतिविधि.
    3. गैर चलती कोशिकाओं के रूप में (झूठी पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए दहलीज स्तर) कम से कम 25 माइक्रोन चले गए हैं कि कोशिकाओं की पहचान. "," के साथ इन कोशिकाओं की "संख्यात्मक मूल्यों" बदलें.
      नोट: पैरामीटर "locomotory गतिविधि" (या प्रवास की दर) दो समय अंक (चित्रा 2 डी) के बीच चले गए हैं कि पता लगाया सेल आबादी की कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. एक "संख्यात्मक मूल्य" "," जबकि, एक चलती सेल के रूप में परिभाषित किया गया है एक गैर चलती सेल के रूप में परिभाषित किया गया है. पैरामीटर "सक्रिय आंदोलन के समय" (समय सक्रिय) एक सेल पुनः में चले गए है कुल समय का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता हैप्रेक्षण अवधि (चित्रा -2) की समय सीमा को आबादी. एक "संख्यात्मक मूल्य" "," एक सेल नहीं ले जाया गया है कि इंगित करता है, जबकि एक सेल, ले जाया गया है कि इंगित करता है. यह पैरामीटर आगे नहीं ले जाया गया है कि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. सांख्यिकीय महत्व और प्रदर्शन सेल प्रवास डेटा की गणना.
    1. मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग कोशिकाओं (माइग्रेशन दर) का मतलब locomotory गतिविधि के सांख्यिकीय महत्व की गणना. पी मूल्य <रूप में महत्वपूर्ण 0.05 पर विचार करें.
    2. XY-आरेख, BoxPlot आरेख, या एक बार चार्ट चित्र के रूप में कोशिकाओं का मतलब locomotory गतिविधि प्रदर्शित करें. एक बार चार्ट चित्र के रूप में या एक हिस्टोग्राम के रूप में इस तरह के सक्रिय आंदोलन या गति के समय के रूप में एक सेल आधारित डेटा, प्रदर्शन.
      नोट: चुना स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर आवेदन एक BoxPlot चार्ट या हिस्टोग्राम चार्ट उपकरण शामिल नहीं करता है, तो एक ऑनलाइन खोज उपयुक्त टीयू की तलाश के लिए किया जाना चाहिएtorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटर की मदद से सेल ट्रैकिंग के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख दोनों जनसंख्या आधारित पैरामीटर (जैसे, locomotory गतिविधि मतलब है) सहित विभिन्न सेल प्रवास मापदंडों और एकल कोशिका आधारित मानकों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है (जैसे, सक्रिय आंदोलन, गति, दूरी का समय चले गए). प्राप्त सेल ट्रैकिंग डेटा सेट, डाटा प्रोसेसिंग और डेटा प्रस्तुति का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिए गए हैं. डेटा फ़ाइल ट्रैकिंग सेल एक मेज (2A चित्रा) जैसा दिखता है. सेल प्रवास प्रयोग प्रति 30 कोशिकाओं ट्रैक किए गए हैं जिसके तहत प्रत्येक स्तंभ, एक नज़र रखी सेल के लिए खड़ा है. पंक्तियाँ एक सेल में ले जाया गया या नहीं दो समय बिंदुओं के बीच किया गया है कि क्या जानकारी है. "पिक्सेल" एक सेल में दूरी का प्रतिनिधित्व "संख्यात्मक मूल्यों", की राशि दो समय बिंदुओं के बीच ले जाया गया है, इस सेल चले गए है कुल दूरी है. यह एसी से गुणा किया जाता है"माइक्रोन" में "पिक्सेल" कन्वर्ट करने के लिए orrection कारक. कम से कम 25 माइक्रोन चले गए हैं कि कोशिकाओं झूठी पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए गैर चलती कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. प्रत्येक सेल की गति (माइक्रोन / मिनट) "प्रेक्षण अवधि के कुल समय (मिनट)" द्वारा "माइग्रेट कुल दूरी" विभाजित करके गणना की है.

सामान्यतः दो मापदंडों उपयोग किया जाता है कोशिकाओं की locomotory व्यवहार विशेषताएँ. सक्रिय आंदोलन (चित्रा -2) के समय एक सेल प्रेक्षण अवधि के भीतर चले गए है कुल समय का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि Locomotory गतिविधि (चित्रा 2 डी), विश्लेषण सेल की आबादी का मतलब locomotory गतिविधि (या प्रवास की दर) का प्रतिनिधित्व करता है. उत्तरार्द्ध पैरामीटर आगे नहीं ले जाया गया है कि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विश्लेषण के लिए दो सेल प्रवास मापदंडों का उपयोग करने के लिए कारण कोशिकाओं की locomotory गतिविधि विभिन्न द्वारा शुरू किया जा सकता है कि इस तथ्य को जिम्मेदार ठहराया हैNT तंत्र. , जैसे, एक वृद्धि कारक, सेल प्रवास "प्रेरित" कैसे कर सकते हैं तीन संभावनाएं हैं: एक) अधिक कोशिकाओं पलायन कर रहे हैं नियंत्रण की तुलना में, ख) नियंत्रण की तुलना में कोशिकाओं के बढ़ने की संख्या नहीं बदला है, लेकिन वृद्धि कारक इलाज कोशिकाओं इन कोशिकाओं को एक लंबे समय के लिए विस्थापित होगा जिसका मतलब है कि सक्रिय आंदोलन, का एक बढ़ा समय प्रदर्शन, और ग) का एक संयोजन एक) और ख).

चित्रा 2B में चित्र रेखाचित्र सक्रिय आंदोलन की locomotory गतिविधि और समय की गणना कैसे दिखाता है. इस उदाहरण में (चार स्वतंत्र प्रयोगों के बराबर है) 120 कोशिकाओं के प्रवासी गतिविधियों प्रदर्शित कर रहे हैं. प्रत्येक हीरे की एक सेल में कम से कम दो समय बिंदुओं के बीच ले जाया गया है कि इंगित करता है (चाहे सेल चले गए है दूरी की!). ग्रे लाइनों कोशिकाओं का विश्लेषण किया जनसंख्या चल रहा है और गैर चलती कोशिकाओं के होते हैं दिखाने के लिए कि इस चित्र को जोड़ा गया था. पैरामीटर "locomotory गतिविधि "हर समय बिंदु (चित्रा 2 डी) की निर्भरता में विश्लेषण सेल आबादी के locomotory गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, टी = 5 घंटा में 10% की एक locomotory गतिविधि टी = 4.45 घंटा और टी = 5 घंटा के बीच का विश्लेषण किया कोशिकाओं के 10% बढ़े हैं कि इंगित करता है. एक XY-चित्र के रूप में प्रदर्शित जब पैरामीटर locomotory गतिविधि का विश्लेषण सेल आबादी के dynamicity इंगित करता है. एक सेल की आबादी के locomotory गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए एक और संभावना BoxPlot चित्र (चित्रा 2 एफ) है.

"0" के सक्रिय एक समय एक सेल (चित्रा -2) स्थानांतरित नहीं किया है कि इंगित करता है जिससे पैरामीटर "सक्रिय आंदोलन के समय" (समय सक्रिय) एक सेल अवलोकन अवधि के दौरान ले जाया गया कुल समय, के लिए सहसंबद्ध है. कोशिकाओं के सक्रिय समय एक हिस्टोग्राम के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है.

EGFR / HER2 / पीएलसी γ1 और HER2 / HER3 / PI3K सिगनल की परस्पर क्रिया एक के लिए योगदानEGFR / HER2 / HER3 सकारात्मक स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 25 के प्रवासी फेनोटाइप. PI3K संकेत जिससे रिसेप्टर tyrosine kinases 35 से सक्रिय होने के लिए प्लाज्मा झिल्ली को इस एंजाइम की भर्ती, पीएलसी-1 के लिए एक लंगर अणु के रूप में कार्य करता है जो phosphatidyl-3,4,5-trisphosphate (PIP3), के उत्पादन के लिए आवश्यक है. केवल EGFR सकारात्मक एमडीए MB-468-NEO (एमडीए नव) स्तन कैंसर की कोशिकाओं की उत्तेजना निरंतर IP3 और sinusoidal कैल्शियम दोलनों 27 उत्पादन डेग के स्तर के साथ लंबी अवधि के पीएलसी γ1 tyrosine फास्फारिलीकरण सहवर्ती में हुई. इसके विपरीत, EGFR / HER2 सकारात्मक एमडीए MB-468-HER2 (एमडीए-HER2) स्तन कैंसर की कोशिकाओं का संकेत वजह से अल्पकालिक पीएलसी γ1 tyrosine सक्रियण और अल्पकालिक IP3 और डेग टर्नओवर 27 EGF उपचार के बाद आधारभूत क्षणिक कैल्शियम दोलनों प्रदर्शित कि HER2 अभिव्यक्ति अंतर पीएलसी γ1 कैनेटीक्स और संकेतन एक सहसंबद्ध था.

एमडीए-HER2 और एमडीए एन के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषणईओ स्तन कैंसर कोशिका लाइनों दोनों सेल लाइनों एक समान सहज locomotory गतिविधि का प्रदर्शन से पता चला कि (एमडीए-HER2: 23.0-28.9%, मंझला: एमडीए नव बनाम 26.7%: 19.3-24.4%, मंझला: 21.5%; आंकड़े 3A-3D ). एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की तुलना में (; सक्रिय पैरामीटर समय, प्रेक्षण अवधि के संबंध में एकल कक्षों के सक्रिय आंदोलन के समय का प्रतिनिधित्व, अनायास आगे बढ़ एमडीए-HER2 कोशिकाओं के एक से थोड़ा अधिक संख्या (चित्रा 3E 64%) का पता चला 53%, चित्रा 3F). 100 एनजी के साथ उत्तेजना / एमएल EGF दोनों सेल लाइनों की एक काफी वृद्धि हुई locomotory गतिविधि में हुई. EGF के प्रवासी गतिविधि एमडीए-HER2 30.4 करने के लिए उठाया इलाज - 35.2%, आगे बढ़ कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि (/ एमएल EGF एनजी 100 दोनों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था जो (मंझला 33.7% आंकड़े 3 ए, 3 सी),: नियंत्रण बनाम 81%: 64%) और सक्रिय आंदोलन का एक बढ़ा समय. उदाहरण के लिए, एमडीए-HER2 कोशिकाओं की मात्रा 40% की सक्रिय एक समय प्रदर्शन किया गया28% (100 एनजी / एमएल EGF) के लिए 20% (नियंत्रण) से वृद्धि हुई है. (; आंकड़े 3 बी, 3 डी मंझला 30.4%) EGF उत्तेजना पर समान डेटा प्रवासी गतिविधि 25.2-35.2 के लिए बढ़ा दिया गया था जो एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं, के लिए प्राप्त किया गया. एकसाथ, अधिक एमडीए नव कोशिकाओं EGF उत्तेजना के जवाब में माइग्रेट (100 एनजी / एमएल EGF: 66 नियंत्रण बनाम%: 53%) और एक स्थानांतरित कर समय सक्रिय पैटर्न (चित्रा 3F) का प्रदर्शन किया. उदाहरण के लिए, 60% की सक्रिय एक समय रखने कोशिकाओं की मात्रा स्पष्ट रूप से इलाज एमडीए नव कोशिकाओं (13%) की तुलना में EGF की उपस्थिति में 30% की वृद्धि हुई थी.

एमडीए-HER2 और पीएलसी γ1 अवरोध U73122 साथ एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं का उपचार कोशिकाओं (चित्रा 3 ए डी) के सहज और EGF प्रेरित प्रवास दोनों के निषेध में हुई. हालांकि, एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की तुलना में एमडीए-HER2 कोशिकाओं की सहज प्रवास पर U73122 की निरोधात्मक प्रभाव बल्कि उदारवादी था, लेकिन फिर भीमहत्वपूर्ण (नियंत्रण: 23.0-28.9%, मंझला: 26.7% बनाम 2 माइक्रोन U73122: 17.8-21.5%, मंझला: 20.0%; चित्रा -3 सी). सक्रिय पैरामीटर समय का विश्लेषण U73122 की उपस्थिति में गैर चलती कोशिकाओं की एक थोड़ी वृद्धि हुई राशि का पता चला (36% बनाम 2 माइक्रोन U73122: नियंत्रण 48%, चित्रा 3E). 30.4-35.2%, मंझला 33.7% बनाम 100 एनजी / एमएल EGF + 2 माइक्रोन U73122: 19.3-24.1%, मंझला 22.6 इसी प्रकार, U73122 उपचार / एमएल EGF एनजी एमडीए-HER2 स्तन कैंसर की कोशिकाओं का EGF प्रेरित माइग्रेशन (100 अवरुद्ध %; चित्रा -3 सी). अनुसार केवल U73122 इस निरोधात्मक प्रभाव बल्कि गैर चलती कोशिकाओं की वृद्धि हुई राशि के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था एमडीए-HER2 कोशिकाओं का इलाज किया, लेकिन नहीं एक बदल समय सक्रिय पैटर्न (चित्रा -3 सी) के लिए. वास्तव में, सक्रिय आंदोलन का एक बढ़ा समय की दिशा में एक मामूली बदलाव एमडीए-HER2 कोशिकाओं EGF और U73122 (चित्रा -3 सी) के साथ इलाज किया जा रहा पलायन में detectable था.

इसके विपरीत, 2 माइक्रोन U73122 साथ एमडीए नव कोशिकाओं का इलाज स्पष्ट रूप से 10.7% (मंझला: 9.3%, चित्रा 3F) को 5.6 की locomotory गतिविधि में कमी आई एक के परिणामस्वरूप मुख्य रूप से गैर चलती कोशिकाओं (नियंत्रण की वृद्धि हुई राशि के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था: 47% बनाम 2 माइक्रोन U73122: 79%; चित्रा 3F). / एमएल EGF एनजी गैर चलती कोशिकाओं की वृद्धि हुई राशि (100 करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, जो: इसी तरह, एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं का EGF प्रेरित प्रवास स्पष्ट रूप से 7.4% (4.8% मंझला): 1.1 करने U73122 द्वारा अवरुद्ध किया गया था 34 % बनाम 100ng / एमएल EGF + माइक्रोन U73122 2: 70%) और साथ ही एक कम समय सक्रिय पैटर्न (चित्रा 3F) के लिए.

चित्रा 1
सेल प्रवास कक्षों की तैयारी की 1. योजनाबद्ध अवलोकन चित्रा. (एई) एक सेल प्रवास चैम्बर एक पिघल paraffi के दो से तीन परतों ड्राइंग द्वारा तैयार किया जाता हैn मोम / पेट्रोलियम जेली एक गिलास स्लाइड पर मिश्रण. (च, छ) एक coverslip गयी और पिघल पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण के साथ बंद है. (एच) प्रवास चैम्बर कोलेजन सेल जोड़कर पीछा एक ईमानदार स्थिति में डाल दिया है निलंबन. इसके बाद, माइग्रेशन कक्ष कोलेजन सेल निलंबन भाजन करने की अनुमति एक इनक्यूबेटर में रखा गया है. (मैं, जम्मू) प्रवास चैम्बर मीडिया के साथ भरा और चौथे पक्ष में पिघल पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली मिश्रण के साथ बंद है. इसके बाद, माइग्रेशन कक्षों एक खुर्दबीन के नीचे रखा जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
सेल प्रवास डेटा विश्लेषण के 2 योजनाबद्ध अवलोकन चित्रा. (ए) सेल ट्रैकिंग डेटा फ़ाइल. गु60 समय बिंदुओं विश्लेषण कर रहे हैं जिससे 30 कोशिकाओं के ई प्रवासी गतिविधियों, प्रयोग प्रति निर्धारित किया जाता है. एक "," एक "संख्यात्मक मूल्य" सेल आंदोलन को इंगित करता है, जबकि एक सेल, दो बिंदु के बीच स्थानांतरित नहीं किया है कि इंगित करता है. (बी) के इस चित्र (ए) में प्रस्तुत आंकड़ों का एक योजनाबद्ध दृश्य है. प्रत्येक हीरे की एक दो समय बिंदुओं के बीच ले जाया गया है कि इंगित करता है; एक लाइन अब आंदोलन को इंगित करता है. ग्रे लाइनों सेल आबादी कोशिकाओं गैर चलती है और कोशिकाओं (जो, हालांकि, pauses बनाने के लिए) आगे बढ़ के होते हैं कि कल्पना करने के लिए शामिल किया गया था. (सी) समय सक्रिय आंदोलन की (समय सक्रिय) एक सेल है कुल समय का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है प्रेक्षण अवधि के कुल समय के संबंध में चले गए. 20% और 15 घंटे के कुल समय का सक्रिय एक समय यह सेल 3 घंटे के लिए कुल में ले जाया गया है कि इंगित करता है. यह पैरामीटर आगे 0% की सक्रिय एक समय के बराबर है जो गैर चलती कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (डी) (ई) वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण कोशिकाओं की locomotory गतिविधि एक BoxPlot चित्र के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
एमडीए-HER2 और एमडीए नव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की चित्रा 3 प्रतिनिधि सेल प्रवास डेटा. सेल, 2 माइक्रोन U73122 या एक सह के साथ 100 एनजी / एमएल EGF साथ इलाज किया गया दोनों की mbination. (ए, बी) एमडीए-HER2 (ए) और एमडीए नव (बी) के समय पर निर्भरता में कोशिकाओं की locomotory गतिविधि मतलब. (सी, डी) के लिए 2 घंटे का प्रतिनिधित्व मतलब locomotory गतिविधि के BoxPlot आरेख, 13 घंटा समय अंतराल एमडीए-HER2 (सी) और एमडीए नव (डी) कोशिकाओं ((ए, बी) में बार देखें). सांख्यिकीय महत्व मान Whitney- यू -test उपयोग कर की गणना की गई थी. *** = पी <0.001. (ई, एफ) एमडीए-HER2 (ई) और एमडीए नव (एफ) कोशिकाओं की सक्रिय समय के हिस्टोग्राम भूखंडों. 0% की सक्रिय एक समय कोशिकाओं अवलोकन अवधि के दौरान स्थानांतरित नहीं किया है कि इंगित करता है. एकसाथ, 20% की सक्रिय एक समय 15 घंटा का एक अवलोकन अवधि पर विचार, इन कोशिकाओं को 3 घंटे तक का समय के लिए चले गए हैं, जो इंगित करता है. दिखाया कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब हैं."खाली> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

विस्थापित करने की क्षमता ट्यूमर कोशिकाओं 4 की एक बानगी है. प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए और लगभग सभी कैंसर रोगियों की मृत्यु के मुख्य कारण हैं जो माध्यमिक घावों, बीज के लिए सक्षम नहीं होगा आसपास के संयोजी ऊतक ट्यूमर कोशिकाओं के माध्यम से विस्थापित करने की क्षमता के बिना. क्योंकि इस रिश्ते के कई अध्ययनों से कैंसर सेल प्रवास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. इन अध्ययनों के उद्देश्य कुशलता जिससे आई या मेटास्टेसिस गठन धीमा, ट्यूमर सेल प्रवास ब्लॉक कि उपन्यास लक्ष्य अणुओं और लक्ष्य रास्ते की पहचान है. ट्रिपल नकारात्मक स्तन के साथ रोगियों में एक बेहतर डूबने से मुक्त अस्तित्व के साथ संबद्ध किया गया है विवो 36 विट्रो में और में स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार मेटास्टैटिक को बाधित करने के लिए दिखाया गया है और जो किया गया है जो β ब्लॉकर्स, हो सकता है इस तरह के एक प्रयास के लिए एक उदाहरण कैंसर की कोशिकाओं को 37. हमने हाल ही में दिखा दिया है कि spontane से निकाली गई जो संकर कोशिकाओं,एक मानव स्तन उपकला कोशिका लाइन और एक मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन, लेकिन नहीं पैतृक कोशिकाओं के बीच ous संलयन घटनाओं, एक बढ़ा प्रवासी गतिविधि 26 से केमोकाइन CCL21 को जवाब दिया. CCL21 ट्यूमर (संकर) कोशिकाओं मेटास्टैटिक गुण 39,40 प्राप्त सकता है कि कैसे एक प्रक्रिया हो सकता है कि सेल संलयन, सुझाव स्तन 38 सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर के लिम्फ नोड मेटास्टेसिस गठन के साथ संबद्ध किया गया है.

3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख Boyden कक्ष / transwell परख और परख चिकित्सा खरोंच परख / घाव की तुलना में कई फायदे हैं. सबसे पहले, कोशिकाओं एक 3 डी शारीरिक पर्यावरण के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. ऊपर बाहर कहा गया है, कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार एक दो आयामी और 3 डी वातावरण 3,14,15 के बीच स्पष्ट रूप से अलग है. इस प्रकार यह एक 3 डी कोलेजन जाली के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार locom से vivo में स्थिति को और अधिक जैसा दिखता है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता हैएक दो आयामी सतह पर रेंगने कोशिकाओं की otory गतिविधि. दूसरे, कारण समय चूक वीडियो रिकॉर्डिंग करने के लिए यह विभिन्न सेल प्रवास मापदंडों का निर्धारण करने की अनुमति देता है जो एक निश्चित समय सीमा, पर कई कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए संभव है. इसके विपरीत, Boyden कक्ष / transwell परख में केवल उन कोशिकाओं कम डिब्बे में ले जाया गया है कि विश्लेषण के लिए माना जाता है. झिल्ली के शीर्ष पर, जैसे पलायन कर रहे हैं कि उन कोशिकाओं वे सक्रिय प्रवासी हैं, भले ही डेटा विश्लेषण में शामिल नहीं हैं.

3 डी मैट्रिक्स कोलेजन microfluidic उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है जो भी इस तरह के fibroblasts, कैंसर की कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और प्रवास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जो मध्य द्रव, नकल करते बाह्य मैट्रिक्स नकल उतार के अलावा , और mesenchymal स्टेम सेल 41. Haessler एट अल. का डाटा बीचवाला प्रवाह प्रतिशत बढ़ जाती है कि पता चलाकोशिकाओं 42 के बारे में 20% में migrational गति बढ़ जाती है और साथ ही प्रवासी बनने कि कोशिकाओं की. कोशिकाओं, जैसे, leukocytes / लिम्फोसाइट या ट्यूमर कोशिकाओं के chemotactic व्यवहार का अध्ययन करने के अलावा, एक 3 डी microfluidic सेटिंग ट्यूमर सेल intravasation और endothelial बाधा समारोह 43 अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण भी है.

3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख दोनों यह है की एक संयोजन एक प्रोत्साहन के लिए या एक अवरोध करने के लिए या के जवाब में कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण इस परख करना है कि ध्यान दिया जाना चाहिए हालांकि यह भी कुछ सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, केवल कोलेजन प्रकार मैं, हालांकि, के रूप में अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminin और जो रूप proteoglycans, गैर proteoglycans (जैसे, Hyaluronic एसिड), कोलेजन फाइबर, सहित कई घटकों का एक जटिल मिश्रण है जो बाह्य मैट्रिक्स, नकल उतार के लिए प्रयोग किया जाता है रचना आगे विभिन्न अंगों में विभिन्न संयोजी ऊतक के बीच स्पष्ट रूप से भिन्न होता है 45 सहवर्ती एक अंतर परिणाम के साथ अलग संकेत पारगमन Cascades की सक्रियता में हो सकता है जो विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स घटकों, पहचानने विभिन्न Integrin अणुओं दिखा रहे हैं. Β2 उत्तेजना 46 नहीं किया था, जबकि उदाहरण के लिए, β1-Integrin उत्तेजना monocytes में ERK की सक्रियता के कारण. इसी तरह NF-κB सक्रियण 46 मध्यस्थता, PI3K β1-integrin- के लिए आवश्यक था, लेकिन β2-integrin- नहीं. दूसरी ओर, कोलेजन प्रकार मैं कोशिकाओं के प्रवास मुख्यतः इस कोलेजन प्रकार से शुरू हो रहा है, सुझाव है कि मानव शरीर 47 में सबसे प्रचुर मात्रा में कोलेजन है.

कोशिकाओं प्रवासी गतिविधि का गूढ़ रहस्य में एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु सेल ट्रैकिंग प्रक्रिया है. वैध और उद्देश्य डेटा प्राप्त करने के लिए यह एकल कक्षों के पथ सही ढंग से विश्लेषण किया है कि अनिवार्य है. सेल ट्रैकिंग सेल ट्रैकिंग का अनुभव करने के लिए मांग है, जो हाथ, द्वारा मैन्युअल रूप से प्रदर्शन कर रहा हैउद्देश्य डेटा मिलता है. आगे डेटा में सुधार लाने और हम चले गए हैं जो कोशिकाओं, कम से कम 25 माइक्रोन डेटा विश्लेषण से बाहर रखा गया जिसका अर्थ है कि 25 माइक्रोन से एक कट ऑफ स्तर, का उपयोग कर रहे झूठी सकारात्मक कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या से बचने के लिए. इसी तरह, कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से वे पक्षपाती डेटा से बचने के लिए सक्रिय प्रवासी हैं या नहीं जानने के बिना पर नज़र रखने के लिए चुना जाता है.

उनमें से कुछ एक 3 डी में सेल और कण ट्रैकिंग 18 की स्थापना का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त हैं जिससे पिछले कुछ वर्षों के भीतर कई स्वचालित सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों, विकसित किया गया है. ऐसे आवेदनों का लाभ पलायन कोशिकाओं सही मायने में एक उद्देश्य तरीके से विश्लेषण कर रहे हैं कि है. यह मैन्युअल के बनाए सेल ट्रैकिंग डेटा के साथ स्वचालित सेल ट्रैकिंग डेटा की तुलना करने के लिए दिलचस्प होगा कि वजह से.

जैसा कि ऊपर कहा, सोने का मानक एक 3 डी शारीरिक संदर्भ में सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए intravital इमेजिंग संयुक्त वाई का उपयोग होता हैवें 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी. इस परख का लाभ पलायन कोशिकाओं उनके शारीरिक विशिष्ट घुलनशील कारकों, हार्मोन, आदि, बाह्य मैट्रिक्स घटकों से मिलकर पर्यावरण के साथ ही सेल करने वाली सेल बातचीत के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. यह लिम्फोसाइट प्रतिरक्षा कोशिकाओं एक दूसरे को 48 या साथ संवाद कर रहे हैं कि कैसे एक लिम्फ नोड 17, भीतर की तस्करी कर रहे हैं कि कैसे दिखा फिल्में देखने के लिए उल्लेखनीय है दवाओं एक एकल कोशिका स्तर 12,49 पर विवो में वितरित कर रहे हैं कि कैसे.

हालांकि, intravital इमेजिंग के कारण एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप और उपयुक्त पशु मॉडल की जरूरत के लिए 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ एक नहीं बल्कि लागत महंगी तकनीक है संयुक्त. इसी तरह, यह विशेष कोशिकाओं के प्रवास या सेल प्रवास संबंधी संकेत पारगमन Cascades के विश्लेषण पर एक घुलनशील कारकों / अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वास्तव में उपयुक्त नहीं है. इन उद्देश्यों सेल मील के लिएgration assays परिभाषित प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, आगे संशोधित किया जा सकता है जो असतत सेल प्रकार, जैसे overexpression या लक्ष्य अणुओं की पछाड़ना के विश्लेषण की अनुमति की सिफारिश की है. क्योंकि एक 3 डी वातावरण और कोशिकाओं की locomotory व्यवहार के बीच निर्णायक रिश्ते की हम 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख इस प्रकार इन विवो स्थिति के करीब है कि इन विट्रो सेटिंग में कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी विधि है कि समाप्त.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 92 सेल प्रवास 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन सेल ट्रैकिंग
एक तीन आयामी मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर सेल प्रवास का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter