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Bioengineering

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963

Summary

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。

Abstract

移行する機能は、さまざまな細胞型の特徴であり、胚発生、創傷治癒、および免疫応答を含むいくつかの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞遊走はまた、拡散、転移を開始するために、原発腫瘍から離脱するために、これらの癌細胞を有効癌における重要なメカニズムである。過去数年以内に、さまざまな細胞遊走アッセイは、異なる細胞型の移動挙動を分析するために開発されてきた。細胞の運動器官の挙動が顕著に2次元(2D)の間で異なり、3次元(3D)環境には、3D環境内に埋め込まれた細胞の遊走の分析は、より有意な細胞遊走をもたらすであろうと仮定することができるので、データ。記載された3Dコラーゲンマトリックス遊走アッセイの利点は、細胞が細胞外マトリックスの主要成分を表すコラーゲン繊維の生理3Dネットワーク内に埋め込まれていることである。のためにタイムラプスビデオ顕微鏡リアル細胞移動は、プロ遊走因子または阻害剤に応答して、複数の移行パラメータならびにそれらの変化の決定を可能に測定される。さまざまな細胞型、細胞、および腫瘍幹細胞、リンパ球/白血球を含む、この技術を用いて分析することができる。同様に、また、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子内細胞塊/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込むことができた。私たちは、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、生理状の3D環境内で細胞の移動を分析するための多様な方法であると結論する。

Introduction

細胞融合(概要については1,2を参照)細胞移動は、胚発生、創傷治癒および免疫応答(レビューのために3を参照)などの生理学的プロセスの過多に関与している他の生物学的な現象であるように。しかし、移行する機能は、腫瘍細胞が(レビューのために3,4を参照)転移するための前提条件でもある。

細胞遊走は、さまざまなリガンド( 例えば 、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックス成 ​​分)受容体( 例えば 、受容体チロシンキナーゼによって開始され、いくつかのシグナル伝達経路の相互作用によって導かれる複雑な、まだ完全に理解されていないプロセスであり、ケモカイン受容体、インテグリン)、最終的に脱6シグナリング焦点接着複合体及びインテグリン媒介の再組み立てとアクチン細胞骨格に付随の再編成を引き起こす相互作用5。

インビトロおよびインビボの細胞遊走アッセイにおけるいくつかの細胞遊走を分析するときはs = "jove_contentは">ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイ7、アッセイ8-10治癒スクラッチアッセイ/創傷、三次元(含む、過去数十年の間に開発されている3D)コラーゲンマトリックス遊走アッセイ11だけでなく、生体内イメージング/顕微鏡法(レビューのために12を参照)。これらの細胞遊走アッセイは、それぞれ長所と短所など 、関連コスト及び設備の必要性や操作、得られたデータの信頼性を有する。

Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイ双方は、 インビトロ 7-10 細胞遊走を測定するための簡単、低コスト、よく発達したアッセイである。いわゆる上部コンパートメント7 -ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは、細胞を、細孔(直径約8μm)を含むインサートの上に播種する。任意に、インサートは、細胞外メートルで被覆することができATRIXの成分、 例えば 、フィブロネクチン、コラーゲンなどが 、より生理的環境を模倣する。同様に、内皮細胞は、それによって内皮細胞障壁13を模倣し、インサートの上に成長させることができた。そのような成長因子及びケモカインなどのメディアやサプリメントを保有下部コンパートメントに定義された時間間隔の間に細孔を通過した細胞は、細胞移動(または溢出)を定量化するために読み出しとして使用される。

スクラッチアッセイに/創傷治癒アッセイ細胞をプレートに播種し、集密度10まで増殖させる。実験設定プレートに依存してフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分で予め被覆することができる。スクラッチの各側面から細胞単層単一細胞を掻き取ることにより巻き取らキズ/作成した後/傷は、それによって10ヒーリング/充填、隙間に移行することができます。スクラッチ/傷の両側の間の距離が決定される時間に依存して、細胞10の移動活性のための読み出しとして使用される。しかし、タイムラプスビデオ顕微鏡、単一細胞が10を追跡してアッセイを組み合わせることをお勧めしますし、細胞移動(スクラッチ/創傷の充填/治癒につながる可能性がある)、細胞増殖を区別します。

しかし、Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびアッセイ治癒スクラッチアッセイ/創傷の両方が、生理的に似た細胞環境に関するむしろ不完全である。スクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイで細胞を二次元の予備被覆プラスチックプレートに播種されているのに対し、ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは細胞は、プラスチック製の細孔を通って移動しなければならない。同様に、ウェル遊走挙動が二次元と三次元環境3との間で顕著に異なることが認識されている。例えば、線維芽細胞の三次元マトリックス接着は、2つに焦点を特徴と線維性癒着異なるα5β1およびαVβ3インテグリン、パキシリン、他の細胞骨格成分、および焦点接着キナーゼ14のチロシンリン酸化の含量での次元の基板。同様に、3D環境内に埋め込 ​​まれた細胞は、改変された回遊行動15を示した。このように、より正確に細胞遊走を分析する遊走アッセイは、3D生理学的または生理的に似た環境の中で、単一の細胞の移動を測定することができますお勧めします。

生体内イメージング/顕微鏡は、3D生理学的文脈の中で細胞移動を測定するためのゴールドスタンダードです。これは、現在までに、起因して可能なだけでなく、そのようなリンパ節17、内管外遊16またはリンパ球輸送中の腫瘍細胞および内皮細胞などの異なる細胞型間の相互作用、細胞外マトリックス-細胞相互作用に属していないこのような2光子などの改善された蛍光顕微鏡技術、共焦点レーザー走査顕微鏡検査、バイタル蛍光染料及び蛍光タンパク質誘導体の12,16,17を発現するトランスジェニックマウス株の使用。また、/顕微鏡生体内イメージングは、手動および自動細胞追跡18と組み合わせることができる。しかし、2光子共焦点レーザー走査顕微鏡を必要とするだけでなく、動物(および適切なトランスジェニック動物モデル)の生体内イメージング/顕微鏡検査は、かなりコストのかかる技術である。

Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイの限界を克服するために、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは11,19を開発した3D環境内の異なる細胞型の遊走を分析する。これにより、移動している細胞は、3Dコラーゲン線維ネットワーク、in vivoの状況により似ている内に埋め込 ​​まれている。相まって、タイムラプスビデオ顕微鏡実際の細胞移動に起因するがdetermiが可能測定され、いくつかの移行パラメータだけでなく、プロの渡り鳥因子または阻害剤に応答したその変化の国家。さまざまな細胞型は、リンパ球および白血球11,20、造血幹/前駆細胞が21〜24、および腫瘍細胞5,25-29含め、この技術を用いて分析することができる。単一細胞に加えて、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子30,31への細胞のクラスター/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込 ​​むことができた。

in vivoの状況に近い結果にもたらすインビトロの方法-このプロトコルは、3D環境内の異なる細胞型の回遊行動を分析するための簡単な、しかし強力な技術についての概要を説明します。

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Protocol

移行チェンバースの調製

  1. 混合物が溶融するまでミックスと熱:パラフィンワックス/石油ゼリー(1 1)を準備します。ペイントブラシを用いて、パラフィンワックス/石油ゼリーの2-3層描く(1:1)を図1B〜1Dに従ったガラススライドの中央に混ぜる。
    注:私たちは、共通のガラススライドを使用している(76×26×1.0〜1.5ミリメートル(W / D / H))
  2. 描きながら凝固を避けるために、スライドガラス上に急速に融解したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスを適用します。パラフィンワックス/石油ゼリー層は、長さが約2〜2.5センチメートル、幅0.3〜0.5センチメートルであることを確認してください。パラフィンワックス/石油ゼリー層の厚さは約0.1〜0.15センチメートルにする必要があります。
  3. 固化したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスにカバースリップを追加し、二から三層ワックス/石油ゼリーミックスパラフィン( 図1E、1F)でそれを封印。一般的な細胞遊走実験に4-8マイグレーションチャンバーを使用してください。移行チャンバiを置きますラックに直立位置がn。

コラーゲン懸濁細胞ミックスの調製

  1. 収穫( 例えば 、0.25%トリプシン/ EDTAを含む)と目的の細胞を数える。ウシ胎児血清(FCS)を含む培地、抗生物質、推奨サプリメント完全に細胞を再懸濁。 4-8 1.5ミリリットルの反応管と4-6×10 4個の細胞を(細胞の総数を分析する細胞型に依存します)を含む20μlの細胞懸濁液を準備し、完全培地で50μlに埋める。
    注:追加の化合物( 例えば 、成長因子、ケモカイン、阻害剤細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液の最終容量は50μLを超えないように、適切なストック溶液を使用する。
  2. 4つの細胞遊走実験のために452μlの最終的なコラーゲン懸濁液の総量を準備します。 50μlの10倍MEM(pHは5.1から5.5)および7.5%炭酸水素ナトリウム溶液の27μlの液(pH 9.0〜9.5を追加します。)1.5ミリリットルの反応チューブへと完全に混合する。強烈な紫色の液(pH 9.0〜9.5)に黄橙色から溶液の色ターンを観察します。 10倍MEM /重炭酸ナトリウム溶液に375μlの液体コラーゲン懸濁液を加え、完全に混合する。最終的なコラーゲン懸濁液のpHは約7.5であるべきである(光紫色で示​​されている)。
    注:7.5%重炭酸ナトリウム溶液のpHをチェックしてください。 pHは、CO 2で飽和させ、( - 9.5〜約9.0)のpHを増加させるインキュベーター内で開いた蓋(37°C、5%CO 2)で約7.5場所炭酸水素ナトリウム溶液である場合。コラーゲン懸濁液の細胞混合物のpHは、コラーゲン網の安定性のために重要である。それが低すぎると、コラーゲンラティスは、細胞遊走実験の間に崩壊する。
    注:このプロトコルでは、ウシの後肢から液体コラーゲン液(pH 1.9から2.2)を使用します(2.9から3.3 mg / mlのコラーゲンを95%のコラーゲンI型、5%のIV型コラーゲン)。使用してさらにコラーゲン格子調製プロトコルの例そのようなブタやラットなどの他のソースからのコラーゲンタイプIは、32,33に記載されている。これは1.67ミリグラム/格子の中の究極のコラーゲン濃度を変化させるように使用される溶液のボリュームを変更しないでください。より高いまたはより低いコラーゲン濃度は、コラーゲン繊維の密度及び細胞遊走挙動34に付随し、それらの間の平均距離に影響を与える。
  3. 50μlの細胞懸濁液に最終コラーゲン懸濁液100μlを加え、thoroughly.The最終コラーゲン懸濁液(1.67 mg / mlのコラーゲンは)わずかに粘性で混ぜる。正確な量(100μl)を転送するには、細胞懸濁液にそれを転送する前に、一度上下に最終的なコラーゲン溶液をピペット。
    NOTE:コラーゲン懸濁細胞ミックスをpH値が7.5に変更された10×MEM /重炭酸ナトリウム溶液と合わせられるとコラーゲン繊維を直ちに重合を開始する。
  4. 目から最終的なコラーゲン懸濁液の細胞ミックスを転送する移行チャンバに電子反応チューブ。静かに均等に遊走チャンバー( 図1H)の底部にコラーゲン懸濁液細胞ミックスを配布する遊走チャンバーをタップします。ラックに直立位置に移動室を置き、約30分間インキュベートする(37℃、5%CO 2)コラーゲン線維の重合を可能にする。
  5. 重合されたコラーゲン格子がわずかに濁っまだ薄紫色であることに注意してください。関心のあるサプリメントで完全培地または完全培地での移行室を記入し、パラフィンワックス/石油ゼリーミックス( 図1I、1J)と遊走チャンバーを密閉する ​​。

3。細胞移動の記録と解析

このセクションでは、手動の細胞追跡によるタイムラプスビデオ顕微鏡および細胞遊走の分析によって細胞移動の記録を記載している。

  1. 顕微鏡と顕微鏡ステージょんのスイッチを入れター。 37℃に温度を調整します。 10倍対物レンズを使用してください。顕微鏡下で遊走チャンバーを配置し、視野内の約50の細胞または複数の焦点を合わせる。
  2. マルチカメラビデオ監視ソフトウェアアプリケーションを使用して、タイムラプスモードのレコード細胞遊走。 たとえば 、適切な形式で細胞移動ムービーを保存して、 "*。aviファイル」や「a *のMOV」。このような細胞の種類や実験条件などの情報をサポート含むデータベースへの細胞移動のムービーファイルをリンクします。
    注:私たちはタイムラプス0.75秒、リアルタイムで1分に等しいことを意味1:80の経時係数を使用して、最大2時間、リンパ球およびHSPCsを記録している。腫瘍細胞は、動きの遅い細胞で​​あり、したがって、1の経時的ファクター使用して、少なくとも16時間が記録されています。1,800(タイムラプスにおいて0.5秒、リアルタイムで15分に等しい)。
  3. ImageJソフトウェアプラグインと同様に、適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーションを使用して、細胞移動の映画を分析する(概要は18に示されている)。公平な分析のために、細胞は、ランダムに細胞が遊走アクティブであるかどうか知らないうちに選択されることが決定的に重要である。
    注:私たちは、手動で(核に位置している)マウスカーソルを正確に移動する細胞に従うことによって、実験あたり少なくとも30個の細胞の経路を追跡するために、自社開発のソフトウェアアプリケーションを使用しています。追跡しながら、追跡セルのxy座標が自動的に使用タイムラプスモードに応じて決定される。腫瘍細胞についてのxy座標を(15分リアルタイムに等しい)各0.5秒決定されるのに対し、リンパ球について/ HSPCsのxy座標は、(1分リアルタイムに等しい)各0.75秒で決定される。
  4. 典型的な細胞遊走実験のため、細胞あたり60のxy座標の合計を決定します。これは、腫瘍細胞に対するリンパ球/ HSPCsおよび15時間、リアルタイムで1時間リアルタイムに等しい。 A "、"セルはtwの間で移動していないことを示しO時点、「数値」のに対し、「画素」セルが2の時点( 図2A)との間で移動した距離を示している。
    注:手動細胞追跡は経験が必要です。特に、高速移動する細胞を追跡するのが困難であり、各細胞型の展示を補充因子によって誘発され得る別個の遊走挙動。追跡しながら、細胞分裂の場合には、ランダムに追跡を継続するための1つの娘細胞を選択します。視界フィールドから移動またはトラッキングしながら、死ぬ細胞が無視されていませんが、分析のために考慮される。

4。データ解析

  1. 適切なソフトウェアアプリケーション、 例えば表計算プログラムを使用して、細胞追跡データを分析する。
    1. 自己設計されたスプレッドシートのテンプレートに、( 図2A)、生データを追跡するセルをコピーすることによって、細胞トラッキングデータを分析します。代表、「数値を "の合計を掛け総距離は、セルを「程度」に「ピクセル」を変換するための補正係数を移行しました。
    2. 運動器官の活性(移動速度に相当する)と、アクティブな動き( 図2C、2D)の時間:2細胞移動パラメータを決定します。
    3. 非移動細胞など(偽陽性細胞の数を減らすために、閾値レベル)より小さい25μm以下に移動した細胞を識別します。 」「これらの細胞の「数値」に置き換えます。
      注:パラメータ「運動器官の活性」(又は移動速度)は、二つの時点( 図2D)との間で移動した追跡された細胞集団の細胞の割合を表す。 」、「非移動細胞として定義されるのに対し、「数値」は、移動する細胞として定義される。パラメータ「活発な動きの時間」(時間アクティブ)は、細胞が再に移行した合計時間の割合を示し観察期間( 図2C)の時間枠に設置と。 「数値」は、「、」は、細胞が移動していないことを示し、一方、細胞は、移動したことを示している。このパラメータはさらに移動していない細胞の数を決定するために使用される。
  2. 統計的有意性を計算し、細胞移動データを表示する。
    1. マン·ホイットニーU検定を用いて細胞(移動速度)の平均運動器官の活性の統計的有意性を計算する。有意とp値<0.05を考えてみましょう。
    2. のxy図として細胞の平均運動器官の活動を表示し、箱ひげ図、またはバーチャート図など。棒グラフ図として、またはヒストグラムとして、そのような活発な動きや速度の時間のような単一の細胞ベースのデータを表示する。
      注:選択された表計算ソフトウェアアプリケーションは箱ひげ図やヒストグラムチャートツールが含まれていない場合は、オンライン検索は、適切なTUを探しているために実行する必要がありますtorials。

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Representative Results

タイムラプスビデオ顕微鏡およびコンピュータ支援細胞トラッキングと組み合わせた使用の3D-コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、集団ベースのパラメータ( 例えば 、運動器官の活動を意味する)と、単一のセルベースのパラメータの両方を含むさまざまな細胞移動のパラメータの決定を可能にする( 例えば 、活性運動の時間、速度、距離、移行)。得られた細胞追跡データセット、データ処理及びデータ提示の例を図2に示す。データファイルを追跡するセルがテーブル( 図2A)に類似している。細胞遊走実験あたり30細胞が追跡させ、それぞれの列は、1追跡セルの略です。行は、セルが2時点の間で移動したか否かの情報を含んでいる。 「画素」は、細胞における距離を表す「数値」の合計二つの時点の間で移動し、このセルが移動した総距離である。これは、交流を乗じて「程度」へ「ピクセル」を変換するためのorrection要因。より小さい25μm以下に遊走した細胞は、偽陽性細胞の数を減らすために、非移動細胞として定義される。各セルの速度(ミクロン/分)を「観察期間の合計時間(分)」と「マイグレーション総距離」を割ることによって計算される。

一般的に2つのパラメータが使用されている細胞の運動器官の挙動を特徴づけるために。アクティブな動き( 図2C)の時間は、細胞が観察期間内に移行した合計時間を表し、一方、運動器官の活性( 図2D)は 、分析された細胞集団の平均運動器官の活性(又は移動速度)を表す。後者のパラメータは、さらに、移動しなかった細胞の数を決定するために使用される。分析のための2つの細胞遊走パラメータを使用する理由は、細胞の運動器官の活性はdiffereによってトリガすることができるという事実に起因するntのメカニズム。 例えば 、成長因子は、細胞遊走を「誘発」する方法を三つの可能性がある:a)は、より多くの細胞が移行している対照と比較してであり、b)対照と比較して細胞の移動数が変化していないが、成長因子は、治療細胞はこれらの細胞がより長い時間に移行することを意味する活発な動き、の時間の増加を示し、およびc)の組合せa)およびb)。

図2Bの図は、模式的に活発な動きの運動器官の活動と時間の計算方法を示しています。 (この例では4つの独立した実験に等しい)120細胞の遊走活性が表示される。各ダイヤモンドは、細胞は、少なくとも二つの時点の間で移動したことを示す(細胞が移動した距離に関わらず!)。灰色の線は、細胞の集団が分析され、移動及び非移動細胞で構成されていることを示すためにこの図に添加した。パラメータ「LOCOMotory活性」は、各時点( 図2D)に依存して分析した細胞集団の運動器官の活動を表す。例えば、T = 5時間で10%の運動器官の活動は、t = 4.45時間とt = 5時間の間で分析した細胞の10%が移動していることを示しています。のxy図として表示された場合には、パラメータ運動器官の活動を分析した細胞集団の動的性を示している。細胞集団の運動器官の活動を表示するための別の可能性は、箱ひげ図2F)である。

パラメータ「アクティブ移動時」(時間アクティブ)は、細胞が観察期間中に移動した合計時間に相関する、 "0"のアクティブせる時間は、セルが( 図2C)に移動していないことを示している。セルのアクティブ時間をヒストグラムとして表示することができる。

EGFR / HER2 / PLC-γ1およびHER2 / HER3 / PI3Kシグナル伝達の相互作用はに貢献するEGFR / HER2 / HER3陽性乳癌細胞の遊走表現型25。 PI3Kシグナル伝達は、それによって、受容体チロシンキナーゼ35によって活性化される原形質膜へのこの酵素を動員、PLC-1のアンカー分子として作用ホスファチジルイノシトール三リン酸(PIP3)の生成のために必要とされる。単にEGFR陽性MDA-MB-468-NEO(MDA-NEO)乳癌細胞の刺激は、持続的なIP3および正弦カルシウム振動27を生成するDAGレベルの長期PLC-γ1チロシンリン酸化に付随もたらした。対照的に、EGFR / HER2陽性MDA-MB-468-HER2(MDA-HER2)乳癌細胞を示すによる短期PLC-γ1チロシン活性化および短期IP3およびDAGターンオーバー27にEGF処理後のベースライン過渡カルシウム振動を表示そのHER2発現は、差動PLC-γ1動態およびシグナル伝達に相関していた。

MDA-HER2およびMDA-Nの回遊行動の分析図3A-3Dは 、21.5%: - 28.9%、中央値- 23.0::MDA-NEO 26.7%19.3 24.4%、中央値EOの乳癌細胞株は、両方の細胞株は、同様の自発運動器官の活性(MDA-HER2を示したことを明らかにした)。 (MDA-NEO乳癌細胞と比較して、観察期間に関連する単一細胞の活発な動きの時間を表すアクティブパラメータ時間は、自発的に移動MDA-HER2細胞( 図3E 64%)のわずかに高い数を明らかにした53%; 図3F)。 100ng / mlのEGFによる刺激は、両細胞株の有意に増加した運動器官の活性をもたらした。 EGFの遊走活性は、MDA-HER2は30.4に上げ扱わ- 35.2%、移動細胞数の増加(/ mlのEGF 100ngの両方に起因するものであった(中央値33.7% 図3A、3C)、:コントロール 81%。 64%)と活発な動きの増加時。例えば、40%のアクティブ時間を示すMDA-HER2細胞の量であった28%(100ng / mlのEGF)、20%(対照)から増加した。 (; 図3B、3D中央値30.4%)EGF刺激による同様のデータが移動活性は、25.2から35.2に上昇させたMDA-NEO乳癌細胞、得られた。相まってEGF刺激に反応して、移行、より多くのMDA-NEO細胞(100ng / mlのEGF:制御 66%:53%)とシフトした時間アクティブパターン( 図3F)を表示。例えば、60%のアクティブ時間を有する細胞の量は顕著に未処理のMDA-NEO細胞(13%)と比較して、EGFの存在下で30%増加した。

PLC-γ1阻害剤U73122でMDA-HER2およびMDA-NEO乳癌細胞の治療は、細胞( 図3A-D)の自発的およびEGF誘導性遊走の両方の阻害をもたらした。しかし、MDA-NEO乳癌細胞と比較して、MDA-HER2細胞の自発的遊走に対するU73122の阻害効果は、むしろ中程度であったが、それでも有意な(コントロール:23.0から28.9パーセント、中央値:26.7% 2μMU73122:17.8から21.5パーセント、中央値:20.0%; 図3C)。アクティブなパラメータ時の分析は、U73122の存在下で動いていない細胞のわずかに増加した量を明らかにした(36% 2μMU73122:コントロール48%; 図3E)。同様に、U73122処理は、MDA-HER2乳癌細胞のEGF誘導性遊走(100ng / mlのEGFをブロックした:30.4から35.2パーセント、中央値33.7% 100ng / mlのEGF + 2μMU73122:19.3から24.1パーセント、中央値22.6を%、 図3C)。によれば、単にU73122は、この阻害効果はむしろ増加した非移動細胞の量ではなく、変更された時間アクティブパターン( 図3C)に起因するものであったMDA-HER2細胞を治療する。実際には、アクティブな動きの増加時に向けてわずかなシフトは、EGFおよびU73122( 図3C)で治療されているMDA-HER2細胞の移行において検出可能であった。

一方47%:主に動いていない細胞(対照の量の増加に起因していた;:、2μMU73122とMDA-NEO細胞の処理は、5.6から10.7パーセント( 図3F 9.3%、中央値)が著しく減少した運動器官の活性をもたらした 2100μMのU73122:79%; 図3F)。同様に、MDA-NEO乳癌細胞のEGF誘起遊走を著しく1.1から7.4パーセントにU73122によってブロックされた(中央値:4.8%)、非移動細胞(100ng / mlのEGFの量の増加に起因するものであった:34 % 100ngの/ mlのEGF +μMU73122 2:70%)と同様に減少した時間アクティブパターン( 図3F)へ。

図1
細胞遊走チャンバーの調製1。概略概要図。 (AE)細胞遊走チャンバーは、溶融したparaffi 2〜3層を引くことによって調製されるnはワックス/石油ゼリースライドガラス上に混ぜる。(F、G)をカバースリップを添加し、融解したパラフィンワックス/ワセリン混合物で封止されている。(H)遊走チャンバーは、コラーゲン-細胞を加えることにより、続いて直立位置に置かれるサスペンション。その後、移行チャンバは、コラーゲン-細胞懸濁液を重合させることインキュベーター内に配置される。(I、J)への移行チャンバはメディアを充填及び第4の側面において、溶融したパラフィンワックス/ワセリン混合物で封止されている。その後、移行チャンバは、顕微鏡下に置かれます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
細胞移動のデータ分析の2概略概要図。 (A)細胞追跡データファイル。のTh60時間点を分析することにより、30個の細胞の電子渡り鳥活動は、実験ごとに決定されます。 A "は、"「数値」は、細胞の動きを示すのに対して、細胞は、2点間で移動していないことを示す。(B)この図は、(A)に示されたデータの概略図である。各ダイヤモンドは、2つの時点の間で移動したことを示し;ラインが​​長い移動を示す。灰色の線は、細胞集団は、非移動細胞(ただし、一時停止をし、)移動細胞で構成されていることを視覚化するために含めた。(C)活発な動きの時間(時アクティブ)は、細胞が有する合計時間の割合を表す観察期間の合計時間との関係で移動した。 20%のアクティブ時間と15時間の合計時間は、このセルが3時間の合計に移動したことを示しています。このパラメータは、さらに、0%の活性時間と等価である非移動細胞の数を決定するために使用される。(D) 。(E)または、分析した細胞の運動器官の活性は、箱ひげ図として表示することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
MDA-HER2およびMDA-NEO乳癌細胞の図3の代表的な細胞遊走データ。細胞は、2μMU73122または同時で100ng / mlのEGFで処理した両方のmbination。(Aは、B)は、MDA-HER2(A)及びMDA-NEO(B)は、時間に依存して、細胞の運動器官の活性の平均(C、D)に2時間を表す平均運動器官の活動の箱ひげ図であり、 13時間の時間間隔は、MDA-HER2(C)及びMDA-NEOの(D)細胞((A、B)内のバーを参照)。統計的有意性は、マンホイットニーU Whitney- -testを用いて計算した。 *** = p <0.001。(E、F)MDA-HER2(E)及びMDA-NEO(F)細胞のアクティブ時間のヒストグラムプロット。 0%のアクティブ時間は、細胞が観察期間中に移動していないことを示している。相まって、20%の活性時間は15時間の観察期間を考慮すると、これらの細胞は、最大3時間移動したことを示している。少なくとも3つの独立した実験の平均値も示されている。"空白>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

移行する能力は、腫瘍細胞4の特徴である。原発腫瘍から剥離すると、周囲の結合組織の腫瘍細胞を通って移動する能力がなければ、ほぼすべての癌患者の死亡の主要な原因である二次病変を、シードすることはできません。このため、関係のため、多くの研究は、癌細胞の移動に焦点を当てている。これらの研究の目的は、効率良く転移形成を損なうまたは減速、腫瘍細胞の移動を遮断する新規の標的分子と標的経路の同定である。そのような努力の例は、転移性、インビトロおよびインビボ 36 乳癌細胞の広がりおよびトリプルネガティブ乳がんを有する患者において改善された無再発生存と関連しているどのを阻害することが示されている、遮断薬、βかもしれない癌細胞37。私たちは最近、spontaneに由来するハイブリッド細胞を、実証したヒト乳房上皮細胞株およびヒト乳癌細胞株ではなく、親細胞との間のOU融合事象は、増加した遊走活性26と、ケモカインCCL21に応答した。 CCL21は、細胞融合は、腫瘍(ハイブリッド)細胞が転移特性39,40を獲得することができるかのプロセスであり得ることを示唆している、乳房38を含む、さまざまな種類の癌のリンパ節転移の形成と関連している。

3Dコラーゲンマトリックス遊走アッセイは、Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびアッセイ治癒スクラッチアッセイ/創傷と比較していくつかの利点があります。第一に、細胞は、3D生理学的環境内に埋め込まれている。上記に述べたように、細胞の遊走挙動は、2次元と3次元環境3,14,15との間で著しく異なっている。したがって、三次元コラーゲン格子内に埋め込 ​​まれた細胞の遊走挙動がLOCOMよりインビボでの状況に対してより類似していると結論付けることができる2次元面でのクロールの細胞のotory活動。第2に、タイムラプスビデオ記録には、各種の細胞遊走パラメータの決定を可能にする特定の時間枠にわたって、いくつかの細胞の移動を分析することが可能である。これとは対照的に、ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイで細胞のみを下部コンパートメントに移動した分析のために考慮される。膜の上に、 例えば 、移行された細胞は、それらがアクティブな渡り鳥であっても、データ分析には含まれていません。

三次元コラーゲンマトリックスは、細胞外マトリックスを模倣する以外にも、線維芽細胞、癌細胞、内皮細胞などのさまざまな細胞型の形態学および遊走に影響を与えることが示された間質液を、模倣しないマイクロ流体デバイスと組み合わせることができる、および間葉系幹細胞41。 Haessler のデータは、間質の流れが割合が増加することを明らかにしたセル42の約​​20%に遊走速度を増加させるだけでなく、遊走となる細胞の。細胞、 例えば 、白血球/リンパ球または腫瘍細胞の走化性挙動を研究に加えて、三次元マイクロ流体設定は、腫瘍細胞の血管内および内皮バリア機能43を研究するため適切なツールである。

にもかかわらず、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、刺激または阻害剤、またはそれは、このアッセイはまた、いくつかの制限がないことに留意しなければならない両方の組み合わせに応答して細胞の移動を分析するのに適したツールである。例えば、唯一のコラーゲンタイプIは、しかしながら、プロテオグリカン、非プロテオグリカン( 例えば 、ヒアルロン酸)、コラーゲン繊維、ならびにフィブロネクチンおよびラミニン、どのを含むいくつかの成分の複雑な混合物である細胞外マトリックスを模倣するために使用され組成物はさらに、異なる器官中の異なる結合組織の間で顕著に変化する45付随差動転帰と異なるシグナル伝達カスケードの活性化をもたらし得る別の細胞外マトリックス成 ​​分を認識するさまざまなインテグリン分子を示す。 β2-刺激が46せなかった例えば、β1インテグリン刺激は、単球におけるERKの活性化を引き起こした。同様に、PI3Kは、β1-インテグリンのために必要とされたが、β2-インテグリンはない、NF-κB活性化46媒介 。一方、I型コラーゲンは、細胞の遊走は、主にこの型コラーゲンによって誘発されることを示唆している人間の体47の中で最も豊富なコラーゲンである。

細胞遊走活性を解読するのもう一つの重要な点は、細胞追跡法である。有効かつ客観的なデータを得るためには、単一細胞のパスを正確に分析することが必須である。細胞の追跡は細胞トラッキング経験を要求する手によって手動で行われている客観的なデータを取得する。データをさらに改善するために、私たちが移動した細胞は、より少ない25μm未満、データ分析から除外したことを意味し25μmのカットオフレベルを使用している偽陽性細胞の臨界数を回避すること。同様に、細胞はランダムにそれらがバイアスされたデータを避けるためにアクティブ渡り鳥であるかどうかを知らずに追跡するために選択される。

過去数年以内に、いくつかの自動化された細胞追跡ソフトウェアアプリケーションは、それらのいくつかは18を設定 、3Dでの細胞および粒子追跡を分析するのに適していることによって、開発されてきた。このようなアプリケーションの利点は、遊走する細胞が真に客観的に分析することである。それは手動で作られた細胞トラッキングデータとの自動化された細胞トラッキングデータを比較することは興味深いであろうとのため。

上述したように、3D生理学的コンテキスト内で細胞遊走を分析するためのゴールドスタンダードは、生体内イメージング組み合わせのWiの使用である第2光子レーザー走査共焦点顕微鏡。このアッセイの利点は、遊走する細胞は、それらの生理学的特定の可溶性因子、ホルモンなどの細胞外マトリックス成 ​​分からなる環境、ならびに細胞間の相互作用の中に埋め込 ​​まれていることである。これは、リンパ球が免疫細胞が互いに48またはと通信しているか、リンパ節17内に人身売買されている様子を示した動画を見ることが顕著である薬物は、単一細胞レベル12,49、生体内でどのように分布しているか。

しかしながら、2光子レーザー走査共焦点顕微鏡と組み合わせた生体内画像化に起因適切な顕微鏡及び適切な動物モデルの必要性にかなりのコスト高価な技術である。同様に、特定の細胞の遊走または細胞遊走に関連するシグナル伝達カスケードの分析上の単一の可溶性因子/阻害剤の影響を研究するために本当に適していない。これらの目的の細胞マイルのためgrationアッセイは、定義された実験条件で、さらに修飾することができる別個の細胞型、 例えば過剰発現または標的分子のノックダウンの分析を可能に推奨されている。そのため3D環境と細胞の運動器官挙動と極めて重要な関係のため私たちは、3Dコラーゲンマトリックス遊走アッセイは、このようにin vivoでの状況に近いインビトロ設定で細胞の遊走を研究するための汎用的な方法であると結論付けている。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

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References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

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バイオエンジニアリング、92号、細胞遊走、3Dコラーゲンマトリックス、細胞追跡
三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析
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Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

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