Summary
Cellmigration är ett biologiskt fenomen som är involverad i en plethora av fysiologiska, såsom sårläkning och immunsvar, och patofysiologiska processer, som cancer. Den 3D-kollagenmatrisen migration analysen är ett mångsidigt verktyg för att analysera de flyttande egenskaper hos olika celltyper inom en 3D fysiologisk-liknande miljö.
Abstract
Förmågan att migrera är ett kännetecken för olika celltyper och spelar en avgörande roll i flera fysiologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning och immunsvar. Dock är cellmigration också en viktig mekanism i cancer som möjliggör dessa cancerceller att lossna från den primära tumören att börja metastaser spridning. Under de senaste åren olika cellmigrations analyser har utvecklats för att analysera flyttbeteende olika celltyper. Eftersom motoriskt beteende celler markant skiljer mellan en tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) miljö kan det antas att analysen av migration av celler som är inbäddade i en 3D-miljö skulle ge mer betydande cell migration data. Fördelen med den beskrivna 3D kollagenmatrisen migration analysen är att cellerna är inbäddade i en fysiologisk 3D nätverk av kollagenfibrer som representerar den största delen av den extracellulära matrisen. På grund avtime-lapse video mikroskopi verkliga cellmigration mäts tillåter bestämning av flera migrationsparametrar samt deras förändringar som svar på pro-flyttande faktorer eller inhibitorer. Olika celltyper skulle kunna analyseras med användning av denna teknik, inklusive lymfocyter / leukocyter, stamceller och tumörceller. På samma sätt skulle också cellkluster eller sfäroider vara inbäddade i kollagenmatrisen samtidigt med analys av emigration av enskilda celler från cellkluster / sfäroid i kollagen gitter. Vi drar slutsatsen att den 3D kollagenmatrisen migration assay är en mångsidig metod för att analysera migration av celler inom en fysiologisk-liknande 3D-miljö.
Introduction
Som cellfusion (för en översikt se 1,2) cellmigration är ett annat biologiskt fenomen som är inblandad i en uppsjö av fysiologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning och immunsvar (för översikt se 3). Emellertid är förmågan att migrera också en förutsättning för tumörceller att metastasera (för översikt se 3,4).
Cellmigration är en komplex, ännu ej helt förstådd process som styrs av samspelet mellan flera signaltransduktionsvägar initieras av olika ligand (t.ex. cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer, hormoner, extracellulära matriskomponenter) receptor (t.ex. receptortyrosinkinaser, kemokinreceptorer, integriner) samspelet 5 slutligen orsakar en omorganisering av aktin cytoskelettet samtidig med de- och monteras ihop brännvidhäftnings komplex och grin-medierad signalering 6.
in vitro och in vivo cellmigrationsanalyser har utvecklats under de senaste decennierna, bland annat Boyden kammare / transwell analys 7, scratch test / sårläknings analys 8-10, tredimensionell ( 3D) kollagenmatris migrationsanalys 11 samt intravital imaging / mikroskopi (för översikt se 12). Var och en av dessa cellmigrationsanalyser har för-och nackdelar, t.ex. beträffande kostnader och behov av utrustning, hantering eller tillförlitlighet erhållna data.
Både Boyden kammare / transwell analys och scratch-analysen / sårläkningsanalysen är enkla, billiga och väl utvecklade analyser för att mäta cellmigration in vitro 7-10. I Boyden-kammare / Transwell analys celler ympas ovanpå ett insert innehållande porer (ca 8 ^ m i diameter) - den så kallade övre utrymmet 7. Valfritt, kan skäret vara belagd med extracellulära mAtrix komponenter, t.ex. fibronektin, kollagen, etc, för att efterlikna en mer fysiologisk miljö. Likaså skulle endotelceller odlas ovanpå insatsen, därigenom härma en endotelcell barriär 13. De celler som har passerat genom porerna under en definierad tidsperiod i det nedre facket hyser media och tillägg, såsom tillväxtfaktorer och kemokiner, används som en avläsning att kvantifiera cellmigration (eller extravasation).
I scratch-analysen / sårläkningsanalys celler ympas i plattor och odlas till sammanflytning 10. I beroende av de experimentella inställningsplattorna kan vara pre-belagd med extracellulära matriskomponenter, såsom fibronektin. När du har skapat en repa / sår genom att skrapa encellsskiktet enskilda celler från varje sida av repan / såret kan migrera in i gapet och därigenom fylla / läka det 10. Avståndet mellan de två sidorna av skrap / sår bestämsi beroende av tid och används som en avläsning för migrations aktiviteten av cellerna 10. Men att skilja mellan celltillväxt (som också kan leda till fyllning / läkning av repan / sår) och cellmigration rekommenderas att kombinera analysen med time-lapse video mikroskopi och enstaka cell tracking 10.
Men både Boyden kammare / transwell analys och repor analys / sårläknings analys är ganska ofullkomliga om ett fysiologiskt liknande cellmiljön. I Boyden-kammare / Transwell analys celler har att vandra genom en plast por, medan i scratch assay / sårläkningsanalys celler ympas på en två-dimensionell förbelagda plastplatta. Likaså är det väl känt att den flyttande beteende skiljer sig markant mellan en tvådimensionell och 3D-miljö 3. Exempelvis tredimensionell matris sammanväxningar av fibroblaster skiljer sig från fokala och fibrillära sammanväxningar karakteriseras på två-dimensionella substrat i sitt innehåll av α5β1 och aVp3 integriner, paxillin, andra cytoskelettala komponenter, och tyrosin fosforylering av fokal vidhäftnings kinas 14. Likaså celler inbäddade i en 3D-miljö visas också en förändrad vandrande beteende 15. Således för att analysera cellmigration mer exakt en migrations analys rekommenderas gör det möjligt att mäta migration av enskilda celler i en 3D-fysiologiska eller fysiologisk-liknande miljö.
Intravital imaging / mikroskopi är guld-standarden för mätning av cellmigration i ett 3D fysiologiskt sammanhang. Detta innebär inte bara hör till extracellulära matrix-cell-interaktioner, men också att samspelet mellan olika celltyper, såsom tumörceller och endotelceller under extravasering 16 eller lymfocyter människohandel inom lymfkörteln 17, som hittills är möjligt på grund av förbättrade fluorescensmikroskopiska tekniker, såsom 2-fotonkonfokal laserscanningsmikroskopi, användning av vitala fluorescerande färgämnen och transgena musstammar uttrycker fluorescerande proteiner derivat 12,16,17. Dessutom kan intravital imaging / mikroskopi kombineras med manuell och automatiserad cell tracking 18. Men på grund av behovet av en 2-foton konfokala laserskanning mikroskopi och djur (och lämpliga transgena djurmodeller) intravital imaging / mikroskopi är en ganska kostnadskrävande teknik.
För att övervinna begränsningarna i Boyden kammar / transwell analys och scratch-analysen / sårläkningsanalysen och att analysera migration av olika celltyper i en 3D-miljö kollagenmatris migrationsanalysen 3D utvecklades 11,19. Därigenom är migrerande celler inbäddade i en 3D kollagenfibernätet, vilket fler liknar i in vivo situationen. Conjointly, på grund av tidsförlopp video mikroskopi verkliga cellmigration mäts tillåter Bestämningnation av flera migrationsparametrar samt deras förändringar som svar på pro-flyttande faktorer eller inhibitorer. Olika celltyper skulle kunna analyseras med användning av denna teknik, inklusive lymfocyter och leukocyter 11,20, hematopoietiska stam / progenitorceller 21-24, och tumörceller 5,25-29. Förutom enstaka celler också cell kluster eller sfäroider kan vara inbäddade i kollagenmatrisen samtidigt med analys av emigration av enskilda celler från cellkluster / sfäroid i kollagen lattice 30,31.
Detta protokoll innehåller en översikt om en enkel, men kraftfull teknik för att analysera flyttbeteende olika celltyper i en 3D-miljö - en in vitro metod som ger i resultat som är nära den in vivo situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av migrations Chambers
- Förbered en paraffin / vaselin (1: 1) mix och värm tills blandningen har smält. Med hjälp av en paint-pensel och dra 2-3 skikt av paraffin / vaselin (1: 1) Blanda i mitten av glasskivan enligt fig 1B-1D.
OBS: Vi använder vanliga glasskivor (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) - Applicera den smälta paraffin / vaselin mix snabbt på glasskiva för att undvika stel medan du ritar. Säkerställa paraffin / vaselin skiktet är ungefär 2 till 2,5 cm i längd och från 0,3 till 0,5 cm i bredd. Tjockleken av paraffin / vaselin skiktet bör vara ca 0,1 till 0,15 cm.
- Lägg ett täckglas till den stelnade paraffin / vaselin mix och försegla den med 2-3 lager paraffin / vaselin mix (figur 1E, 1F). Använd 4-8 migrationskammare för en gemensam cell migration experiment. Placera migrationskammare In en upprätt position i ett ställ.
2 Beredning av kollagen Suspension Cell Mix
- Harvest (t.ex., med 0,25% Trypsin / EDTA) och räkna celler av intresse. Resuspendera cellerna i komplett medium innehållande fetalt kalvserum (FCS), antibiotika och rekommenderade tillskott. Förbered 4-8 1,5 ml reaktionsrör och 20 ^ il cellsuspension innehållande 4-6 x 10 4 celler (det totala antalet av celler beror på den celltyp som skall analyseras) och fyll upp till 50 | il med komplett medium.
OBSERVERA: Ytterligare föreningar (t.ex., tillväxtfaktorer, kemokiner, inhibitorer, etc.) tillsättes till cellsuspensionen. Använd lämpliga lagerlösningar så att den slutliga volymen av cellsuspension inte överstiger 50 ^. - Förbered ett totalt belopp på 452 l slutliga kollagen suspension fyra cellmigrationsexperiment. Lägg 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) och 27 pl av 7,5% natriumvätekarbonatlösning (pH 9,0 till 9,5) Till en 1,5 ml reaktionsröret och blanda väl. Observera lösningen färg turn från gul-orange till intensiv lila (pH 9,0-9,5). Lägg 375 l flytande kollagen suspensionen till 10x MEM / natriumbikarbonat och blanda väl. PH för den slutliga kollagensuspension bör vara ca 7,5 (indikeras av en ljuslila färg).
OBS: Kontrollera pH i 7,5% natriumbikarbonat. Om pH-värdet är ca 7,5 plats den natriumbikarbonatlösning med öppet lock i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) för att vara mättad med CO2 och öka pH (ca 9,0 till 9,5). PH hos kollagensuspension cellblandning är av avgörande betydelse för stabiliteten hos kollagen-nätverk. Om den är för låg kollagen gitter kommer att kollapsa under cellmigrationsexperiment.
OBS: För detta protokoll, använd flytande kollagen (pH 1,9-2,2) från nötkreatur hind (2,9-3,3 mg / ml kollagen, 95% kollagen typ I, 5% kollagen typ IV). Exempel på ytterligare kollagen gitter beredningsprotokoll som använderkollagen typ I från andra källor, till exempel från gris eller råtta, ges i 32,33. Ändra inte volymerna av de använda lösningarna eftersom detta kommer att förändra den ultimata kollagenkoncentration av 1,67 mg / ml gallret. En högre eller lägre kollagenkoncentration påverkar tätheten av kollagenfibrer och det genomsnittliga avståndet mellan dem samtidigt med cellerna flyttande beteende 34. - Tillsätt 100 l av den slutliga kollagen suspensionen till 50 l cellsuspension och blanda thoroughly.The slutliga kollagen suspension (1,67 mg / ml kollagen) är lätt viskös. För att överföra rätt belopp (100 l), pipett den slutliga kollagenlösningen en gång upp och ner innan den överförs till cellsuspensionen.
OBS: När kollagensuspensionen cellblandning kombineras med 10x MEM / natriumbikarbonat och pH-värdet har ändrats till 7,5 kollagenfibrerna börjar omedelbart att polymerisera. - Överför den slutliga kollagen fjädring cellblandningen från the reaktionsrören till migrationskamrarna. Knacka försiktigt på migrationskammaren för att lika fördela kollagensuspensionen cellblandningen på botten av migrationskammaren (figur 1H). Placera migrationen kamrarna i ett upprätt läge i ett ställ och inkubera i ca 30 min (37 ° C, 5% CO2) för att tillåta polymerisation av kollagenfibrerna.
- Lägg märke till att den polymeriserade kollagengitter är något grumlig, men fortfarande är ljust lila färg. Fyll migrations kammare med komplett medium eller komplett medium med tillskott av intresse och försegla migrationskammaren med paraffin / vaselin mix (Siffror 1I, 1J).
3 Registrering och analys av cellmigration
Detta avsnitt beskriver inspelningen av cellmigration genom tidsförlopp video mikroskopi och analys av cellmigration genom manuell cell spårning.
- Slå på mikroskopet och mikroskopet scenen heaTer. Justera temperaturen till 37 ° C. Använd ett 10X objektiv. Placera migrationskammare under ett mikroskop och fokusera ungefär 50 celler eller mer i synfältet.
- Record cell migration i tidsförlopp läge med en multi-kamera videoövervakning programvara. Spara cellmigrations filmer i lämpligt format, t.ex. "* avi" eller "* mov". Länka cellmigrationsfilmfiler till en databas som innehåller information till stöd, t.ex. celltyp och experimentella förhållanden.
OBS: Vi spelar in lymfocyter och HSPCs för upp till 2 timmar med hjälp av en time-lapse faktor 1:80, vilket innebär att 0,75 sek i tidsförlopp är lika med 1 min i realtid. Tumörceller är långsamma celler och därmed registreras under minst 16 timmar med hjälp av en time-lapse faktor på 1: 1,800 (0,5 sek i tidsförlopp är lika med 15 minuter i realtid). - Analysera cellmigrations filmer med ett lämpligt spårningscell program, som ImageJ programvara plugins(En översikt ges i 18). För en opartisk analys är det av avgörande betydelse att celler väljs ut slumpmässigt utan kunskap om cellerna är vandrande aktiva eller inte.
OBS: Vi använder en egenutvecklad programvara för att manuellt spåra stigar minst 30 celler per experiment genom att följa rörliga cellerna noggrant med muspekaren (som är placerad till kärnan). Medan spåra, är xy-koordinaterna för de spårade cellerna bestäms automatiskt i enlighet med den använda time-lapse-läge. För lymfocyter / HSPCs xy-koordinaterna bestäms varje 0,75 sek (lika med 1 min realtid), medan för tumörceller xy-koordinaterna bestäms varje 0,5 sek (motsvarar 15 minuter i realtid). - Bestäm totalt 60 xy-koordinaterna per cell för en typisk cell migration experimentet. Detta är lika med 1 timme i realtid för lymfocyter / HSPCs och 15 timmar i realtid för tumörceller. A "," att en cell inte har flyttats mellan two tidpunkter, medan en "numeriskt värde" anger avståndet i "pixlar" en cell har flyttat mellan två tidpunkter (Figur 2A).
OBS: spårning Manuell cell kräver erfarenhet. Särskilt snabbt migrerande celler är svåra att spåra och varje celltyp uppvisar en tydlig vandrande beteende som kan utlösas av kompletteras faktorer. Vid celldelning medan spåra, slumpmässigt välja en dottercell för fortsatt spårning. Celler som vandrar ut ur siktfältet eller dör medan spårning inte försummas, men anses för analys.
4. Data Analysis
- Analysera spårning cell data med hjälp av ett lämpligt program, t.ex. ett kalkylprogram.
- Analysera spårning cell uppgifter genom att kopiera cellen spåra rådata (Figur 2A), i ett egendesignade kalkylmall. Multiplicera summan av "numeriska värden", som representerarden totala sträckan en cell har migrerat med en korrektionsfaktor för att omvandla "pixel" i "um".
- Bestäm två cellmigrations parametrar: motoriskt aktivitet (vilket motsvarar migrationshastighet) och tid för aktiv rörelse (fig 2C, 2D).
- Identifiera de celler som har migrerat mindre än 25 um (tröskelnivå för att minska antalet falska positiva celler) som icke-rörliga celler. Ersätt "numeriska värden" av dessa celler med ",".
OBS: Parametern "motoriskt aktivitet" (eller migrationshastighet) representerar den procentuella andelen av celler i det bandcellpopulation som har flyttat mellan två tidpunkter (figur 2D). A "numeriskt värde" definieras som en rörlig cell, medan "," definieras som en icke-rörliga cellen. Parametern "tid av aktiv rörelse" (tid aktiv) representerar den procentuella andelen av den totala tiden en cell har migrerat i rening till tidsramen av observationsperioden (figur 2C). A "numeriskt värde" indikerar att en cell har flyttat, medan "," indikerar att en cell som inte har flyttats. Denna parameter används vidare för att bestämma antalet celler som inte har flyttat.
- Beräkna statistisk signifikans och cellmigrationsuppgifter display.
- Beräkna statistisk signifikans av medel motoriskt aktiviteten av celler (vandringshastighet) med användning av Mann-Whitney U test. Betrakta p-värde <0,05 som signifikant.
- Display medelvärdet motoriskt aktiviteten av celler som xy-diagrammet, Boxplot schema, eller som ett stapeldiagram schema. Display enstaka cellbaserade data, till exempel tidpunkten för aktiv rörelse eller hastighet, som ett stapeldiagram diagram eller som ett histogram.
OBS: Om det valda kalkyl programmet inte innehåller en boxplot diagram eller histogram grafverktyg en online-sökning bör utföras för att leta efter lämpliga tutorials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den använda 3D-kollagenanalysmatris migration i kombination med time-lapse video-mikroskopi och datorstödd spårningscell möjliggör bestämning av olika cellmigrationsparametrar inklusive både populationsbaserad parameter (till exempel, menar motoriskt aktivitet) och samlade cellbaserade parametrar (t.ex. tid för aktiv rörelse, hastighet, avstånd migrerat). Ett exempel på de erhållna spårning cell data, databehandling och presentation av data ges i figur 2. En cell tracking datafil liknar en tabell (Figur 2A). Varje kolumn står för en band cell, varvid per cell migration experiment 30 celler spåras. Raderna innehåller information om en cell har flyttat eller inte mellan två tidpunkter. Summan av "numeriska värden", som representerar avståndet i "pixel" en cell har flyttat mellan två tidpunkter, är den totala sträckan denna cell har migrerat. Det multipliceras med acorrection faktor för att omvandla "pixel" i "um". Celler som har migrerat mindre än 25 ^ m är definierade som icke-rörliga celler för att reducera antalet falska positiva celler. Hastigheten (pm / min) i varje cell beräknas genom att dividera "total distans migrerat" med "total tid (min) av observationsperioden".
För att karakterisera motoriskt beteende av celler vanligen två parametrar används. Motoriskt aktivitet (Figur 2D) representerar medelvärdet motoriskt aktivitet (eller vandringshastighet) i det analyserade cellpopulationen, medan tiden för aktiv rörelse (figur 2C) representerar den totala tiden i en cell har migrerat inom observationsperioden. Den senare parametern är vidare användas för att bestämma antalet celler som inte har flyttat. Anledningen till att använda två cellmigrations parametrar för analys tillskrivs det faktum att det motoriskt aktivitet hos celler kan utlösas genom different mekanismer. Det finns tre möjligheter hur, till exempel, en tillväxtfaktor, kan "framkalla" cell migration: a) i jämförelse med kontroll flera celler migrerar, b) antalet rörliga celler i jämförelse med kontrollen inte har förändrats, men tillväxtfaktor behandlad celler uppvisar en ökad tid av aktiv rörlighet, vilket betyder att dessa celler kommer att migrera för en längre tid, och c) en kombination av a) och b).
Diagrammet i figur 2B illustrerar schematiskt hur den motoriskt aktivitet och tid av aktiv rörelse beräknas. I detta exempel flyttverksamhet 120 celler (vilket är lika med fyra oberoende experiment) visas. Varje diamant visar att en cell har flyttat mellan minst två tidpunkter (oberoende av avståndet cellen har migrerat!). De grå linjerna sattes till detta diagram för att visa att den analyserade populationen av celler består av rörliga och icke-rörliga celler. Parametern "locomotory aktivitet "representerar den motoriskt aktiviteten hos det analyserade cellpopulationen i beroende av varje tidpunkt (figur 2D). Till exempel, en motoriskt aktiviteten 10% vid t = 5 h visar att mellan t = 4,45 tim och t = 5 h 10% av de analyserade cellerna har flyttats. Då visas som ett xy-diagram parameter motoriskt aktiviteten indikerar dynamik i det analyserade cellpopulationen. En annan möjlighet för att visa rörelsemässigt aktiviteten hos en cellpopulation är ett Boxplot schema (Figur 2F).
Parametern "tid av aktiv rörelse" (tid aktiv) är korrelerad till den totala tid en cell har flyttat under observationsperioden, varvid en tid aktiv av "0" indikerar att en cell som inte har flyttat (figur 2C). Tiden aktiva av cellerna kan visas som ett histogram.
Samspelet av EGFR / HER2 / PLC-γ1 och HER2 / HER3 / PI3K signalering bidrar till enflyttande fenotypen av EGFR / HER2 / HER3 positiva bröstcancerceller 25. PI3K-signalering krävs för alstring av fosfatidyl-3,4,5-trifosfat (PIP3), som fungerar som en förankringsmolekyl för PLC-1, och därigenom rekrytera detta enzym till plasmamembranet för att aktiveras av receptortyrosinkinaser 35. Stimulering av enbart EGFR positiva MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) bröstcancerceller ledde till långvarig PLC-γ1 tyrosinfosforyleringen samtidigt med bibehållen IP3 och DAG nivåer producerar sinusformade kalcium oscillationer 27. Däremot EGFR / HER2 positiv MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) bröstcancerceller visas baslinjen gående kalcium oscillationer efter EGF-behandling på grund av kortsiktiga PLC-γ1 tyrosin aktivering och kortsiktiga IP3 och DAG omsättningen 27 indikerar att HER2 uttryck var korrelerad till en differential PLC-γ1 kinetik och signalering.
Analys av flyttbeteende MDA-HER2 och MDA-NEO bröstcancer cellinjer visade att båda cellinjerna uppvisade en liknande spontan motoriskt aktivitet (MDA-HER2: 23,0-28,9%, median: 26,7% mot MDA-NEO: 19,3-24,4%, median: 21,5%; fig 3A-3D ). Parametern tiden aktiva, vilket motsvarar tiden för aktiv förflyttning av enstaka celler i förhållande till observationsperioden, visade ett något högre antal spontant flyttar MDA-HER2-celler (64%, Figur 3E) jämfört med MDA-NEO bröstcancerceller ( 53%; Figur 3F). Stimulering med 100 ng / ml EGF resulterade i en signifikant ökad motoriskt aktiviteten hos båda cellinjerna. Den vandrande aktivitet EGF behandlade MDA-HER2 höjas till 30,4-35,2% (median 33,7%, Figur 3A, 3C), vilket tillskrevs både ett ökat antal rörliga celler (100 ng / ml EGF: 81% mot kontroll: 64%) och en ökad tid av aktiv rörelse. Till exempel, mängden av MDA-HER2-celler som uppvisar en tids aktiva av 40% varökat från 20% (kontroll) till 28% (100 ng / ml EGF). Liknande data erhölls för MDA-NEO bröstcancerceller, som flyttande aktiviteten ökade till 25,2 till 35,2 (median 30,4%, Figurer 3B, 3D) vid EGF-stimulering. Conjointly, mera MDA-neo-celler migrerat som svar på EGF-stimulering (100 ng / ml EGF: 66% mot kontroll: 53%) och uppvisade en skiftad tid aktiv mönster (Figur 3F). Till exempel var den mängd av celler som har en tids aktiva av 60% markant ökade till 30% i närvaro av EGF jämfört med obehandlade MDA-neo-celler (13%).
Behandling av MDA-HER2 och MDA-NEO bröstcancerceller med hämmaren U73122 PLC-γ1 resulterade i en hämning av både spontana och EGF betingad migration av cellerna (Figur 3A-D). Men jämfört med MDA-neo bröstcancerceller den hämmande effekten av U73122 på spontan migration av MDA-HER2-celler var ganska måttlig, men inte desto mindresignifikant (kontroll: 23,0-28,9%, median: 26,7% mot 2 ^ M U73122: 17,8-21,5%, median: 20,0%; Figur 3C). Analys av parametern tid aktiv avslöjade en något ökad mängd av icke-rörliga celler i närvaro av U73122 (kontroll: 36% mot 2 uM U73122: 48%; Figur 3E). Likaså U73122 behandling blocke EGF inducerade migration av MDA-HER2 bröstcancerceller (100 ng / ml EGF: 30,4-35,2%, median 33,7% mot 100 ng / ml EGF + 2 ^ M U73122: 19,3-24,1%, median 22,6 %; figur 3C). I enlighet med enbart U73122 behandlade MDA-HER2 celler denna hämmande effekt var snarare hänföras till en ökad mängd av icke-rörliga celler, men inte en förändrad tid aktiv mönster (figur 3C). Faktum är att en viss förskjutning mot en ökad tid för aktiv rörelse kunde detekteras i migrera MDA-HER2-celler som behandlas med EGF och U73122 (figur 3C).
Däremot, Behandling av MDA-NEO celler med 2 ^ M U73122 resulterade i en markant minskad motoriskt aktivitet 5,6-10,7% (median: 9,3%; Figur 3F) som i första hand tillskrevs en ökad mängd icke-rörliga celler (kontroll: 47% vs 2 uM U73122: 79%; Figur 3F). Likaså EGF inducerade migration av MDA-NEO bröstcancerceller markant blockerad av U73122 till 1,1-7,4% (median: 4,8%), vilket tillskrevs en ökad mängd av icke-rörliga celler (100 ng / ml EGF: 34 % mot 100 ng / ml EGF + 2 ^ M U73122: 70%) samt en minskad tids aktiv mönster (Figur 3F).
Figur 1 Schematisk översikt av beredning av cellmigrationskammare. (AE) En cellmigrationskammaren framställes genom att rita 2-3 skikt av en smält paraffin vax / vaselin blanda på en glasskiva. (F, G) En täckglas tillsätts och förseglas med smält paraffin / vaselin mix. (H) Migreringen kammaren sätts i en upprätt position, följt av tillsats av den kollagen-cell suspension. Därefter migrationskammaren placeras i en inkubator låta kollagen-cellsuspensionen att polymerisera. (I, J) är Migrations kammare fylld med media och förseglas med smält paraffin / vaselin mix på den fjärde sidan. Därefter migrationskammare placeras under ett mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Schematisk översikt av cellmigration dataanalys. (A) Cell spårning datafil. The flyttande verksamhet 30 celler bestäms per experiment, varvid 60 tidpunkter analyseras. A "," indikerar att en cell som inte har flyttat mellan två led, medan en "numeriskt värde" indikerar cellrörelse. (B) Detta diagram är en schematisk vy av data som presenteras i (A). Varje diamant visar att en har flyttat mellan två tidpunkter; en rad anger längre rörelse. De grå linjerna ingick att visualisera att cellpopulationen består av icke-rörliga celler och flytta celler (som dock gör pauser). (C) Tid för aktiv rörelse (tids aktiv) representerar den procentandel av den totala tiden en cell har migrerat i förhållande till den totala tiden av observationsperioden. En tid aktivt på 20% och en total tid på 15 timmar visar att denna cell har flyttat totalt 3 timmar. Denna parameter används vidare för att bestämma antalet icke-rörliga celler, vilket är ekvivalent med en tid aktiv av 0%. (D) (E) Alternativt kan motoriskt aktiviteten av de analyserade cellerna visas som en boxplot diagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa data cell migration av MDA-HER2 och MDA-neo-bröstcancerceller. Cellerna behandlades med 100 ng / ml EGF, 2 uM U73122 eller med en co mbination av båda. (A, B) Medelvärde motoriskt aktiviteten av MDA-HER2 (A) och MDA-NEO (B) celler i beroende till tid. (C, D) Boxplot schema över medelvärdet motoriskt aktivitet, som representerar den 2 h till 13 tim tidsintervall (se bar i (A, B)) av MDA-HER2 (C) och MDA-NEO (D) celler. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Mann-Whitney- U-test. *** = P <0,001. (E, F) Histogram kurvor för tiden aktiva av MDA-HER2 (E) och MDA-NEO (F-celler). En tid aktiv på 0% innebär att cellerna inte har flyttat under observationsperioden. Conjointly, en gång aktiv på 20% anger att, med tanke på en observationsperiod på 15 timmar, har dessa celler flyttat upp till 3 timmar. Visade är medelvärdet av åtminstone tre oberoende experiment.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att migrera är ett kännetecken för tumörceller 4. Utan möjligheten att lösgöra från den primära tumören och att migrera genom de omgivande bindväv tumörceller kommer inte att kunna ympa sekundära lesioner, som är den främsta orsaken till död av nästan alla cancerpatienter. På grund av detta förhållande många studier fokuserar på cancer cell migration. Syftet med dessa studier är att identifiera nya målmolekyler och målgrupp vägar som effektivt blockerar tumörcellmigration och därmed försämra eller bromsa metastasbildning. Ett exempel på en sådan insats kan vara β-blockerare, som har visat sig hämma metastaserad spridningen av bröstcancerceller in vitro och in vivo 36 och som har samband med en förbättrad skovfria överlevnaden hos patienter med trippelnegativ bröstcancer cancerceller 37. Vi har nyligen visat att hybridceller, vilka härrör från spontanegare fusionshändelser mellan en human bröst epitelial cellinje och en human bröstcancer cellinje, men ej i de parentala cellerna, svarade på kemokinen CCL21 med en ökad flyttande aktivitet 26. CCL21 har associerats med lymfkörtelmetastaser bildandet av olika cancertyper, inklusive bröst 38, vilket tyder på att cellfusion kan vara en process hur tumör (hybrid) celler skulle kunna förvärva metastatiska egenskaper 39,40.
3D kollagenmatrisen migrationsanalys har flera fördelar jämfört med den Boyden kammare / transwell analys och scratch-analysen / sårläknings analys. För det första är cellerna inbäddade i en 3D fysiologisk miljö. Som nämnts ovan, flyttbeteende celler skiljer sig markant mellan en tvådimensionell och 3D-miljö 3,14,15. Således kan man dra slutsatsen att flyttbeteende celler inbäddade i en 3D kollagen gitter liknar mer till situationen in vivo än locomotory aktivitet hos celler som kryper på en tvådimensionell yta. För det andra är det på grund av tidsförlopp videoinspelning möjligt att analysera migration av flera celler under en viss tid, vilket gör det möjligt att bestämma olika cellmigrationsparametrar. Däremot i Boyden kammare / transwell analys endast de celler anses för analys som har flyttat till det nedre facket. De celler som migrerar till exempel, på toppen av membranet är ej inkluderade i dataanalysen även om de är flytt aktiv.
3D kollagenmatrisen kan kombineras med mikrofluidanordningar, som förutom att härma den extracellulära matrisen gör också att efterlikna den mellanliggande fluiden, som har visats påverka morfologin och migration av olika celltyper, såsom fibroblaster, cancerceller, endotelceller och mesenkymala stamceller 41. Uppgifter om Haessler et al. Visade att interstitiell flödet ökar andelenav celler som blir flyttande samt ökar migrational hastighet i cirka 20% av cellerna 42. Förutom att studera kemotaxi beteende celler, t.ex. leukocyter / lymfocyter eller tumörceller, är en 3D mikroflödesinställning också ett lämpligt verktyg för att studera tumörcells intravasering och endothelial barriärfunktion 43.
Trots att 3D-analys kollagenmatrisen migration är ett lämpligt verktyg för att analysera den migrering av celler som svar på en stimulans eller en inhibitor eller en kombination av både det måste noteras att denna analys gör också har vissa begränsningar. Till exempel är endast kollagen typ I användes för att härma den extracellulära matrisen, vilket emellertid är en komplex blandning av flera komponenter, inklusive proteoglykaner, icke-proteoglykaner (t ex hyaluronsyra), kollagenfibrer, såväl som fibronektin och laminin och vilken sammansättning varierar dessutom kraftigt mellan olika bindväv i olika organ
En annan kritisk punkt i dechiffrera cellerna flyttande aktivitet är spårningscellförfarandet. För att få giltiga och objektiva data är det obligatoriskt att vägen av enskilda celler analyseras noggrant. Cell spårning utförs manuellt för hand, vilket kräver spårning cell erfarenhetfå objektiva data. För att ytterligare förbättra information och för att undvika en kritisk antal falskt positiva celler använder vi en cut-off nivå på 25 pm, vilket innebär att celler, som har migrerat mindre än 25 um uteslöts från dataanalys. På samma sätt är celler slumpmässigt utvalda för att spåra utan att veta om de är vandrande aktiv eller inte för att undvika partiska uppgifter.
Under de senaste åren flera automatiska spårningscell program har utvecklats, varvid en del av dem är lämpliga att analysera cell och spårning partikel i en 3D-inställning 18. Fördelen med sådana tillämpningar är att migrerande celler verkligen analyseras på ett objektivt sätt. På grund av att det skulle vara intressant att jämföra automatiserade spårning cell data med manuellt tillverkade spårningscell uppgifter.
Som nämnts ovan, till guldstandard analysera cellmigration i ett 3D fysiologiskt sammanhang är användningen av intravital avbildning kombinerat with 2-foton laserskanning konfokalmikroskopi. Fördelen med denna analys är att migrerande celler är inbäddade i deras fysiologiska miljön bestående av specifika lösliga faktorer, hormoner, etc., extracellulära matriskomponenter samt cell-till-cell-interaktioner. Det är anmärkningsvärt att se filmer som visar hur lymfocyter människohandel inom en lymfkörtel 17, hur immunceller kommunicerar med varandra 48 eller hur läkemedel fördelas in vivo vid en enda cell nivå 12,49.
Emellertid intravital avbildning i kombination med två-foton-laserscanning konfokalmikroskopi är en ganska kostnadseffektivt dyr teknik på grund av behovet av ett lämpligt mikroskop och lämpliga djurmodeller. Likaså är det inte riktigt lämpligt att studera inverkan av enstaka lösliga faktorer / inhibitorer på migration av speciella celler eller analys av cellmigrationsrelaterade signaltransduktion kaskader. För dessa ändamål cell miltionsanalyser rekommenderas att tillåta analys av diskreta celltyper, som kan vara ytterligare modifierade, t.ex. överuttryck eller knockdown av målmolekyler, i definierade experimentella förhållanden. På grund av den svängbara förhållandet mellan en 3D-miljö och motoriskt beteende av celler vi dra slutsatsen att den 3D kollagenmatrisen migrering analys är således en mångsidig metod för att studera migrationen av celler i en in vitro-miljö som är nära till in vivo-situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
