Summary
La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.
Abstract
La capacité de migrer est une caractéristique de divers types de cellules et joue un rôle crucial dans plusieurs processus physiologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, et les réponses immunitaires. Cependant, la migration cellulaire est également un mécanisme clé dans l'activation de ces cancers des cellules cancéreuses à se détacher de la tumeur primaire pour commencer la dissémination métastatique. Dans les dernières années, différents essais de migration cellulaire ont été développées pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules. Parce que le comportement locomoteur des cellules diffère nettement entre une à deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) l'environnement, il peut être supposé que l'analyse de la migration des cellules qui sont incorporées dans un environnement 3D donnerait à la migration cellulaire plus importante données. L'avantage de l'essai décrit à la migration de la matrice de collagène 3D est que les cellules sont incorporées dans un réseau 3D physiologique des fibres de collagène qui représentent la composante majeure de la matrice extracellulaire. Grâce àtime-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la détermination de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes / leucocytes, des cellules souches et des cellules tumorales. De même, aussi des amas de cellules ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène. Nous concluons que le dosage de migration 3D de la matrice de collagène est un procédé polyvalent pour analyser la migration des cellules au sein d'un environnement 3D physiologique analogue.
Introduction
Comme la fusion cellulaire (pour un aperçu, voir 1,2) la migration cellulaire est un autre phénomène biologique qui est impliqué dans une multitude de processus physiologiques tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires (pour revue, voir 3). Cependant, la capacité de migrer est également une condition préalable pour les cellules tumorales à métastaser (pour revue, voir 3,4).
La migration cellulaire est un complexe, pas procédé encore entièrement compris qui est dirigée par l'interaction de plusieurs voies de transduction du signal initié par divers ligand (par exemple, des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance, les hormones, les composants de la matrice extracellulaire) récepteur (par exemple, les kinases de tyrosine du récepteur, récepteurs de chimiokines, intégrines) 5 interactions provoquant finalement la réorganisation du cytosquelette d'actine concomitante ment et le remontage des complexes d'adhésion focale et l'intégrine-médiation de signalisation 6.
in vitro et in vivo de la migration des cellules ont été développés au cours des dernières décennies, y compris le test Boyden chambre / transwell 7, zéro dosage / cicatrisation dosage 8-10, en trois dimensions ( 3D) matrice de collagène migration dosage 11 ainsi que intravital imagerie / microscopie (pour revue, voir 12). Chacun de ces essais de migration cellulaire a des avantages et des inconvénients, par exemple, concernant les coûts et les besoins de l'équipement, de la manutention ou de la fiabilité des données obtenues.
Tant la chambre / test transwell Boyden et le / la cicatrisation dosage dosage de zéro sont, à faible coût et facile dosages bien développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro 7-10. Dans la chambre de Boyden / cellules transwell d'analyse sont ensemencées sur un insert contenant des pores (environ 8 m de diamètre) - le compartiment supérieur 7 soi-disant. En option, l'insert peut être revêtu de m extracellulaireAtrix composants, par exemple, la fibronectine, le collagène, etc, afin d'imiter un environnement plus physiologique. De même, les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur le dessus de l'insert, imitant ainsi une barrière de cellules endotheliales 13. Les cellules qui sont passées à travers les pores pendant un intervalle de temps défini dans le compartiment inférieur hébergeant médias et les suppléments, tels que des facteurs de croissance et des chimiokines, sont utilisées comme une sortie de lecture quantifier la migration des cellules (ou extravasation).
Dans le test de rayure / cellules d'essai de cicatrisation sont ensemencées dans des plaques et sont cultivées jusqu'à confluence 10. En fonction des plaques de montage expérimental peut être pré-revêtu avec des composants de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine. Après avoir créé une égratignure / plaies par grattage des cellules individuelles de monocouches de cellules de chaque côté de la rayure / blessure peut migrer dans l'espace, remplissant ainsi / guérissant 10. La distance entre les deux côtés de la rayure / blessures est déterminéeen fonction du temps et est utilisé comme une sortie de lecture pour l'activité de migration des cellules 10. Cependant, faire la distinction entre la prolifération cellulaire (ce qui pourrait également entraîner de remplissage / la guérison de la rayure / blessure) et la migration cellulaire, il est recommandé de combiner le dosage avec time-lapse microscopie vidéo et une seule cellule de suivi 10.
Toutefois, la chambre de Boyden / test transwell et zéro dosage / cicatrisation dosage, sont assez imparfaite concernant un environnement cellulaire physiologique comme. Dans la chambre de Boyden / cellules d'essai transwell ont à migrer à travers un pore plastique, tandis que dans le test de zéro / de cicatrisation des cellules d'essai sont ensemencées sur une plaque de matière plastique pré-revêtu à deux dimensions. De même, il est bien connu que le comportement migratoire diffère sensiblement entre un environnement en deux dimensions et 3D 3. Par exemple, les adhérences tridimensionnel matrice de fibroblastes diffèrent des adhésions focales et sur deux fibrillaires caractérisésubstrats de dimension de leur contenu et de α5β1 intégrine avß3, la paxilline, d'autres composants du cytosquelette, et phosphorylation de la tyrosine kinase d'adhérence focale 14. De même, les cellules intégrées dans un environnement 3D s'affichent également un comportement migratoire modifié 15. Ainsi, pour analyser la migration des cellules avec plus de précision un dosage de migration est recommandé permettant de mesurer la migration de cellules individuelles au sein d'un milieu physiologique ou physiologique analogue à 3D.
Intravitale imagerie / microscopie est l'étalon-or pour mesurer la migration des cellules dans un contexte physiologique 3D. Cela ne fait pas partie des interactions matrice de cellules extracellulaires, mais aussi aux interactions entre les différents types de cellules, comme les cellules tumorales et les cellules endothéliales lors de l'extravasation 16 ou le trafic des lymphocytes à l'intérieur du ganglion lymphatique 17, qui, à ce jour, est possible grâce à l'amélioration des techniques de microscopie par fluorescence, tels que le 2-photonmicroscopie confocale à balayage laser, l'utilisation de colorants fluorescents vitaux et les souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dérivées 12,16,17. En outre, l'imagerie intravitale / microscopie peut être combiné avec le suivi de la cellule manuelle et automatique 18. Toutefois, en raison de la nécessité d'un 2-photon microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les animaux (et les modèles animaux transgéniques appropriés) intravitale imagerie / microscopie est une technique plutôt de coûteux.
Pour surmonter les limitations de la chambre / essai transwell Boyden et l'essai de cicatrisation dosage zéro / de la plaie et à analyser la migration de différents types de cellules dans un environnement 3D la détermination de la migration de la matrice de collagène 3D est développé 11,19. De ce fait, la migration des cellules sont incorporées dans un réseau de fibres de collagène en 3D, qui ressemble plus à la situation in vivo. Conjointement, en raison de time-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la déternation de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes et les leucocytes 11,20 souches hématopoïétiques, des cellules progénitrices / 21 à 24, et les cellules tumorales 5,25-29. En plus des cellules seule cellule également grappes ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène 30,31.
Ce protocole donne un aperçu d'une technique simple, mais puissant pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules dans un environnement 3D - une méthode in vitro donnant des résultats qui sont proches de la situation in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Préparation de la migration Chambers
- Préparer une gelée de paraffine / pétrole (1: 1) mélanger et chauffer jusqu'à ce que le mélange soit fondu. Utilisation d'un pinceau et tirer 2-3 couches de la gelée de paraffine / éther de pétrole (1: 1) mélanger dans le milieu de la lame de verre, conformément aux figures 1B-1D.
NOTE: Nous utilisons des lames de verre communes (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (L / P / H)) - Appliquer le mélange de gelée de paraffine / pétrole fondu rapidement sur la lame de verre pour éviter la solidification pendant le dessin. S'assurer que la couche de gelée de paraffine / pétrole est d'environ 2-2,5 cm de long et 0,3-0,5 cm de largeur. L'épaisseur de la couche de gelée de paraffine / pétrole doit être d'environ 0,1 à 0,15 cm.
- Ajouter une lamelle à la cire de paraffine solidifiée / mélange de gelée de pétrole et sceller de deux à trois couches de paraffine mélange de gelée cire / de pétrole (figures 1E, 1F). Utilisez 4-8 chambres de migration pour une expérience de la migration cellulaire commun. Lieu migration chambres iN en position verticale dans un rack.
2 Préparation de la suspension cellulaire de collagène Mix
- Récolte (par exemple, avec 0,25% de trypsine / EDTA) et compter les cellules d'intérêt. Remettre en suspension les cellules dans du milieu complet contenant du sérum de veau foetal (SVF), les antibiotiques et les suppléments recommandé. Préparation 8.4 1,5 ml et les tubes de réaction de 20 ul de suspension de cellules contenant de 4 à 6 x 10 4 cellules (le nombre total de cellules dépend du type de cellules à analyser) et remplir à 50 ul avec du milieu complet.
REMARQUE: Des composés supplémentaires (par exemple, facteurs de croissance, des chimiokines, des inhibiteurs, etc) sont ajoutés à la suspension cellulaire. Utilisation des solutions mères appropriés, tels que le volume final de la suspension cellulaire ne dépasse pas 50 pi. - Préparer un montant total de 452 ul finale suspension de collagène pour quatre expériences de migration cellulaire. Ajouter 50 ul de MEM 10 x (pH 5.1 à 5.5) et 27 ul d'une solution de bicarbonate de sodium à 7,5% (pH 9,0 à 9,5) Dans un tube de réaction de 1,5 ml et mélanger soigneusement. Observez la solution couleur tour du jaune-orangé au violet intense (pH 9,0-9,5). Ajouter suspension de collagène 375 pi liquide à l'/ solution de bicarbonate de sodium 10x MEM et bien mélanger. Le pH de la suspension de collagène finale doit être d'environ 7,5 (indiqué par une couleur violet clair).
REMARQUE: Vérifiez le pH de la solution de bicarbonate de sodium à 7,5%. Si le pH est d'environ 7,5 au lieu de la solution de bicarbonate de sodium avec un couvercle ouvert dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) d'être saturé en CO 2 et d'augmenter le pH (environ 9,0 à 9,5). Le pH de la suspension de collagène cellule de mélange est essentiel pour la stabilité du réseau de collagène. Si elle est trop faible, le réseau de collagène se replier lors de l'expérience de la migration cellulaire.
NOTE: Pour ce protocole, utilisez collagène liquide (pH 1,9-2,2) depuis l'arrière bovine (2.9 à 3.3 mg / ml de collagène; 95% de collagène de type I, 5% du collagène de type IV). Des exemples de protocoles de préparation de treillis plus de collagène à l'aidecollagène de type I provenant d'autres sources, telles que porcine ou rat, sont donnés en 32,33. Ne pas modifier les volumes des solutions utilisées que ceci modifie la concentration finale de collagène de 1,67 mg / ml de la maille. Une concentration de collagène plus ou moins élevée a un impact sur la densité des fibres de collagène et la distance moyenne entre les concomitante avec les cellules de comportement migratoire 34. - Ajouter 100 ul de la suspension finale de collagène à 50 ul de suspension cellulaire et mélanger thoroughly.The suspension finale de collagène (1,67 mg / ml de collagène) est légèrement visqueux. Pour transférer le montant exact (100 pi), la pipette la solution finale de collagène, une fois de haut en bas avant de le transférer à la suspension de cellules.
Remarque: Une fois que le mélange de cellules en suspension de collagène est combiné avec la solution de bicarbonate / sodium 10x MEM et la valeur de pH de 7,5 a changé les fibres de collagène commencent immédiatement à polymériser. - Transférer la dernière cellule mélange collagène de suspension de eréaction tubes e aux chambres de migration. Tapoter doucement la chambre de migration à répartir équitablement la cellule mélange collagène de suspension sur le fond de la chambre de migration (Figure 1H). Placer les chambres de migration dans une position verticale dans un bâti et incuber pendant environ 30 minutes (37 ° C, 5% CO 2) pour permettre la polymérisation des fibres de collagène.
- Notez que le réseau de collagène polymérisé est légèrement trouble, mais toujours en étant léger couleur pourpre. Remplir les chambres de migration avec un milieu complet ou un milieu complet avec des suppléments d'intérêt et sceller la chambre de migration avec de la gelée de paraffine / pétrole mélange (figures 1I, 1J).
3. enregistrement et l'analyse de la migration cellulaire
Cette section décrit l'enregistrement de la migration cellulaire par time-lapse vidéo microscopie et analyse de la migration cellulaire par un suivi manuel de la cellule.
- Allumez le microscope et la HEA platine du microscopeter. Ajuster la température à 37 ° C. Utilisez un objectif 10X. Passer chambre de migration sous un microscope et concentrer à environ 50 cellules ou plus dans le champ de vision.
- La migration des cellules d'enregistrement en mode time-lapse en utilisant un logiciel de surveillance vidéo multi-caméras. Enregistrer des films de la migration des cellules dans un format approprié, par exemple, "* avi» ou «* mov". Lier les fichiers vidéo de la migration des cellules à une base de données contenant des informations à l'appui, comme le type de cellule et des conditions expérimentales.
NOTE: Nous enregistrons les lymphocytes et les HSPCs jusqu'à 2 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1:80, ce qui signifie que 0,75 s en time-lapse est égal à 1 min en temps réel. Les cellules tumorales sont des cellules lents et sont ainsi enregistrées pendant au moins 16 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1: 1800 (0,5 s en time-lapse est égale à 15 min en temps réel). - Analyser films de migration cellulaire en utilisant un logiciel de suivi de la cellule appropriée, comme les greffons logiciels ImageJ(Un aperçu est donné dans 18). Pour une analyse impartiale, il est d'une importance cruciale que les cellules seront choisis au hasard à l'insu si les cellules sont actives ou non migrateurs.
NOTE: Nous utilisons un logiciel auto-développé pour suivre manuellement les chemins d'au moins 30 cellules par expérience en suivant les cellules se déplacent avec précision le curseur de la souris (qui est positionné pour le noyau). Bien que le suivi, les coordonnées xy des cellules chenilles sont automatiquement déterminés conformément au mode time-lapse utilisé. Pour les lymphocytes / HSPCs coordonnées xy sont déterminées chaque 0,75 s (égale à 1 min en temps réel), alors que pour les cellules tumorales les coordonnées xy sont déterminées chacune 0,5 s (égale à 15 minutes en temps réel). - Déterminer un total de 60 coordonnées xy par cellule pour une expérience de la migration cellulaire typique. Elle est égale à 1 heure en temps réel pour les lymphocytes / HSPCs et 15 heures en temps réel pour les cellules tumorales. A "," indique que la cellule n'a pas bougé entre two points dans le temps, alors qu'un "valeur numérique" indique la distance en "pixels" d'une cellule est déplacé entre deux points dans le temps (figure 2A).
REMARQUE: suivi manuel de cellules requiert de l'expérience. Particulièrement cellules migrantes rapide sont difficiles à suivre et chaque pièce de type de cellule un comportement migratoire distincte qui pourrait être déclenchée par des facteurs complétées. Dans le cas de la division cellulaire tout en suivant, choisissez au hasard une cellule fille pour le suivi continue. Les cellules qui migrent hors du champ de vue ou meurent tandis que le suivi ne sont pas négligés, mais sont pris en compte pour l'analyse.
Analyse 4. données
- Analyser les données de suivi de la cellule en utilisant un logiciel approprié, par exemple, un tableur.
- Analyser les données de suivi de la cellule en copiant le suivi des données brutes (figure 2A) cellule, dans un modèle de feuille de calcul auto-conçu. Multipliez somme des «valeurs numériques», représentantla distance totale d'une cellule a migré avec un facteur de correction pour convertir "pixel" en "um".
- Déterminer deux paramètres de migration cellulaire: activité locomotrice (ce qui équivaut à un taux de migration) et le temps de déplacement actif (figures 2C, 2D).
- Identifier les cellules qui ont migré inférieure à 25 um (niveau de seuil pour réduire le nombre de cellules faussement positives) en tant que cellules non en mouvement. Remplacer "valeurs numériques» de ces cellules avec ",".
REMARQUE: Le paramètre "activité locomotrice» (ou taux de migration) représente le pourcentage de cellules de la population cellulaire suivis qui ont déménagé entre deux points dans le temps (figure 2D). Une "valeur numérique" est définie comme une cellule mobile, tandis que "," est définie comme une cellule non en mouvement. Le paramètre "temps de déplacement actif» (active) représente le pourcentage du temps total d'une cellule a migré en relation de la trame de temps de la période d'observation (Figure 2C). Une "valeur numérique" indique que la cellule a été déplacé, tandis que "," indique que la cellule n'a pas bougé. Ce paramètre est en outre utilisé pour déterminer le nombre de cellules qui ne s'est pas déplacé.
- Calculer la signification statistique et les données de migration de cellules d'affichage.
- Calculer la signification statistique de l'activité locomotrice moyenne de la cellules (taux de migration) en utilisant le test de Mann-Whitney. Considérons p-value <0,05 comme significative.
- Afficher l'activité locomotrice moyen de cellules que xy-diagramme, BoxPlot schéma, ou comme un diagramme de graphique à barres. Afficher des données simples à base de cellules, telles que le temps de mouvement actif ou la vitesse, comme un diagramme de graphique à barres ou sous forme d'histogramme.
REMARQUE: Si le logiciel de feuille de calcul choisi ne contient pas un outil graphique ou histogramme BoxPlot une recherche en ligne doit être effectuée pour la recherche de tu adaptétorials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La détermination de la migration matrice 3D-collagène utilisé combiné avec time-lapse vidéo-microscopie et le suivi de la cellule assistée par ordinateur permet la détermination des différents paramètres de la migration des cellules, y compris les deux paramètres sur la population (par exemple, signifier activité locomotrice) et les paramètres à base de cellules individuelles (par exemple, le temps de déplacement actif, la vitesse, la distance migré). Un exemple des ensembles de données de suivi des cellules obtenues, le traitement des données et de présentation de données sont présentés dans la figure 2. Une cellule de suivi fichier de données ressemble à un tableau (figure 2A). Chaque colonne représente une cellule à chenilles, de sorte que par l'expérience de la migration cellulaire des cellules 30 sont suivis. Les lignes contiennent des informations si une cellule est ou non déplacé entre deux points dans le temps. La somme des valeurs numériques "", ce qui représente la distance dans "pixel" une cellule s'est déplacé entre deux points dans le temps, est la distance totale de cette cellule a migré. Il est multiplié par acfacteur de CORRECTION de convertir "pixel" en "um". Les cellules qui ont migré inférieure à 25 um sont définis comme étant des cellules non en mouvement pour réduire le nombre de cellules faussement positifs. La vitesse (um / min) de chaque cellule est calculé en divisant "distance totale migré" par "temps total (min) de la période d'observation".
Pour caractériser le comportement locomoteur des cellules couramment deux paramètres sont utilisés. Activité locomotrice (Figure 2D) représente l'activité locomotrice (ou taux de migration) moyenne de la population de cellules analysées, alors que le temps de déplacement actif (figure 2C) représente le temps total d'une cellule a migré à l'intérieur de la période d'observation. Ce dernier paramètre est en outre utilisée pour déterminer le nombre de cellules qui ne s'est pas déplacé. La raison de l'utilisation de deux paramètres de migration de la cellule d'analyse est attribuée au fait que l'activité locomotrice des cellules peut être déclenché par différemécanismes NT. Il ya trois possibilités comment, par exemple, un facteur de croissance, peut "induire" la migration cellulaire: a) par rapport à la commande de plusieurs cellules migrent, b) le nombre de cellules en mouvement par rapport à la commande n'a pas changé, mais le facteur de croissance traités cellules présentent une augmentation du temps de déplacement actif, ce qui signifie que ces cellules migrer pendant une durée plus longue, et c) une combinaison de a) et b).
Le schéma de la figure 2B illustre schématiquement la façon dont l'activité locomotrice et de temps de déplacement actif est calculée. Dans cet exemple, l'activité de migration des cellules 120 (qui est égale à quatre expériences indépendantes) sont affichées. Chaque losange indique qu'une cellule est déplacé entre au moins deux points dans le temps (quelle que soit la distance de la cellule a migré!). Les lignes grises ont été ajoutés à ce schéma afin de faire apparaître que la population de cellules analysées est constitué de mouvement et des cellules non en mouvement. Le paramètre "LOCOMotory activité »représente l'activité locomotrice de la population de cellules analysées, en fonction de chaque point dans le temps (figure 2D). Par exemple, une activité locomotrice de 10% à t = 5 h indique que, entre t = 4,45 h et t = 5 h 10% des cellules analysées sont déplacés. Lorsqu'elle est affichée comme une xy-diagramme de l'activité locomotrice de paramètre indique le caractère dynamique de la population de cellules analysées. Une autre possibilité pour afficher l'activité locomotrice de la population de cellules est le schéma BoxPlot (Figure 2F).
Le paramètre "temps de déplacement actif» (active) est corrélé à la durée totale d'une cellule est passé au cours de la période d'observation, dans lequel un temps d'activité de "0" indique que la cellule n'a pas bougé (figure 2C). Le temps d'activité des cellules peut être affiché sous la forme d'un histogramme.
L'interaction de l'EGFR / HER2 / PLC-γ1 et HER2 / HER3 / signalisation PI3K contribue à unephénotype migratoire de l'EGFR / HER2 / HER3 cellules de cancer du sein positif 25. signalisation de PI3K est nécessaire pour la génération de la phosphatidyl-3,4,5-triphosphate (PIP3), qui agit comme une molécule d'ancrage pour la PLC-1, recrutant ainsi cette enzyme à la membrane plasmique à être activés par des tyrosine kinases du récepteur 35. La stimulation des cellules uniquement EGFR positives MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) cancer du sein a entraîné à long terme PLC-γ1 concomitante de phosphorylation de tyrosine avec des niveaux DAG produisant des oscillations sinusoïdales de calcium 27 IP3 soutenue et. En revanche, les cellules cancéreuses du sein EGFR / HER2 positifs MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) affichés base oscillations calciques transitoires après traitement à l'EGF en raison de court terme activation de tyrosine PLC-γ1 et IP3 à court terme et le chiffre d'affaires DAG 27 indiquant que l'expression de HER2 a été corrélée à une différence cinétique PLC-γ1 et la signalisation.
Analyse du comportement migratoire de MDA-HER2 et MDA-Nlignées de cellules de cancer du sein d'OT ont révélé que les deux lignées cellulaires ont montré une activité similaire locomotrice spontanée (MDA-HER2: 23,0 à 28,9%, médiane: 26,7% vs MDA-NEO: 19,3 à 24,4%, médiane: 21,5%; figures 3A-3D ). Le paramètre de temps actif, ce qui représente le temps de déplacement active des cellules individuelles par rapport à la période d'observation, a révélé un nombre légèrement plus élevé de spontanément se déplacent les cellules MDA-HER2 (64%, figure 3E) par rapport aux cellules de cancer du sein MDA-NEO ( 53%; Figure 3F). La stimulation avec 100 ng / ml d'EGF a donné lieu à une activité locomotrice accrue de façon significative les deux lignées cellulaires. L'activité migratoire des EGF traité MDA-HER2 élevée à 30,4 à 35,2% (médiane 33,7%; figures 3A, 3C), qui a été attribué à la fois à une augmentation du nombre de cellules en mouvement (100 ng / ml d'EGF: 81% par rapport au témoin: 64%) et une augmentation du temps de déplacement actif. Par exemple, la quantité de cellules MDA-HER2 présentant un temps d'activité de 40% étaitaugmentation de 20% (témoin) à 28% (100 ng / ml d'EGF). Des données similaires ont été obtenus pour les cellules MDA-NEO cancer du sein, dont l'activité migratoire a été porté à 25,2 à 35,2 (médiane 30,4%; figures 3B, 3D) sur EGF stimulation. Conjointement, plus de cellules MDA-NEO migré en réponse à la stimulation EGF (100 ng / ml d'EGF: 66% par rapport au témoin: 53%) et fait preuve d'une forme active de décalé dans le temps (figure 3F). Par exemple, la quantité de cellules qui possèdent une durée d'activité de 60% a été nettement augmentée à 30% en présence d'EGF, par rapport à des cellules MDA-neo non traités (13%).
Le traitement des cellules MDA-HER2 et de cellules de cancer du sein MDA-NEO avec la PLC-γ1 U73122 inhibiteur conduit à une inhibition à la fois de la migration spontanée et induite par l'EGF des cellules (Figure 3A-D). Cependant, par rapport aux cellules de cancer du sein MDA-NEO l'effet inhibiteur de U73122 sur la migration spontanée des cellules MDA-HER2 était plutôt modeste, mais néanmoinssignificative (contrôle: 23,0 à 28,9%, médiane: 26,7% contre 2 uM U73122: 17,8 à 21,5%, médiane: 20,0%; figure 3C). L'analyse du temps de paramètres actif a révélé une quantité légèrement accrue des cellules non en mouvement en présence d'U73122 (témoin: 36% c 2 uM U73122: 48%; Figure 3E). De même, le traitement U73122 bloqué le FEM migration induite par des cellules de cancer du sein MDA-HER2 (100 ng / ml d'EGF: 30,4 à 35,2%, la médiane de 33,7% par rapport à 100 ng FEM ml / + 2 uM U73122: 19,3 à 24,1%, la médiane de 22,6 %; Figure 3C). Conformément à seulement U73122 cellules traitées MDA-HER2 cet effet inhibiteur a été plutôt attribuée à une plus grande quantité de cellules non-mouvement, mais pas un modèle actif altération du temps (figure 3C). En fait, un léger décalage vers une augmentation du temps de mouvement actif a été détecté dans la migration des cellules MDA-HER2 traités avec de l'EGF et U73122 (figure 3C).
Par contraste, Le traitement des cellules MDA-NEO avec 2 uM U73122 a entraîné une nette diminution de l'activité locomotrice de 5,6 à 10,7% (médiane: 9,3%; figure 3F) qui a été principalement attribuable à une plus grande quantité de non-déplacement des cellules (contrôle: 47% 2 uM vs U73122: 79%; Figure 3F). De même, la migration induite par EGF de cellules de cancer du sein MDA-neo a été sensiblement bloqué par U73122 à 1,1 à 7,4% (médiane: 4,8%), qui a été attribué à une plus grande quantité de cellules non mobile (100 ng / ml d'EGF: 34 % par rapport à 100 ng / ml d'EGF + 2 uM U73122: 70%), ainsi que d'une forme active de la diminution du temps (figure 3F).
Figure 1 Vue d'ensemble schématique de la préparation des chambres de migration cellulaire. (AE) une chambre de migration de cellules est préparée en traçant deux ou trois couches d'un fondu paraffin cire / vaseline mélanger sur une lame de verre. (F, G) une lamelle est ajouté et scellé avec un mélange de paraffine fondue de gelée cire / de pétrole. (H) La chambre de migration est mise en position verticale puis en ajoutant le collagène cellule suspension. Par la suite, la chambre de migration est placé dans un incubateur permettant la suspension de collagène cellule à polymériser. (I, J) La chambre de migration est rempli avec les médias et scellé avec de la paraffine fondue mélange de gelée cire / pétrole au quatrième côté. Par la suite, les chambres de migration sont placés sous un microscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 Vue d'ensemble schématique de l'analyse des données de migration cellulaire. (A) fichier de données de suivi de la cellule. The des activités de migration des 30 cellules est déterminée par l'expérience, de sorte que 60 points dans le temps sont analysés. A "," indique que la cellule n'a pas bougé entre deux points, alors qu'une "valeur numérique" indique le mouvement de la cellule (B). Cette figure est une vue schématique de données présentées en (A). Chaque losange indique qu'un s'est déplacé entre les deux points dans le temps; une ligne indique plus un mouvement. Les lignes grises ont été inclus pour visualiser ce que la population de cellules est constituée de cellules non-déplacement et les cellules (qui, cependant, faire des pauses) en mouvement. (C) Temps de déplacement actif (active) représente le pourcentage du temps total d'une cellule a migré par rapport à la durée totale de la période d'observation. Un temps d'activité de 20% et un temps total de 15 heures indique que cette cellule est passé au total pendant 3 heures. Ce paramètre est en outre utilisé pour déterminer le nombre de cellules non en mouvement, ce qui correspond à un temps d'activité de 0% (D). (E) Sinon, l'activité locomotrice des cellules analysées peuvent être affichées sous forme de diagramme BoxPlot. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: données sur la migration des cellules MDA-représentatifs de HER2 et des cellules de cancer du sein MDA-neo. Cellules ont été traitées avec 100 ng / ml d'EGF, ou 2 uM U73122 avec un co mbination des deux. (A, B) Moyenne activité locomotrice de MDA-HER2 (A) et des cellules en fonction du temps MDA-NEO (B). (C, D) BoxPlot diagramme de l'activité locomotrice moyenne, ce qui représente le 2 h à 13 h intervalle de temps (voir bar (A, B)) de MDA-HER2 (C) et MDA-NEO (D) des cellules. La signification statistique a été calculée en utilisant la -test Mann-Whitney- U. *** = P <0,001. (E, F) des parcelles de l'histogramme de la période active de MDA-HER2 (E) et les cellules MDA-NEO (F). Un temps d'activité de 0% indique que les cellules n'ont pas bougé pendant la période d'observation. Conjointement, un temps d'activité de 20% indique que, compte tenu de la période d'observation de 15 heures, ces cellules ont évolué jusqu'à 3 h. Présentés sont la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La capacité de migrer est une caractéristique des cellules tumorales 4. Sans la capacité de se détacher de la tumeur primaire et la migration des cellules tumorales à travers les tissus conjonctifs environnants ne sera pas capable de semer des lésions secondaires, qui sont la cause principale de la mort de presque tous les patients atteints de cancer. En raison de cette relation de nombreuses études se concentrent sur la migration des cellules cancéreuses. Le but de ces études est l'identification de nouvelles molécules cibles et les voies cibles qui bloquent efficacement la migration des cellules tumorales, ce qui nuit ou ralentir la formation de métastases. Un exemple d'un tel effort peut être β-bloquants, qui se sont révélés inhiber la dissémination métastatique des cellules cancéreuses du sein in vitro et in vivo 36 et qui ont été associés à une amélioration de la survie sans rechute chez les patients atteints du sein triple négatif les cellules cancéreuses 37. Nous avons récemment démontré que les cellules hybrides, qui dérivent de spontaneUO événements de fusion entre une lignée humaine de l'épithélium du sein et des cellules d'une lignée cellulaire de cancer du sein humain, mais pas les cellules parentales, ont répondu à la chimiokine CCL21 avec une augmentation de 26 l'activité migratoire. CCL21 a été associée à la formation ganglionnaire de métastase de divers types de cancer, notamment du sein 38, ce qui suggère que la fusion cellulaire peut être un processus comment les cellules tumorales (hybride) peuvent acquérir des propriétés métastatiques 39,40.
La détermination de la migration de la matrice de collagène 3D présente plusieurs avantages par rapport à la chambre de Boyden / dosage Transwell et le dosage de zéro / cicatrisante dosage. Tout d'abord, les cellules sont intégrées dans un environnement physiologique 3D. Comme indiqué ci-dessus, le comportement migratoire des cellules diffère sensiblement entre un environnement en deux dimensions et 3D 3,14,15. Ainsi, on peut conclure que le comportement migratoire de cellules incorporé dans un réseau de collagène 3D ressemble plus à la situation in vivo de la LOCOMotory activité des cellules rampant sur une surface bidimensionnelle. En second lieu, en raison de time-lapse enregistrement vidéo, il est possible d'analyser la migration de plusieurs cellules sur un certain laps de temps, ce qui permet la détermination des différents paramètres de la migration cellulaire. En revanche, dans la chambre de dosage / Transwell Boyden que les cellules sont considérées à l'analyse qui se sont déplacées vers le compartiment inférieur. Ces cellules qui migrent par exemple, au-dessus de la membrane ne sont pas inclus dans l'analyse de données, même si elles sont migratrices active.
La matrice de collagène 3D peut être combiné avec des dispositifs microfluidiques, qui en plus de mimer la matrice extracellulaire ne reproduire aussi le liquide interstitiel, qui a été montré pour affecter la morphologie et la migration de différents types de cellules, telles que les fibroblastes, les cellules cancéreuses, les cellules endotheliales et des cellules souches mésenchymateuses 41. Les données de Haessler et al. Ont révélé que le flux interstitiel augmente le pourcentagedes cellules qui deviennent migratoire ainsi que la vitesse augmente migratoire dans environ 20% des cellules 42. En plus d'étudier le comportement chimiotactique des cellules, par exemple des leucocytes / lymphocytes ou des cellules tumorales, un réglage microfluidique 3D est également un outil adapté pour étudier intravasculaire de cellules tumorales et endotheliales fonction barrière 43.
Bien que l'essai de migration 3D de la matrice de collagène est un outil approprié pour analyser la migration des cellules en réponse à un stimulus ou à un inhibiteur ou à une combinaison des deux, il convient de noter que ce test do a également certaines limites. Par exemple, seulement du collagène de type I est utilisé pour mimer la matrice extracellulaire, qui, cependant, est un mélange complexe de plusieurs composants, y compris les protéoglycanes, les non-protéoglycanes (par exemple, acide hyaluronique), les fibres de collagène, ainsi que la fibronectine et la laminine et qui composition varie en outre fortement entre les différents tissus conjonctifs dans les différents organes
Un autre point critique à déchiffrer les cellules activité migratoire est la procédure de suivi de la cellule. Pour obtenir des données valides et objectif, il est obligatoire que le chemin de cellules individuelles sont analysées avec précision. le suivi des cellules est effectuée manuellement par la main, ce qui exige une expérience de suivi de cellule àobtenir des données objectives. Afin d'améliorer davantage les données et pour éviter un nombre important de cellules faussement positifs, nous utilisons un niveau de coupure de 25 um, ce qui signifie que les cellules qui ont migré moins de 25 um ont été exclus de l'analyse des données. De même, les cellules sont choisis au hasard pour suivre sans savoir si elles sont migratrices actif ou non pour éviter des données biaisées.
Dans les dernières années, plusieurs applications logicielles de suivi cellulaire automatisés ont été développés, de sorte que certains d'entre eux sont adaptés pour analyser cellule et le suivi de particules en 3D réglage 18. L'avantage de ces applications est que les cellules qui migrent sont vraiment analysés d'une manière objective. A cause de cela, il serait intéressant de comparer les données de suivi automatique de cellules de la main-faites des données de suivi de la cellule.
Comme mentionné ci-dessus, la norme d'or pour analyser la migration des cellules dans un contexte physiologique 3D est l'utilisation de l'imagerie intravitale combiné wie 2-photon laser de balayage de la microscopie confocale. L'avantage de ce test est que les cellules qui migrent sont intégrés dans leur environnement physiologique comprenant des facteurs solubles, des hormones spécifiques, etc, des composants de la matrice extracellulaire, ainsi que les interactions de cellule à cellule. Il est remarquable de voir des films montrant comment les lymphocytes sont le trafic dans un ganglion lymphatique 17, comment les cellules immunitaires sont en communication les uns avec les 48 autres ou comment les médicaments sont distribués in vivo au niveau de la cellule unique 12,49.
Cependant, l'imagerie intravitale combiné à deux photons laser à balayage microscopie confocale est une technique peu coûteuse des coûts en raison de la nécessité d'un microscope approprié et des modèles animaux appropriés. De même, il n'est pas vraiment adapté pour étudier l'influence de simples facteurs / inhibiteurs solubles sur la migration des cellules particulières ou l'analyse de la migration cellulaire liés cascades de transduction du signal. Pour ces fins mi de cellulesles dosages sont recommandés gration permettant l'analyse de types cellulaires distincts, qui peuvent être en outre modifiés, par exemple, la surexpression ou knock-down de molécules cibles, dans des conditions expérimentales définies. En raison de la relation de pivotement entre un environnement 3D et le comportement locomoteur des cellules, nous concluons que le dosage 3D de la migration de la matrice de collagène est donc un procédé polyvalent pour étudier la migration des cellules dans un milieu in vitro qui est proche de la situation in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
