Summary
A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.
Abstract
A capacidade de migrar é uma característica de vários tipos celulares e desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, e respostas imunes. Contudo, a migração celular é também um mecanismo de chave no cancro permitindo estas células cancerosas para separar a partir do tumor primário para iniciar a propagação metastática. Nos últimos anos vários ensaios de migração de células foram desenvolvidas para analisar o comportamento migratório das diferentes tipos de células. Porque o comportamento locomotor de células difere marcadamente entre uma a duas dimensões (2D) e do ambiente tridimensional (3D), pode presumir-se que a análise da migração de células que são incorporados dentro de um ambiente 3D produziria na migração de células mais significativa dados. A vantagem do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D é descrito que as células estão embutidos dentro de uma rede 3D fisiológica de fibras de colagénio que representam a principal componente da matriz extracelular. Devidotime-lapse microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações em resposta a fatores ou inibidores da pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisadas usando esta técnica, incluindo linfócitos / leucócitos, as células estaminais e as células tumorais. Da mesma forma, também grupos de células ou esferóides poderia ser incorporado dentro da matriz de colágeno concomitante com a análise da emigração de células individuais do grupo de células / esferóide na malha de colágeno. Conclui-se que o ensaio de migração 3D matriz de colagénio é um método versátil para analisar a migração de células dentro de um ambiente fisiológico 3D-like.
Introduction
Como a fusão celular (para uma síntese ver 1,2) migração de células de um outro fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e respostas imunes (para revisão ver 3). No entanto, a capacidade de migrar também é um pré-requisito para as células tumorais de metástases (para revisão ver 3,4).
A migração celular é um complexo, não processo ainda totalmente compreendido que é dirigido pela interação de diversas vias de transdução de sinal iniciada por vários ligante (por exemplo, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, hormônios, componentes da matriz extracelular) do receptor (por exemplo, receptores tirosina-quinase, receptores de quimiocinas, integrinas) interações cinco causando finalmente a reorganização do citoesqueleto de actina concomitante com mento e montagem de complexos de adesão focal e integrina mediada sinalização 6.
in vitro e in vivo, os ensaios de migração de células foram desenvolvidas nas últimas décadas, incluindo o ensaio de câmara de Boyden / transwell 7, zero ensaio / ferida ensaio 8-10, tridimensional (cura 3D) ensaio de migração de 11 matriz de colagénio, bem como intravital imagiologia / microscopia (para revisão, ver 12). Cada um destes ensaios de migração celular tem prós e contras, por exemplo, em matéria de custos e necessidade de equipamentos, manipulação e confiabilidade dos dados obtidos.
Tanto a câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de ensaio de risco / a cicatrização de feridas são fácil, baixo custo e ensaios bem desenvolvidos para medir a migração de células in vitro 7-10. Na câmara de Boyden / transpo� células de ensaio são semeadas em cima de um inserto contendo poros (cerca de 8 um de diâmetro) - o chamado compartimento superior 7. Opcional, a pastilha pode ser revestida com m extracelularAtrix componentes, por exemplo, fibronectina, colagénio, etc, para simular um ambiente mais fisiológico. Da mesma forma, as células endoteliais podem ser cultivadas no topo do inserto, imitando assim uma barreira de células endoteliais 13. Aquelas células que passaram através dos poros durante um intervalo de tempo definido para o compartimento inferior que alberga os meios e suplementos, tais como factores de crescimento e quimiocinas, são utilizados como um limite ler para quantificar a migração de células (ou extravasamento).
No ensaio de risco / células de ensaio de cicatrização de feridas são semeadas em placas e são cultivadas até à confluência de 10. Em dependência das placas de ajuste experimentais poderia ser pré-revestido com componentes da matriz extracelular, como a fibronectina. Depois de criar um risco / ferida por raspagem das células em monocamada de células individuais a partir de cada lado da raiz / ferida pode migrar para dentro do fosso, enchendo desse modo / curando-10. A distância entre os dois lados do Scratch / feridas é determinadaem dependência do tempo e é utilizado como um limite para ler a actividade migratória das células 10. No entanto, para discriminar entre a proliferação de células (que também pode resultar em enchimento / cura do arranhão / ferida) e a migração das células, recomenda-se combinar o ensaio com videomicroscopia de lapso de tempo e de uma única célula de rastreamento 10.
No entanto, tanto o ensaio Boyden câmara / transwell e zero ensaio / ferida teste de cura, são bastante imperfeito, relativo a um ambiente celular fisiológica semelhante. Na câmara de Boyden / células de ensaio Transwell ter para migrar através de um poro de plástico, enquanto que no ensaio de risco / ensaio de cicatrização da ferida células são semeadas num prato de plástico pré-revestidos bidimensional. Do mesmo modo, é bem reconhecido que o comportamento migratório difere marcadamente entre um ambiente bidimensional e 3D 3. Por exemplo, aderências tridimensional de matriz de fibroblastos diferem das adesões focais e fibrilares caracterizados em doissubstratos dimensionais no seu conteúdo de α5β1 e integrinas aVp3, paxilina, outros componentes do citoesqueleto, e fosforilação de tirosina-quinase de adesão focal 14. Da mesma forma, as células embutidas dentro de um ambiente 3D também exibido um comportamento migratório alterado 15. Assim, para analisar a migração de células de forma mais precisa de um ensaio de migração é recomendado que permite medir a migração de células individuais dentro de um ambiente fisiológico ou fisiológico semelhante a 3D.
Imaging / microscopia intravital é o padrão-ouro para medir a migração de células dentro de um contexto fisiológico 3D. Isto não só pertencem a interacções célula-matriz extracelular, mas também às interacções entre os diferentes tipos de células, tais como células de tumor e células endoteliais durante o extravasamento 16 ou o tráfico de linfócitos no nódulo linfático 17, o qual, até à data, é possível devido à melhoria das técnicas de microscopia de fluorescência, tais como 2-fótonsA microscopia confocal de varrimento laser, o uso de corantes fluorescentes vitais e estirpes de ratos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes derivados 12,16,17. Além disso, a imagem / microscopia intravital poderia ser combinada com rastreamento de células manual e automatizado 18. No entanto, por causa da necessidade de um microscópio confocal de varrimento laser 2-fotão, bem como os animais (e em modelos animais transgénicos adequados) imagiologia / microscopia intravital é uma técnica bastante dispendioso.
Para ultrapassar as limitações da câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de cicatrização zero ensaio / ferida e para analisar a migração de diferentes tipos de células dentro de um ambiente de 3D do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D foi desenvolvido 11,19. Desse modo, as células migram estão embutidos dentro de uma rede de fibras colágenas 3D, o que mais se assemelha à situação in vivo. Conjuntamente, devido ao lapso de tempo microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações, em resposta a fatores ou inibidores de pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisados utilizando esta técnica, incluindo linfócitos e leucócitos 11,20, tronco hematopoiéticas / progenitoras 21-24 e células tumorais 5,25-29. Além de células individuais também célula ou agregados esferóides poderia ser incorporado no interior da matriz de colagénio com concomitante análise da emigração de células isoladas a partir do agrupamento de células / esférica para o colagénio treliça 30,31.
Este protocolo apresenta uma visão geral sobre uma técnica simples, mas poderosa para analisar o comportamento migratório de diferentes tipos de células dentro de um ambiente 3D - um método in vitro resultando em resultados que estão perto a situação in vivo.
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Protocol
1 Preparação das Câmaras de Migração
- Prepara-se uma geleia de parafina / petróleo (1: 1) mistura e aquecimento até que a mistura tenha derretido. Usando um pincel e desenhar 2-3 camadas da geleia de parafina / petróleo (1: 1) misturar no meio da placa de vidro, em conformidade com as Figuras 1B-1D.
NOTA: Nós estamos usando lâminas de vidro comum (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H)) - Aplicar a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo derreteu rapidamente sobre a lâmina de vidro para evitar a solidificação enquanto desenha. Certifique-se a camada de geléia de cera de parafina / petróleo é de cerca de 2-2,5 cm de comprimento e 0,3-0,5 cm de largura. A espessura da camada de geleia de parafina / petróleo deve ser de cerca de 0,1-0,15 cm.
- Adicionar uma lamela para a cera de parafina solidificada / petróleo mix geléia e selá-lo com duas a três camadas de parafina mix geléia de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Use 4-8 câmaras de migração para uma experiência de migração celular comum. Câmaras lugar de migração iN posição vertical em um rack.
2 Preparação do Colágeno Suspensão Mix celular
- Colheita (por exemplo, com 0,25% de tripsina / EDTA) e contagem de células de interesse. Ressuspender as células em meio completo contendo soro fetal de vitelo (FCS), antibióticos e os suplementos recomendados. Prepare 4-8 1,5 ml tubos de reacção e 20 ul de suspensão de células contendo 4-6 x 10 4 células (o número total de células depende do tipo de célula a ser analisada), e encher até 50 ul com meio completo.
NOTA: Outros compostos (por exemplo, factores de crescimento, quimiocinas, inibidores, etc) são adicionados à suspensão de células. Utilizar soluções de reserva apropriadas de tal modo que o volume final da suspensão de células não exceda 50 ul. - Prepare um montante total de 452 suspensão de colagénio último ul por quatro experimentos de migração celular. Adicionar 50 ul de 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ul de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% (pH de 9,0-9,5) Para um tubo de ensaio 1,5 ml e misture bem. Observe a cor da solução passar de amarelo-laranja para roxo intenso (pH 9,0-9,5). Adicionar suspensão de colagénio 375 mL de líquido para o / solução de bicarbonato de sódio 10x MEM e misture bem. O pH da suspensão de colagénio final deverá ser de cerca de 7,5 (indicado por uma cor púrpura clara).
Nota: Verifique o pH da solução de bicarbonato de sódio a 7,5%. Se o pH é cerca de 7,5 lugar a uma solução de bicarbonato de sódio, com uma tampa aberta de uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para ser saturada com CO 2 e aumentar o pH (cerca de 9,0-9,5). O pH da mistura de células em suspensão de colagénio é essencial para a estabilidade da rede de colagénio. Se ele for muito baixa, o colagénio reticulado entrará em colapso durante a experiência de migração de células.
NOTA: Para este protocolo, utilize o colágeno líquido (pH 1,9-2,2) da traseira bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno e 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Exemplos de protocolos de preparação adicional de colagénio reticulado usandocolágeno tipo I a partir de outras fontes, tais como suínos ou rato, são dadas em 32,33. Não mude os volumes das soluções utilizadas como isso irá alterar a concentração final de colagénio de 1,67 mg / ml do látice. A concentração de colagénio mais elevado ou mais baixo tem um impacto sobre a densidade de fibras de colagénio e a distância média entre eles concomitante com as células de comportamento migratório 34. - Adicionar 100 ul da suspensão de colagénio final para 50 mL de suspensão de células e misturar thoroughly.The suspensão de colagénio final (1,67 mg / ml de colagénio) é ligeiramente viscoso. Para transferir o valor correcto (100 ul), pipetar a solução de colagénio final, uma vez para cima e para baixo, antes de transferi-lo para a suspensão de células.
NOTA: Uma vez que a mistura de células em suspensão de colágeno é combinado com a solução de bicarbonato de sódio / 10x MEM eo valor de pH foi alterado para 7,5 fibras de colágeno começar imediatamente a polimerização. - Transferir a mistura de células em suspensão de colagénio final the tubos de reação para as câmaras de migração. Bater levemente na câmara de migração para distribuir igualmente a mistura de células em suspensão de colagénio na parte inferior da câmara de migração (Figura 1H). Colocar as câmaras de migração em posição vertical numa prateleira e incubar durante cerca de 30 min (37 ° C, 5% CO 2) para permitir que a polimerização das fibras de colagénio.
- Observe que a estrutura de colágeno polimerizado é um pouco turva, mas continua a ser luz de cor roxa. Encha as câmaras de migração com meio completo ou médio completo com suplementos de interesse e selar a câmara de migração com a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo (Figuras 1I, 1J).
3. registro e análise da migração celular
Esta seção descreve a gravação da migração de células por microscopia de lapso de tempo vídeo e análise da migração celular por rastreamento de células manual.
- Ligue o microscópio eo hea estágio do microscópioter. Ajustar a temperatura para 37 ° C. Use uma objetiva de 10X. Coloque câmara de migração sob um microscópio e concentrar aproximadamente 50 ou mais células no campo de visão.
- Migração celular Grave no modo de lapso de tempo usando um aplicativo de software de vigilância de vídeo multi-câmera. Salve filmes de migração celular em um formato apropriado, por exemplo, "* avi" ou "* mov". Vincular os arquivos de filmes de migração celular para um banco de dados contendo informações de apoio, tais como tipo de célula e condições experimentais.
NOTA: Estamos gravando linfócitos e hspCs por até 2 horas usando um fator de lapso de tempo de 1:80, o que significa que 0,75 s em time-lapse é igual a 1 min em tempo real. As células tumorais são células de movimento lento e são, assim, registada por pelo menos 16 horas usando um factor de lapso de tempo de 1: 1.800 (0,5 seg no lapso de tempo é igual a 15 minutos em tempo real). - Analisar filmes de migração celular, usando um aplicativo de software de rastreamento de células apropriado, como plugins de software ImageJ(Uma visão geral é dado em 18). Para uma análise imparcial, é de crucial importância que as células serão selecionados aleatoriamente, sem o conhecimento se as células são migratórias ativa ou não.
NOTA: Nós estamos usando um aplicativo de software de auto-desenvolvimento para controlar manualmente os caminhos de pelo menos 30 células por experimento, seguindo as células de movimento com precisão com o cursor do mouse (que está posicionada para o núcleo). Durante a perseguição, os xy coordenadas das células controladas são automaticamente determinados de acordo com o modo de lapso de tempo utilizado. Para linfócitos / hspCs xy coordenadas são determinadas cada 0,75 segundos (igual a 1 min em tempo real), enquanto que para as células tumorais XY coordenadas são determinadas cada 0,5 segundos (igual a 15 min em tempo real). - Determine um total de 60 xy coordenadas por célula para uma experiência de migração celular comum. Este é igual a 1 hora em tempo real para os linfócitos / hspCs e 15 h de tempo real para as células tumorais. Um "," uma célula indica que não se moveu entre two pontos de tempo, ao passo que um "valor numérico" indica a distância em "pixels" de uma célula se tenha mudado entre dois pontos de tempo (Figura 2A).
NOTA: rastreamento de celular manual requer experiência. Células que migram rápido Particularmente são difíceis de detectar e de cada tipo de célula apresentam um comportamento migratório distinto que pode ser desencadeada por fatores suplementados. Em caso de divisão celular ao seguir, escolha aleatoriamente uma célula filha para o acompanhamento contínuo. As células que migram para fora do campo de visão ou morrem enquanto o rastreamento não são negligenciados, mas que foram considerados para a análise.
Análise 4. Dados
- Analisar os dados de rastreamento de celular, usando um aplicativo de software adequado, por exemplo, um programa de planilha.
- Analisar os dados de rastreamento de celular, copiando o rastreamento de dados brutos (Figura 2A) celular, em um modelo de planilha auto-concebidos. Multiplique soma dos "valores numéricos", representandoa distância total de uma célula migrou com um fator de correção para converter "pixel" em "? M".
- Determinar dois parâmetros de migração de células: A actividade locomotora (que é equivalente à taxa de migração) e tempo de movimento activo (Figuras 2C, 2D).
- Identificar as células que migraram menor do que 25 um (nível limiar para reduzir o número de células de falsos-positivos) como células que não se mover. "Substituir" valores numéricos destas células com ",".
NOTA: O parâmetro (ou taxa de migração) "atividade locomotora" representa a porcentagem de células da população de células controladas que se mudaram entre dois pontos no tempo (Figura 2D). Um "valor numérico" é definida como uma célula em movimento, ao passo que "," é definido como uma célula não-móveis. O parâmetro "tempo de movimento ativo" (ativa) representa a porcentagem do tempo total de uma célula migrou em relação ao período de tempo do período de observação (Figura 2C). Um "valor numérico" indica que uma célula se desloca, ao passo que "," indica que a célula não se moveu. Este parâmetro é mais utilizado para determinar o número de células que não se tenha mudado.
- Calcule significância estatística e de visualização de dados de migração celular.
- Calcula significância estatística da actividade locomotora significativo da células (taxa de migração) usando o teste de Mann-Whitney. Considere p <0,05 como significativo.
- Mostrar a atividade locomotora médio de células como xy-diagrama, BoxPlot diagrama, ou como um diagrama de gráfico de barras. Mostrar os dados baseados em células individuais, tais como o tempo de movimento ou de velocidade ativo, como um diagrama de gráfico de barras ou como um histograma.
NOTA: Se o aplicativo de planilha escolhido não contém uma tabela ou gráfico histograma ferramenta BoxPlot uma pesquisa on-line deve ser realizada para procurar tu adequadotorials.
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Representative Results
O ensaio de migração matriz 3D-colagénio utilizado combinado com lapso de tempo de video-microscopia de rastreamento e de células assistida por computador permite a determinação de vários parâmetros, incluindo a migração de células, tanto do parâmetro de base populacional (por exemplo, a média de actividade locomotora) e parâmetros baseados em células individuais (por exemplo, tempo de movimento ativo, velocidade, distância migrados). Um exemplo dos conjuntos de dados de rastreio de células obtidas, processamento e apresentação dos dados são apresentados na Figura 2. Uma célula tracking arquivo de dados se assemelha a um mesa (Figura 2A). Cada coluna representa uma célula rastreados, em que cada ensaio de migração de células de 30 células são rastreados. As linhas contém a informação de que uma célula se tenha movimentado ou não entre os dois pontos de tempo. A soma dos valores numéricos "", representando a distância em "pixels" de uma célula passou entre dois pontos no tempo, é a distância total desta célula tenha migrado. É multiplicado por acfator orrecção converter "pixel" em "? M". As células que migraram menor do que 25 um são definidas como células que não se deslocam para reduzir o número de células de falsos-positivos. A velocidade (um / min) de cada célula é calculada dividindo-se "a distância total de migração" por "tempo total (min) do período de observação".
Para caracterizar o comportamento locomotor de células vulgarmente dois parâmetros são utilizados. Actividade locomotora (Figura 2D), representa a actividade locomotora (ou taxa de migração) significativo da população de células analisados, enquanto que o tempo de movimento activo (Figura 2C) representa o tempo total de uma célula migrou dentro do período de observação. Este último parâmetro é ainda usada para determinar o número de células que não se tenha mudado. A razão para a utilização de dois parâmetros de migração de células para análise é atribuída ao facto de a actividade locomotora de células pode ser desencadeada por difermecanismos NT. Há três possibilidades como, por exemplo, um fator de crescimento, pode "induzir" migração de células: a) em relação ao controle mais células estão migrando, b) o número de células em movimento em relação ao controle não mudou, mas o fator de crescimento tratadas As células apresentam um aumento do tempo de circulação activa, o que significa que estas células vão migrar para um tempo mais longo, e c) uma combinação de a) e b).
O diagrama na Figura 2B ilustra esquematicamente como a actividade locomotora e o tempo de movimento activo é calculada. Neste exemplo as actividades migratórias de células 120 (que é igual a quatro experiências independentes) são exibidos. Cada diamante indica que uma célula tenha movido entre, pelo menos, dois pontos de tempo (independentemente de a distância da célula migrou!). As linhas cinzentas foram adicionados a este esquema para mostrar que a população de células analisadas consiste em movimento e células não-móveis. O parâmetro "LOCOMactividade otory "representa a actividade locomotora da população de células analisadas na dependência de cada ponto de tempo (Figura 2D). Por exemplo, uma actividade locomotora, de 10% a t = 5 horas indica que entre t = 4,45 h e t = 5 h, 10% das células analisadas foram movidos. Quando apresentada como um diagrama xy a actividade locomotora parâmetro indica o dinamismo da população de células analisadas. Outra possibilidade de exibir a actividade locomotora de uma população de células é o diagrama BoxPlot (Figura 2F).
O parâmetro "tempo de movimento activo" (tempo activo) está correlacionada com o tempo total de uma célula passou durante o período de observação, em que uma vez activo de "0" indica que a célula não se moveu (Figura 2C). O tempo activa das células pode ser exibida como um histograma.
A interação de EGFR / HER2 / PLC-γ1 e HER2 / HER3 / sinalização PI3K contribui para umafenótipo migratório de EGFR / HER2 / HER3 células de câncer de mama positivo 25. PI3K sinalização é necessária para a geração de fosfatidil-3,4,5-trifosfato (PIP3), que actua como uma molécula de ancoragem para PLC-1, recrutando, assim, esta enzima para a membrana de plasma para ser activada por receptores tirosina-quinase 35. A estimulação de células MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) apenas células EGFR positivas de cancro da mama em resultado a longo prazo do PLC-γ1 concomitante com a fosforilação da tirosina de IP3 e sustentada dos níveis de cálcio DAG produzindo oscilações sinusoidais 27. Em contraste, EGFR / MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) células de cancro da mama positivos para HER2 exibido basais oscilações transientes de cálcio, após tratamento com o EGF de devido a curto prazo PLC-γ1 activação da tirosina e IP3 de curto prazo e de rotação de DAG 27 indicando que a expressão HER2 foi correlacionada com um diferencial cinética PLC-γ1 e sinalização.
A análise do comportamento migratório das células MDA-HER2 e MDA-NLinhagens de células de câncer de mama EO revelou que ambas as linhagens celulares exibiram uma atividade locomotora espontânea semelhante (MDA-HER2: 23,0-28,9%, média: 26,7% contra MDA-NEO: 19,3-24,4%, média: 21,5%; Figuras 3A-3D ). O parâmetro tempo activa, que representa o tempo de movimento activo de células individuais em relação ao período de observação, revelaram um ligeiro aumento da quantidade de movimento espontâneo células MDA-HER2 (64%; figura 3E), em comparação com células de cancro da mama MDA-NEO ( 53%; Figura 3F). A estimulação com 100 ng / ml de EGF resultou num aumento significativo da actividade locomotora ambas as linhas celulares. A actividade migratória do EGF tratada MDA-HER2 aumentada para 30,4-35,2% (média de 33,7%; Figuras 3A, 3C), o que foi atribuído tanto a um aumento do número de células de movimento (100 ng / ml de EGF: 81% versus controlo: 64%) e um aumento do tempo de circulação activa. Por exemplo, a quantidade de células MDA-HER2 exibindo um tempo activa de 40% eraaumentou de 20% (controlo) a 28% (100 ng / ml EGF). Dados semelhantes foram obtidos para as células MDA-NEO câncer de mama, que a atividade migratória foi aumentada para 25,2 e 35,2 (média de 30,4%; Figuras 3B, 3D) após estimulação EGF. Conjuntamente, mais células MDA-NEO migraram em resposta à estimulação EGF (100 ng / ml de EGF: 66% vs controle: 53%) e apresentou um comportamento ativo vez deslocado (Figura 3F). Por exemplo, a quantidade de células que possuem um tempo de actividade de 60% foi significativamente aumentada para 30% na presença de EGF, em comparação com as células MDA-NEO não tratados (13%).
O tratamento de células MDA-HER2 e células de cancro da mama MDA-neo com o inibidor de U73122 PLC-γ1 resultou numa inibição de tanto a migração induzida espontânea e EGF das células (Figura 3A-D). No entanto, em comparação com células de cancro da mama MDA-NEO o efeito inibitório de U73122 sobre a migração espontânea de células MDA-HER2 foi bastante moderado, mas, no entantosignificativa (controle: 23,0-28,9%, média: 26,7% contra 2 mM U73122: 17,8-21,5%, média: 20,0%; Figura 3C). Análise do tempo parâmetro activo revelaram um ligeiro aumento do número de células não mover-se na presença de U73122 (controlo: 36% versus 2 uM U73122: 48%; Figura 3E). Da mesma forma, o tratamento U73122 bloqueou a migração induzida por EGF de células de cancro da mama MDA-HER2 (100 ng / ml de EGF: 30,4-35,2%, mediana 33,7% versus 100 EGF ng / ml + 2 uM U73122: 19,3-24,1%, mediana 22,6 %; Figura 3C). De acordo com U73122 tratados unicamente células MDA-HER2 este efeito inibitório era vez atribuídos a um aumento da quantidade de células que não se mover, mas não um padrão activo alterada do tempo (Figura 3C). De facto, uma pequena mudança no sentido de um aumento do tempo de movimento activo foi detectável na migração de células MDA-HER2 a ser tratado com o EGF e U73122 (Figura 3C).
Em contraste, O tratamento de células MDA-NEO com 2 uM U73122 resultou numa diminuição acentuada actividade locomotora de 5,6 para 10,7% (mediana: 9,3%; Figura 3F) que foi atribuída principalmente a uma quantidade aumentada de células não-móveis (controlo: 47% versus 2 uM U73122: 79%; Figura 3F). Da mesma forma, a migração induzida por EGF de células de cancro da mama MDA-neo foi significativamente bloqueada por U73122 a 1,1 para 7,4% (mediana: 4,8%), a qual foi atribuída a um aumento da quantidade de células que não se mover (100 ng / ml de EGF: 34 % contra 100 ng / ml de EGF + 2 uM U73122: 70%), bem como a uma diminuição do tempo padrão activa (Figura 3F).
Figura 1 Visão esquemática da preparação das câmaras de migração celular. (AE) Uma câmara de migração celular é preparado extraindo duas a três camadas de um paraffi derretidan / cera de petróleo misturar gelatina numa lâmina de vidro. (F, G) A lamela é adicionado e seladas com uma mistura de cera de parafina fundida geleia / éter de petróleo. (H) A câmara de migração é colocado na posição vertical, seguido pela adição de células ao colagénio suspensão. Subsequentemente, a câmara de migração é colocado dentro de uma incubadora permitindo a suspensão de células-colagénio para polimerizar. (I, J) A câmara de migração é preenchida com meio e selada com cera de parafina fundida / petróleo mistura geleia no quarto lado. Depois disso, as câmaras de migração são colocados sob um microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sinopse de análise de dados migração celular. (A) arquivo de dados de rastreamento de celular. The atividades migratórias de 30 células é determinada por experiência, em que são analisados 60 pontos no tempo. Um "," uma célula indica que não se moveu entre os dois pontos, ao passo que um "valor numérico" indica o movimento celular. (B) Este esquema é uma vista esquemática dos dados apresentados em (A). Cada diamante indica que um passou entre dois pontos no tempo; uma linha indica mais movimento. As linhas cinzentas foram incluídos para visualizar que a população de células consiste em células não-móveis e células (que, no entanto, fazer pausas) em movimento. (C) Tempo de movimento activo (tempo activo) representa a percentagem do tempo total de uma célula possui migrado em relação ao tempo total do período de observação. Uma vez activo, de 20% e um tempo total de 15 horas indica que esta célula passou no total de 3 horas. Este parâmetro é mais utilizado para determinar o número de células que não se movem, o que é equivalente a um tempo de 0% activo (D). (E) Alternativamente, a atividade locomotora das células analisadas pode ser exibida como um diagrama BoxPlot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. dados representativos de migração de células MDA-HER2 e células de cancro da mama MDA-NEO. Células foram tratadas com 100 ng / mL de EGF, 2 uM U73122 ou com um co mbination de ambos. (A, B) A média de actividade locomotora de MDA-HER2 (A) e em células de dependência de tempo MDA-NEO (B). (C, D) BoxPlot diagrama da actividade locomotora médio, o que representa a 2 horas a 13 h de intervalo de tempo (ver barra em A, B) () de MDA-HER2 (C) e células MDA-NEO (D). A significância estatística foi calculada usando o Mann-Whitney- U -test. *** = P <0,001. (E, F) histograma do tempo activo de MDA-HER2 (E) e MDA-NEO (F), as células. Uma vez ativo de 0% indica que as células não mudaram durante o período de observação. Conjuntamente, um tempo ativo de 20% indica que, considerando-se um período de observação de 15 horas, essas células se mudaram para até 3 horas. Mostram-se a média de pelo menos três experiências independentes.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A capacidade de migrar é uma característica de células tumorais 4. Sem a capacidade de separar a partir do tumor primário e migração das células tumorais através de tecidos conjuntivos circundantes não irá ser capaz de propagar lesões secundárias, que são a principal causa de morte de quase todos os pacientes com cancro. Devido a esta relação muitos estudos estão se concentrando na migração de células cancerosas. O objectivo destes estudos é a identificação de novas moléculas de alvo e vias alvo que bloqueiam eficazmente a migração de células tumorais, prejudicando ou abrandar a formação de metástases. Um exemplo para um tal esforço pode ser β-bloqueadores, que foram mostrados para inibir a disseminação metastática de células de cancro da mama, in vitro e in vivo 36, e que tem sido associada com uma melhoria da sobrevivência livre de doença em doentes com mama triplo negativo células cancerígenas 37. Recentemente, demonstramos que as células híbridas, que derivados de spontaneeventos de fusão entre ous um humano linha celular epitelial da mama e uma linha de células de cancro da mama humano, mas não as células progenitoras, respondeu ao CCL21 quimiocina com um aumento da actividade migratória 26. CCL21 tem sido associada com a formação de nó de linfa de metástase de vários tipos de cancro, incluindo cancro da mama 38, sugerindo que a fusão de células pode ser um processo como do tumor (células híbridas) pode adquirir propriedades metastáticas 39,40.
O ensaio de migração de matriz de colagénio 3D tem várias vantagens, em comparação com o ensaio de câmara de Boyden / transwell e o ensaio de risco / ferida ensaio de cura. Em primeiro lugar, as células são incorporados dentro de um ambiente fisiológico 3D. Como dito acima, o comportamento migratório das células difere marcadamente entre um ambiente bidimensional e 3D 3,14,15. Assim, pode concluir-se que o comportamento migratório das células incorporado dentro de uma estrutura 3D colagénio assemelha-se mais para a situação in vivo, do que o LOCOMatividade otory de células que rastejam sobre uma superfície bidimensional. Em segundo lugar, devido à gravação de vídeo de lapso de tempo, é possível analisar a migração de diversas células ao longo de um determinado período de tempo, o que permite a determinação de vários parâmetros de migração celular. Por contraste, na câmara de ensaio / transwell Boyden apenas as células são consideradas para análise que foram transferidos para o compartimento inferior. As células que migram são, por exemplo, na parte superior da membrana não são incluídas na análise de dados, mesmo que eles são migratórios activo.
A matriz de colagénio 3D pode ser combinada com dispositivos de microfluidos, que além de mimetizar a matriz extracelular que também imitar o fluido intersticial, o que tem sido demonstrado que afectam a morfologia e a migração de vários tipos de células, tais como fibroblastos, células cancerosas, células endoteliais e as células-tronco mesenquimais 41. Dados de Haessler et al. Revelou que o fluxo intersticial aumenta a percentagemde células que se tornam migratório, bem como aumenta a velocidade migratório em cerca de 20% das células 42. Além de estudar o comportamento quimiotáctico de células, por exemplo, leucócitos / linfócitos ou células de tumor, uma configuração de microfluidos 3D é também uma ferramenta adequada para estudar intravasamento de células tumorais e endoteliais função de barreira 43.
Embora o ensaio de migração de matriz de colagénio 3D é uma ferramenta adequada para analisar a migração de células, em resposta a um estímulo ou de um inibidor ou uma combinação de ambos que tem de notar-se que este ensaio fazem também tem algumas limitações. Por exemplo, só o colágeno tipo I é usado para imitar a matriz extracelular, que, no entanto, é uma mistura complexa de vários componentes, incluindo proteoglicanos, não proteoglicanos (eg, ácido hialurónico), fibras de colágeno, bem como fibronectina e laminina e que composição varia mais acentuadamente entre os diferentes tecidos conjuntivos em diferentes órgãos
Outro ponto crítico em decifrar as células atividade migratória é o procedimento de rastreamento celular. Para obter dados válidos e objetiva, é obrigatório que o caminho de uma única célula é analisada com precisão. Rastreamento das células foi realizada manualmente por mão, o que exige experiência de acompanhamento de células paraobter dados objetivos. Para melhorar ainda mais os dados de e para evitar um número crítico de células positivas falsas estamos a utilizar um nível de corte de 25 um, o que significa que as células que migraram, menor do que 25 um foram excluídos da análise dos dados. Da mesma forma, as células são escolhidos aleatoriamente para seguir sem saber se eles são migratórias ativa ou não, para evitar dados tendenciosos.
Nos últimos anos, diversos pedidos automáticos de software de seguimento de células têm sido desenvolvidos, em que alguns deles são adequados para a análise de células e de rastreamento de partículas numa configuração 3D 18. A vantagem dessas aplicações é que as células que migram são verdadeiramente analisada de forma objetiva. Por causa disso, seria interessante comparar os dados de rastreamento de células automatizado com dados de rastreamento de celular manualmente feitas.
Como mencionado acima, o padrão-ouro para analisar a migração de células dentro de um contexto fisiológico 3D é o uso do wi imagem intravital combinadoº 2 fótons do laser de varredura de microscopia confocal. A vantagem deste teste é que as células que migram são incorporados dentro do seu ambiente fisiológico constituído por factores específicos solúveis, hormonas, etc, componentes da matriz extracelular, bem como as interacções célula-para-célula. É notável ver filmes que mostram como os linfócitos são o tráfico dentro de um linfonodo 17, como células do sistema imunológico estão se comunicando uns com os outros 48 ou como os medicamentos são distribuídos in vivo em um único nível celular 12,49.
No entanto, a imagem intravital combinado com microscopia confocal de varredura a laser 2-fóton é uma técnica bastante caro em termos de custos, devido à necessidade de um microscópio apropriado e modelos animais apropriados. Da mesma forma, não é realmente apropriado para estudar a influência de factores / inibidores solúveis individuais sobre a migração de células particulares ou a análise de migração de células relacionadas cascatas de transdução de sinal. Para estes fins mi celularesOs ensaios são recomendados gração permitindo a análise dos tipos de células distintos, que podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, sobre-expressão ou knockdown de moléculas-alvo, em condições experimentais definidas. Por causa da relação articulada entre um ambiente 3D e o comportamento de células locomotora, concluímos que o teste de migração 3D matriz de colagénio é, assim, um método versátil para estudar a migração de células num ambiente in vitro que se aproxima da situação in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
