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Bioengineering

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963

Summary

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Abstract

La capacidad de migrar es un sello de diversos tipos de células y juega un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y la respuesta inmune. Sin embargo, la migración celular también es un mecanismo clave en el cáncer permitiendo estas células cancerosas para desprenderse del tumor primario para iniciar la diseminación metastásica. En los últimos años se han desarrollado varios ensayos de migración celular para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células. Debido a que el comportamiento de locomoción de las células difiere notablemente entre una de dos dimensiones (2D) y tres dimensiones medio ambiente (3D) se puede suponer que el análisis de la migración de las células que están incrustados dentro de un entorno 3D produciría en la migración celular más significativo datos. La ventaja del ensayo de migración de matriz de colágeno 3D descrito es que las células están incrustadas dentro de una red 3D fisiológica de las fibras de colágeno que representan el componente principal de la matriz extracelular. Debido alapso de tiempo de microscopía de vídeo real de la migración celular se mide permitiendo la determinación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos / leucocitos, células madre, y células tumorales. Del mismo modo, también grupos de células o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en la red de colágeno. Llegamos a la conclusión de que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es un método versátil para analizar la migración de células dentro de un entorno 3D-como fisiológico.

Introduction

Al igual que la fusión celular (para una revisión ver 1,2) la migración celular es otro fenómeno biológico que está involucrado en una plétora de procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y las respuestas inmunes (para una revisión véase 3). Sin embargo, la capacidad de migrar es también un requisito previo para las células tumorales metastatizan a (para revisión ver 3,4).

La migración celular es un complejo, proceso aún no completamente entendido que está dirigida por la interacción de varias vías de transducción de señales iniciada por varios ligando (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular) del receptor (por ejemplo, tirosina quinasas receptoras, receptores de quimioquinas, integrinas) interacciones 5 en última instancia provocan la reorganización del citoesqueleto de actina concomitante con de- y montaje de complejos de adhesión focal y la integrina mediada por la señalización 6.

in vitro y en ensayos de migración celular in vivo se han desarrollado en las últimas décadas, incluyendo el ensayo Boyden cámara / transwell 7, cero ensayo / cicatrización de heridas ensayo de 8-10, en tres dimensiones ( 3D) ensayo de migración de matriz de colágeno 11, así como intravital de imágenes / microscopía (para revisión ver 12). Cada uno de estos ensayos de migración celular tiene ventajas y desventajas, por ejemplo, en relación con los costos y la necesidad de equipos, manipulación o fiabilidad de los datos obtenidos.

Tanto la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo ensayo de rayado / cicatrización de heridas son fáciles, de bajo costo y ensayos bien desarrollados para medir la migración de células in vitro 7-10. En la cámara de Boyden / Transwell células de ensayo se siembran en la parte superior de un inserto que contiene poros (alrededor de 8 micras de diámetro) - el llamado compartimiento superior 7. Opcional, el inserto podría ser recubierto con m extracelularAtrix componentes, por ejemplo, fibronectina, colágeno, etc, para imitar un entorno más fisiológico. Del mismo modo, las células endoteliales podrían ser cultivadas en la parte superior del inserto, imitando de ese modo una barrera de células endoteliales 13. Aquellas células que han pasado a través de los poros durante un intervalo de tiempo definido en el compartimiento inferior que alberga medios de comunicación y los suplementos, tales como factores de crecimiento y quimiocinas, se utilizan como un dispositivo de lectura para cuantificar la migración celular (o extravasación).

En el ensayo de rayado / curativas células de ensayo de la herida se siembran en placas y se cultivan hasta la confluencia 10. En dependencia de las placas de ajuste experimentales podría ser pre-recubierto con componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina. Después de crear un rasguño / herida por raspado de las células individuales en monocapa de células de cada lado del arañazo / herida puede migrar en el espacio, llenando así / curarla 10. La distancia entre los dos lados de los arañazos / heridas se determinaen dependencia del tiempo y se usa como un dispositivo de lectura para la actividad migratoria de las células 10. Sin embargo, para discriminar entre la proliferación celular (que podría resultar también en el llenado / curación del cero / herida) y la migración celular se recomienda combinar el ensayo con microscopía de vídeo de lapso de tiempo y de una sola célula de seguimiento 10.

Sin embargo, tanto la cámara de Boyden / ensayo Transwell y cero ensayo / ensayo de cicatrización de la herida, son más bien imperfecta relativa a un entorno celular-como fisiológico. En la cámara de Boyden / células de ensayo Transwell tienen que migrar a través de un poro de plástico, mientras que en el ensayo de rayado / cicatrización de heridas células de ensayo se sembró en una placa de plástico pre-recubierto de dos dimensiones. Asimismo, es bien reconocido que el comportamiento migratorio difiere notablemente entre un medio ambiente de dos dimensiones y 3D 3. Por ejemplo, las adherencias en tres dimensiones de matriz de fibroblastos se diferencian de las adhesiones focales fibrilares y caracterizados en dossustratos -dimensionales en su contenido de α5β1 y integrinas αvβ3, paxilina, otros componentes del citoesqueleto, y la fosforilación de tirosina quinasa de adhesión focal 14. Del mismo modo, las células embebidas dentro de un entorno 3D también muestran un comportamiento migratorio alterada 15. Así, para analizar la migración de células con más precisión un ensayo de migración se recomienda permitir para medir la migración de células individuales dentro de un entorno fisiológico o fisiológico-como 3D.

Intravital de imágenes / microscopía es el estándar de oro para la medición de la migración de células dentro de un contexto fisiológico 3D. Esto no sólo pertenecen a las interacciones célula-matriz extracelular, sino también a las interacciones entre los diferentes tipos de células, tales como células tumorales y las células endoteliales durante la extravasación 16 o el tráfico de linfocitos en el ganglio linfático 17, que, hasta la fecha, es posible debido a mejora de las técnicas de microscopía de fluorescencia, tales como 2-fotónmicroscopía de barrido láser confocal, el uso de colorantes fluorescentes vitales y cepas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes derivados 12,16,17. Además, intravital de imágenes / microscopía podría combinarse con el seguimiento de células manual y automatizado 18. Sin embargo, debido a la necesidad de un 2-fotón láser confocal de microscopía de barrido, así como animales (y modelos de animales transgénicos adecuados) intravital de imágenes / microscopía es una técnica bastante onerosa.

Para superar las limitaciones de la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo de curación de cero ensayo / herida y para analizar la migración de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D fue desarrollado 11,19. De esta manera, las células que migran están incrustados dentro de una red de fibras de colágeno en 3D, lo que más se asemeja a la situación in vivo. Conjuntamente, debido al time-lapse video microscopía migración celular verdadero se mide lo que permite la deternación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos y leucocitos 11,20 madre hematopoyéticas, células progenitoras / 21-24, y las células tumorales 5,25-29. Además de las células individuales también cúmulos celulares o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en el colágeno celosía 30,31.

Este protocolo presenta una visión general acerca de una técnica sencilla, pero de gran alcance para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D - un método in vitro ceder en los resultados que están cerca de la situación in vivo.

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Protocol

1 Preparación de Cámaras de migración

  1. Preparar una jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezcla y calentar hasta que la mezcla se haya derretido. El uso de un cepillo de pintura y dibujar 2-3 capas de la jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezclar en el medio de la lámina de vidrio de acuerdo a las figuras 1B-1D.
    NOTA: Estamos utilizando portaobjetos de vidrio común (76 x 26 x 1,0 a 1,5 mm (W / D / H))
  2. Aplique la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo derretido rápidamente en el portaobjetos de vidrio para evitar la solidificación mientras dibuja. Asegúrese de que la capa de jalea de cera de parafina / petróleo es de alrededor de 2-2,5 cm de longitud y 0,3-0,5 cm de ancho. El espesor de la capa de gelatina de cera de parafina / petróleo debe ser de aproximadamente 0,1-0,15 cm.
  3. Añadir un cubreobjetos a la cera de parafina solidificada / mezcla de vaselina y sellarlo con dos o tres capas de parafina jalea mezcla de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Utilice 4-8 cámaras de migración para un experimento de migración celular común. Cámaras Lugar de migración in una posición vertical en un rack.

2. preparación de la suspensión de la mezcla de la célula de colágeno

  1. Cosecha (por ejemplo, con 0,25% de tripsina / EDTA) y contar las células de interés. Resuspender las células en medio completo que contenía suero de ternera fetal (FCS), antibióticos y suplementos recomendados. Preparar 4-8 1,5 ml tubos de reacción y 20 l de suspensión celular que contiene 4-6 x 10 4 células (el número total de células depende del tipo de célula a analizar) y rellenar hasta 50 l con medio completo.
    NOTA: Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de crecimiento, quimiocinas, inhibidores, etc) se añaden a la suspensión celular. Utilice soluciones madre apropiadas de tal manera que el volumen final de suspensión de células no exceda de 50 l.
  2. Preparar una cantidad total de 452 l de suspensión final de colágeno durante cuatro experimentos de migración celular. Añadir 50 l de 10x MEM (pH 5.1 a 5.5) y 27 l de solución de bicarbonato de sodio 7,5% (pH 9,0-9,5) A un tubo de reacción de 1,5 ml y mezclar bien. Observe el cambio de color de la solución de color amarillo-naranja a púrpura intenso (pH 9,0 a 9,5). Añadir 375 l de suspensión de colágeno líquido a la solución de bicarbonato de 10x MEM / sodio y mezclar bien. El pH de la suspensión de colágeno final debería ser de aproximadamente 7,5 (indicado por un color púrpura claro).
    NOTA: Verifique el pH de la solución de bicarbonato de sodio al 7,5%. Si el pH es de aproximadamente 7,5 a cabo la solución de bicarbonato de sodio con una tapa abierta en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para ser saturada con CO 2 y aumentar el pH (aproximadamente 9,0 a 9,5). El pH de la mezcla de células en suspensión de colágeno es crucial para la estabilidad de la red de colágeno. Si es demasiado baja, la red de colágeno se derrumbará durante el experimento la migración celular.
    NOTA: Para este protocolo, utilizar colágeno líquido (pH 1.9 a 2.2) de hind bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno, y el 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Ejemplos de protocolos de preparación de celosía más de colágeno utilizandocolágeno tipo I procedente de otras fuentes, tales como porcino o rata, se dan en 32,33. No cambie los volúmenes de las soluciones utilizadas o modificará la última concentración de colágeno de 1,67 mg / ml de la red. Una concentración de colágeno mayor o menor tiene un impacto en la densidad de las fibras de colágeno y la distancia media entre ellos concomitante con las células comportamiento migratorio 34.
  3. Añadir 100 l de la suspensión de colágeno final a 50 l de suspensión celular y mezclar thoroughly.The suspensión de colágeno final (1,67 mg / ml de colágeno) es ligeramente viscosa. Para transferir la cantidad correcta (100 l), la pipeta la solución de colágeno final una vez arriba y abajo antes de transferirla a la suspensión celular.
    NOTA: Una vez que la mezcla de células en suspensión de colágeno se combina con la solución de bicarbonato de sodio / 10x MEM y el valor del pH ha cambiado a 7,5 las fibras de colágeno comienzan inmediatamente para polimerizar.
  4. Transferir la mezcla de células en suspensión final de colágeno de Thtubos de reacción e para las cámaras de migración. Golpear suavemente la cámara de migración para distribuir por igual la mezcla de células en suspensión de colágeno en la parte inferior de la cámara de la migración (Figura 1H). Colocar las cámaras de migración en una posición vertical en un bastidor y se incuba durante aproximadamente 30 min (37 ° C, 5% CO 2) para permitir la polimerización de las fibras de colágeno.
  5. Observe que la red de colágeno polimerizado es ligeramente turbia pero aún siendo la luz de color púrpura. Llenar las cámaras de migración con medio completo o medio completo con suplementos de interés y sellar la cámara de la migración con la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo (figuras 1I, 1J).

3. registro y análisis de la migración celular

En esta sección se describe la grabación de la migración celular por microscopía de vídeo time-lapse y el análisis de la migración celular por el seguimiento manual de células.

  1. Encienda el microscopio y el hea platina del microscopioter. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Utilice un objetivo de 10X. Coloque cámara de migración bajo un microscopio y enfocar aproximadamente 50 células o más en el campo de visión.
  2. Migración celular Record en modo de lapso de tiempo utilizando una aplicación de software de vídeo vigilancia multicámara. Guarde las películas de migración celular en un formato adecuado, por ejemplo, "* avi" o "* Mov". Enlace los archivos de película de migración celular a una base de datos que contiene información de apoyo, tales como el tipo de células y las condiciones experimentales.
    NOTA: Estamos grabando linfocitos y HSPCs para un máximo de 2 horas usando un factor de lapso de tiempo de 1:80, lo que significa que 0,75 segundos en tiempo-lapse es igual a 1 min en tiempo real. Las células tumorales son células que se mueven lentamente y por lo tanto se registran por lo menos durante 16 horas utilizando un factor de lapso de tiempo de 1: 1800 (0,5 segundos en tiempo-lapse es igual a 15 minutos en tiempo real).
  3. Analizar películas migración celular utilizando una aplicación de software de seguimiento celular apropiada, como plugins de software ImageJ(Una visión general se da en 18). Para un análisis imparcial que es de crucial importancia que las células serán seleccionados al azar sin el conocimiento si las células son migratorias activo o no.
    NOTA: Estamos utilizando una aplicación de software libre desarrollado para rastrear manualmente los caminos de al menos 30 células por experimento siguiendo las células en movimiento con precisión con el cursor del ratón (que se sitúa en el núcleo). Mientras que el seguimiento, los xy coordenadas de las células de orugas se determinan automáticamente de acuerdo al modo de lapso de tiempo utilizado. Para linfocitos / HSPCs coordenadas xy se determinan cada 0,75 seg (igual a 1 min de tiempo real), mientras que para las células tumorales las coordenadas xy se determinan cada 0,5 seg (igual a 15 min de tiempo real).
  4. Determinar un total de 60 xy coordenadas por célula para un experimento típico de la migración celular. Esto es igual a 1 hr en tiempo real para los linfocitos / HSPCs y 15 hr en tiempo real para las células tumorales. A "," indica que una célula no se ha movido entre two puntos de tiempo, mientras que un "valor numérico" indica la distancia en "píxeles" una célula ha movido entre 2 puntos de tiempo (Figura 2a).
    NOTA: seguimiento celular manual requiere experiencia. Particularmente células que migran rápido son difíciles de rastrear y cada tipo de células exhiben un comportamiento migratorio distinto que podría ser desencadenada por factores suplementados. En caso de división celular mientras que el seguimiento, elegir al azar una célula hija para el seguimiento continuo. Las células que migran fuera del campo de visión o mueren mientras que el seguimiento no se han descuidado, pero se consideran para el análisis.

Análisis 4. Datos

  1. Analizar los datos de seguimiento de células mediante el uso de una aplicación de software apropiada, por ejemplo, un programa de hoja de cálculo.
    1. Analizar los datos de seguimiento de células copiando la célula de seguimiento de datos en bruto (Figura 2A), en una plantilla de hoja de cálculo de diseño propio. Multiplique suma de los "valores numéricos", que representala distancia total de una célula ha migrado con un factor de corrección para convertir "pixel" en "m".
    2. Determinar dos parámetros de migración celular: la actividad locomotriz (que es equivalente a la tasa de migración) y el tiempo de movimiento activo (Figuras 2C, 2D).
    3. Identificar las células que han migrado menor que 25 micras (nivel de umbral para reducir el número de células positivas falsas) como células que no se mueva. Vuelva a colocar los "valores numéricos" de estas células con ",".
      NOTA: El parámetro "actividad locomotriz" (o tasa de migración) representa el porcentaje de células de la población de células seguimiento que se han movido entre dos puntos de tiempo (Figura 2D). Un "valor numérico" se define como una célula en movimiento, mientras que "," se define como una célula no en movimiento. El parámetro "tiempo de movimiento activo" (tiempo activo) representa el porcentaje del tiempo total de una célula ha migrado en Remento a los plazos del período de observación (Figura 2C). Un "valor numérico" indica que una célula se ha movido, mientras que "," indica que una célula no se ha movido. Este parámetro se utiliza además para determinar el número de células que no se ha movido.
  2. Calcular la significación estadística y visualización de datos de migración celular.
    1. Calcular la significación estadística de la actividad locomotriz media de la células (tasa de migración) mediante la prueba de Mann-Whitney. Considere el valor de p <0,05 como significativo.
    2. Mostrar la actividad locomotriz medio de células como xy-diagrama, diagrama DiagramaCaja, o como un diagrama de barras. Mostrar los datos basados ​​en células individuales, tales como el tiempo de movimiento activo o la velocidad, como un diagrama de barras o como un histograma.
      NOTA: Si la aplicación de software de hoja de cálculo elegido no contiene una tabla o gráfico de histograma herramienta DiagramaCaja una búsqueda en línea se debe realizar para buscar adecuado matorials.

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Representative Results

El ensayo de migración de matriz 3D-colágeno utilizado combinado con lapso de tiempo de video-microscopía y seguimiento celular asistida por ordenador permite la determinación de diversos parámetros de migración celular, incluyendo tanto parámetro basado en la población (por ejemplo, la media de la actividad locomotriz) y parámetros basados ​​en células individuales (por ejemplo, el tiempo de movimiento activo, velocidad, distancia migró). Un ejemplo de los conjuntos de datos de seguimiento de células obtenidas, procesamiento de datos y la presentación de los datos se dan en la Figura 2. Una célula de seguimiento de archivo de datos se parece a una tabla (Figura 2A). Cada columna representa una célula seguimiento, con lo que por célula experimento de migración 30 células se realiza un seguimiento. Las filas contiene la información de si una celda se ha movido o no entre dos puntos de tiempo. La suma de los "valores numéricos", que representan la distancia en "pixel" una célula se ha movido entre dos puntos de tiempo, es la distancia total de esta célula ha migrado. Se multiplica por acfactor de orrection convertir "pixel" en "m". Las células que han migrado menor que 25 m se definen como células que no se mueve para reducir el número de células positivas falsas. La velocidad (m / min) de cada célula se calcula dividiendo "distancia total migrado" por "tiempo total (min) del período de observación".

Para caracterizar el comportamiento de locomoción de las células comúnmente se utilizan dos parámetros. Actividad locomotriz (Figura 2D) representa la actividad locomotriz (o tasa de migración) media de la población de células analizadas, mientras que el tiempo de movimiento activo (Figura 2C) representa el tiempo total de una célula ha migrado dentro del período de observación. Este último parámetro se utiliza además para determinar el número de células que no se ha movido. La razón para usar dos parámetros de migración de células para el análisis se atribuye al hecho de que la actividad de locomoción de las células puede ser desencadenada por differemecanismos nt. Hay tres posibilidades como, por ejemplo, un factor de crecimiento, puede "inducir" la migración de células: a) en comparación con el control de más células están migrando, b) el número de células en movimiento en comparación con el control no ha cambiado, pero el factor de crecimiento tratados las células exhiben un aumento del tiempo de movimiento activo, lo que significa que estas células migren durante un tiempo más largo, y c) una combinación de a) y b).

El diagrama de la Figura 2B ilustra esquemáticamente cómo se calcula la actividad locomotriz y el tiempo de movimiento activo. En este ejemplo se muestran las actividades migratorias de células 120 (que es igual a cuatro experimentos independientes). Cada diamante indica que una célula se ha movido entre al menos dos puntos de tiempo (independientemente de la distancia que la célula ha migrado!). Las líneas grises se añadieron a este diagrama para mostrar que la población analizada de células consiste en mover y células no en movimiento. El parámetro "LOCOMactividad otory "representa la actividad locomotriz de la población de células analizadas en dependencia de cada punto de tiempo (Figura 2D). Por ejemplo, una actividad locomotriz de 10% en t = 5 h indica que entre t = 4,45 h y t = 5 h 10% de las células analizadas se han movido. Cuando se muestra como un diagrama xy la actividad locomotriz parámetro indica la dinamicidad de la población de células analizadas. Otra posibilidad para mostrar la actividad locomotriz de una población celular es el diagrama de DiagramaCaja (Figura 2F).

El parámetro "tiempo de movimiento activo" (tiempo activo) se correlaciona con el tiempo total de una célula se ha movido durante el período de observación, mediante el cual un tiempo activo de "0" indica que una célula no se ha movido (Figura 2C). El tiempo activo de las células se puede mostrar como un histograma.

La interacción de EGFR / HER2 / PLC-γ1 y HER2 / HER3 señalización / PI3K contribuye a unafenotipo migratorio de EGFR / HER2 / HER3 de mama positivos células cancerosas 25. Se requiere la señalización de PI3K para la generación de fosfatidil-3,4,5-trifosfato (PIP3), que actúa como una molécula de anclaje para PLC-1, reclutando de este modo esta enzima a la membrana plasmática para ser activado por tirosina quinasas receptoras 35. La estimulación de MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) las células de cáncer de mama exclusivamente EGFR positivos resultó en a largo plazo PLC-γ1 concomitante fosforilación de la tirosina con IP3 sostenida y los niveles de DAG que producen oscilaciones de calcio sinusoidales 27. Por el contrario, / MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) células de cáncer de mama positivo HER2 EGFR muestran oscilaciones de calcio transitorios de línea de base después del tratamiento EGF debido a la activación a corto plazo PLC-γ1 tirosina y IP3 a corto plazo y DAG rotación 27 que indica que la expresión de HER2 se correlacionó con un diferencial cinética de PLC-γ1 y señalización.

Análisis del comportamiento migratorio de MDA-HER2 y MDA-NEO líneas celulares de cáncer de mama reveló que las dos líneas celulares mostraron una actividad locomotriz espontánea similar (MDA-HER2: 23,0 a 28,9%, la mediana: 26,7% vs MDA-NEO: 19,3 a 24,4%, la mediana: 21,5%; las figuras 3A-3D ). El parámetro de tiempo activo, que representa el tiempo de movimiento activo de las células individuales en relación con el período de observación, reveló un número ligeramente mayor de movimiento espontáneamente células MDA-HER2 (64%; Figura 3E) en comparación con células de cáncer de mama MDA-neo ( 53%; Figura 3F). La estimulación con 100 ng / ml EGF resultó en un aumento significativo de la actividad locomotriz de las dos líneas celulares. La actividad migratoria de EGF tratada MDA-HER2 elevó a 30,4 a 35,2% (mediana 33,7%; las figuras 3A, 3C), que se atribuyó a la vez un aumento del número de células en movimiento (100 ng / ml de EGF: 81% frente al control: 64%) y un aumento del tiempo de movimiento activo. Por ejemplo, la cantidad de células MDA-HER2 exhibe un tiempo activo de 40% eraaumentó de 20% (control) a 28% (100 ng / ml de EGF). Datos similares se obtuvieron para las células MDA-NEO cáncer de mama, que la actividad migratoria se aumentó a 25,2 a 35,2 (mediana 30,4%; las figuras 3B, 3D) sobre la estimulación de EGF. Conjuntamente, más células MDA-NEO migraron en respuesta a la estimulación de EGF (100 ng / ml de EGF: 66% frente al control: 53%) y visualizado una vez cambiado el patrón activo (Figura 3F). Por ejemplo, la cantidad de células que poseen un tiempo de actividad del 60% se aumentó notablemente hasta 30% en presencia de EGF en comparación con células MDA-NEO no tratados (13%).

El tratamiento de las células MDA-NEO cáncer de mama con el inhibidor de PLC-γ1 U73122 MDA-HER2 y resultó en una inhibición tanto de la migración espontánea y EGF inducida de las células (Figura 3A-D). Sin embargo, en comparación con las células de cáncer de mama MDA-NEO el efecto inhibidor de U73122 sobre la migración espontánea de las células MDA-HER2 era bastante moderada, pero sin embargosignificativa (control: 23,0 a 28,9%, la mediana: 26,7% frente a 2 M U73122: 17,8 a 21,5%, la mediana: 20,0%; Figura 3C). Análisis del tiempo de parámetros activo reveló un ligero aumento en la cantidad de células que no se mueve en la presencia de U73122 (control: 36% frente a 2 M U73122: 48%; Figura 3E). Del mismo modo, el tratamiento U73122 bloqueó la migración inducida por EGF de células de cáncer de mama MDA-HER2 (100 ng / ml de EGF: 30,4 a 35,2%, la mediana de 33,7% frente a 100 ng ml EGF / 2 + M U73122: 19,3 a 24,1%, la mediana de 22,6 %; Figura 3C). De acuerdo con únicamente U73122 células tratadas MDA-HER2 este efecto inhibidor fue más bien atribuyó a una mayor cantidad de células que no se mueve, pero no un patrón de tiempo activo alterada (Figura 3C). De hecho, un ligero cambio hacia un aumento del tiempo de movimiento activo era detectable en la migración de células MDA-HER2 siendo tratados con EGF y U73122 (Figura 3C).

Por contraste, El tratamiento de células MDA-Neo con U73122 2 mM dio lugar a una marcada disminución de la actividad locomotriz de 5.6 a 10.7% (mediana: 9,3%; Figura 3F) que se atribuyó principalmente a un aumento en la cantidad de células que no se mueve (control: 47% vs. 2 M U73122: 79%; Figura 3F). Asimismo, la migración inducida por EGF de células de cáncer de mama MDA-NEO fue marcadamente bloqueado por U73122 a 1.1 a 7.4% (mediana: 4,8%), que se atribuyó a una mayor cantidad de células no en movimiento (100 ng / ml de EGF: 34 % frente a 100 ng / ml de EGF + 2 M U73122: 70%), así como a una disminución en tiempo patrón activo (Figura 3F).

Figura 1
Figura 1 Vista esquemática de la preparación de las cámaras de migración celular. (AE) Una cámara de migración celular se prepara mediante la elaboración dos y cincuenta y ocho capas de un parafi fundidon cera / petróleo de la mezcla de jalea en un portaobjetos de vidrio. (F, G) Se añade un cubreobjetos y se sella con la mezcla de parafina fundida jalea de cera / petróleo. (H) La cámara de migración se pone en una posición vertical seguido por la adición de la célula colágeno suspensión. Posteriormente, la cámara la migración se coloca en una incubadora que permite la suspensión de células de colágeno para polimerizar. (I, J) La cámara de la migración se llena con los medios de comunicación y sellado con parafina derretida cera / petróleo mezcla de jalea en el cuarto lado. A partir de entonces, las cámaras de migración se colocan bajo un microscopio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 Esquema general de análisis de datos de migración celular. (A) del archivo de datos de seguimiento de la célula. Thactividades migratorias e de 30 células se determina por experimento, en el que se analizan 60 puntos de tiempo. A "," indica que una célula no se ha movido entre dos puntos, mientras que un "valor numérico" indica el movimiento celular. (B) Este diagrama es una vista esquemática de los datos presentados en (A). Cada diamante indica que se ha movido entre dos puntos de tiempo; una línea indica que el movimiento más largo. Las líneas grises se incluyeron para visualizar que la población de células consiste en células que no se mueve y las células (que, sin embargo, hacer pausas) en movimiento. (C) Tiempo de movimiento activo (tiempo activo) representa el porcentaje del tiempo total de una célula tiene migrado en relación con el tiempo total del periodo de observación. Un tiempo activo de 20% y un tiempo total de 15 horas indica que esta célula se ha movido en total por 3 hr. Este parámetro se utiliza además para determinar el número de células que no se mueve, lo cual es equivalente a un tiempo activo del 0%. (D) (E) Por otra parte, la actividad locomotriz de las células analizadas se puede mostrar como un diagrama DiagramaCaja. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. datos de migración de células representativas de células de cáncer de mama MDA-NEO MDA-HER2 y. Células fueron tratadas con 100 ng / ml de EGF, 2 M U73122 o con un co mbination de ambos. (A, B) La media de la actividad locomotriz de MDA-HER2 (A) y las células en la dependencia en cuando MDA-NEO (B). (C, D) Diagrama DiagramaCaja de la actividad locomotriz media, lo que representa el 2 hr a 13 hr intervalo de tiempo (véase la barra, en B) (A) células de MDA-HER2 (C) y MDA-NEO (D). La significación estadística se calculó utilizando la test de Mann-Whitney-U. *** = P <0,001. (E, F) Parcelas de histograma de la época activa de MDA-HER2 (E) y las células MDA-NEO (F). Un tiempo activo del 0% indica que las células no se han movido durante el período de observación. Conjuntamente, un tiempo de actividad del 20% indica que, teniendo en cuenta un período de observación de 15 horas, estas células se han movido durante un máximo de 3 horas. Se muestra son la media de al menos tres experimentos independientes.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La capacidad de migrar es una característica de las células tumorales 4. Sin la capacidad de desprenderse del tumor primario y para migrar a través de las células tumorales del tejido conectivo circundante no será capaz de sembrar lesiones secundarias, que son la principal causa de muerte de casi todos los pacientes con cáncer. Debido a esta relación muchos estudios se centran en la migración de células de cáncer. El objetivo de estos estudios es la identificación de nuevas moléculas diana y las vías diana que bloquean eficazmente la migración de células tumorales, perjudicando de este modo o ralentizar la formación de metástasis. Un ejemplo de tal esfuerzo podría ser β-bloqueantes, que se ha demostrado que inhibe la diseminación metastásica de las células de cáncer de mama in vitro e in vivo 36 y que se han asociado con una mejora de la supervivencia libre de recaída en pacientes con cáncer de mama triple negativo células cancerosas 37. Recientemente hemos demostrado que las células híbridas, que derivan de SpontaneOU eventos de fusión entre una línea de células epiteliales de mama humano y una línea celular de cáncer de mama humano, pero no las células parentales, respondieron a la quimiocina CCL21 con un aumento en la actividad migratoria 26. CCL21 se ha asociado con la formación de metástasis de los ganglios linfáticos de varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama 38, lo que sugiere que la fusión celular podría ser un proceso de cómo las células tumorales (híbrido) podrían adquirir propiedades metastásicas 39,40.

El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D tiene varias ventajas en comparación con la cámara de Boyden / ensayo Transwell y el ensayo de rayado / ensayo de cicatrización de la herida. En primer lugar, las células están incrustadas dentro de un entorno fisiológico 3D. Como se dijo anteriormente, el comportamiento migratorio de las células difiere notablemente entre un entorno bidimensional y 3D 3,14,15. Por lo tanto se puede concluir que el comportamiento migratorio de las células incrustado dentro de una red de colágeno 3D se asemeja más a la situación in vivo que la LOCOMactividad otory de las células que se arrastran en una superficie de dos dimensiones. En segundo lugar, debido a la grabación de vídeo de lapso de tiempo, es posible analizar la migración de varias células en un cierto marco de tiempo, que permite la determinación de diversos parámetros de la migración celular. Por el contrario, en el ensayo de cámara / transwell Boyden sólo aquellas células se consideran para el análisis que se han trasladado a el compartimiento inferior. Aquellas células que migran por ejemplo, en la parte superior de la membrana no se incluyen en el análisis de datos a pesar de que son migratorias activo.

La matriz de colágeno 3D puede combinarse con dispositivos de microfluidos, que además de imitar la matriz extracelular no también imitar el líquido intersticial, que se ha demostrado que afectan a la morfología y la migración de diversos tipos de células, tales como fibroblastos, células cancerosas, células endoteliales , y células madre mesenquimales 41. Datos de Haessler et al. Revelaron que el flujo intersticial aumenta el porcentajede células que se convierten migratoria, así como aumenta la velocidad migratorio en aproximadamente el 20% de las células 42. Además de estudiar el comportamiento quimiotáctica de células, por ejemplo, leucocitos / linfocitos o células tumorales, un entorno de microfluidos 3D es también una herramienta adecuada para estudiar intravasación de células tumorales y la función de barrera endotelial 43.

También pesar de que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta adecuada para analizar la migración de células en respuesta a un estímulo o a un inhibidor o una combinación de ambos tiene que señalar que este ensayo hacemos tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, sólo el colágeno de tipo I se utiliza para imitar la matriz extracelular, que, sin embargo, es una mezcla compleja de varios componentes, incluyendo proteoglicanos, no proteoglicanos (por ejemplo, ácido hialurónico), fibras de colágeno, así como la fibronectina y la laminina y que composición varía más notablemente entre los diferentes tejidos conectivos en diferentes órganos 45 concomitante con un resultado diferencial. Por ejemplo, la estimulación-β1 integrina causó la activación de ERK en monocitos mientras β2-estimulación no lo hizo 46. Del mismo modo, PI3K se requiere para β1-integrina, pero no β2-integrina, mediada por la activación de NF-kB 46. Por otra parte, el colágeno tipo I es el más abundante de colágeno en el cuerpo humano 47 lo que sugiere que la migración de células está principalmente provocada por este tipo de colágeno.

Otro punto crítico en el desciframiento de las células de la actividad migratoria es el procedimiento de seguimiento de la célula. Para obtener datos válidos y objetivo, es obligatorio que el camino de las células individuales se analiza con precisión. Seguimiento de la célula se realiza manualmente con la mano, lo que exige experiencia de seguimiento célula aobtener datos objetivos. Para mejorar aún más los datos y evitar un número crítico de células positivas falsas que estamos utilizando un nivel de corte de 25 micras, lo que significa que las células, que han emigrado menor que 25 micras se excluyeron del análisis de datos. Del mismo modo, las células se eligen al azar para el seguimiento sin el saber si son o no migratoria activo para evitar datos sesgados.

En los últimos años se han desarrollado varias aplicaciones de software de seguimiento automático de células, por lo que algunos de ellos son adecuados para analizar celular y rastreo de partículas en una configuración de 3D ​​18. La ventaja de estas aplicaciones es que las células que migran son verdaderamente analizados de una manera objetiva. Debido a que sería interesante comparar los datos automatizados de seguimiento de celda con datos de seguimiento celular manualmente hechos.

Como se mencionó anteriormente, el estándar de oro para analizar la migración de células dentro de un contexto fisiológico 3D es el uso de wi intravital de imágenes combinadoº 2 fotones de escaneo láser microscopía confocal. La ventaja de este ensayo es que las células que migran están incrustados dentro de su entorno fisiológico que consiste en factores específicos solubles, hormonas, etc, componentes de la matriz extracelular, así como las interacciones de célula a célula. Es notable ver películas que muestran cómo los linfocitos se trata dentro de un ganglio linfático 17, cómo las células inmunes se comunican unos con otros 48 o cómo las drogas se distribuyen en vivo a un solo nivel celular 12,49.

Sin embargo, intravital de imágenes combina con 2 fotones confocal de escaneo láser microscopía es una técnica en lugar de costo-caro debido a la necesidad de modelos animales apropiados y un microscopio apropiado. Del mismo modo, no es realmente adecuado para estudiar la influencia de los factores / inhibidores solubles individuales sobre la migración de células particulares o el análisis de la migración de células relacionadas con cascadas de transducción de señales. Para estos propósitos mi celularesSe recomiendan ensayos gración permitiendo el análisis de tipos celulares discretos, que se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, sobreexpresión o desmontables de moléculas diana, en condiciones experimentales definidas. Debido a la relación fundamental entre un entorno 3D y el comportamiento de locomoción de las células se concluye que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es por lo tanto un método versátil para estudiar la migración de las células en un entorno in vitro que es cercana a la situación in vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

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Bioingeniería Número 92 la migración celular matriz de colágeno en 3D el seguimiento de la célula
Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional
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Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

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