Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Abstract

Göç etme yeteneği, çeşitli hücre tiplerinin ayırt edici bir özelliği olup, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Fakat, hücre göçü aynı zamanda yayılma metastatik başlatmak için primer tümörün ayırmak için, bu kanser hücrelerini etkinleştirerek kanserinde önemli bir mekanizmadır. Geçen yıllar içinde çeşitli hücre göçü deneyler, farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz için geliştirilmiştir. Hücrelerin lokomotor davranışı belirgin bir iki boyutlu (2D) arasında değişmektedir ve üç boyutlu (3D) ortamında 3 boyutlu bir ortamda gömülü olan hücrelerin göç analizi daha önemli hücre göçü olarak verim olacağını kabul edilebilir, çünkü Veri. Tarif edilen 3D kollajen matris, göç deneyi avantajı hücreler, hücre dışı matrisin başlıca bileşenini temsil eden kolajen liflerinin ve fizyolojik bir 3 boyutlu bir ağ içinde gömülü olmasıdır. Nedeniylezaman atlamalı görüntü mikroskopi gerçek Hücre göçü, ön-göç faktörleri veya inhibitörlerine tepki olarak çeşitli geçiş parametrelerine ve bunların değişikliklerinin tespitine imkan ölçülür. Çeşitli hücre tipleri hücreleri ve tümör hücreleri, lenfositler / lökositler de dahil olmak üzere, bu teknik kullanılarak kök incelenebilir. Benzer şekilde, aynı zamanda hücre kümeleri veya sferoidler kolajen kafes içine hücre kümesi / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir. Biz 3D kollajen matris göç deneyi fizyolojik-benzeri 3D ortamında hücrelerin göçünü analiz için çok yönlü bir yöntem olduğu sonucuna varıldı.

Introduction

Hücre füzyonu (genel bir bakış için bakınız 1,2) Hücre göçü, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık (inceleme için 3 bakınız) dahil olmak üzere, fizyolojik süreçlerin bir bolluk katılır başka bir biyolojik fenomen gibi. Ancak, göç yeteneği tümör hücreleri (inceleme için 3,4 bakınız) metastaz için bir önkoşul da.

Hücre göçü, bir kompleksi, çeşitli ligand (örneğin, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, hormonlar, hücre dışı matris bileşenleri) reseptör (örneğin, reseptör tirozin kinazlar tarafından başlatılan çeşitli sinyal transdüksiyon yollarının etkileşimiyle yönlendirilir henüz tam olarak anlaşılmamıştır süreçtir sonuçta de- ve fokal yapışma kompleksleri tekrar takılmasıyla ile aktin hücre iskeleti eşlik eden yeniden yapılanmasını neden kemokin reseptörleri, integrinleri) etkileşimler 5 6 sinyalizasyon integrin'in-aracılı.

in vitro ve in vivo çeşitli hücre göç deneyleri, hücre göçü analiz etmek tahlil 8-10, üç boyutlu (şifa Boyden odası / Transwell tahlilinde 7, çizilmeye tahlil / yara dahil, geçmiş yıllarda geliştirilmiştir 3D) kollajen matris, göç deneyi 11 yanı sıra, intravital görüntüleme / mikroskop (inceleme için 12 bakınız). Bu hücre göç deneyleri her artılarını ve eksilerini, örneğin, ilgili maliyetleri ve ekipman ihtiyacını, taşıma veya elde edilen verilerin güvenilirliği vardır.

Boyden odasının / Transwell deneyi ve çizik deney / yara iyileşme testi, hem de in vitro 7-10 hücre migrasyonun ölçülmesi için kullanımı kolay, düşük maliyetli ve gelişmiş tahliller bulunmaktadır. Olarak adlandırılan üst bölmeye 7 - Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili bir uç ihtiva eden gözenek (yaklaşık 8 um çapında) üzerine ekilir. İsteğe bağlı, uç hücre dışı m ile kaplanabilirAtrix parçalar, örneğin, fibronektin, kolajen, vb daha fizyolojik ortamı taklit etmek. Benzer şekilde, endotelyal hücreler, bu şekilde bir endotelyal hücre engeli 13 taklit eden, parçanın üstüne yetiştirilebileceğini. Bu gibi büyüme faktörlerinin ve kemokinlerin medya ve takviyeleri, barındırılması alt bölmeye tanımlanan bir zaman aralığı boyunca gözeneklerin içinden geçen bu hücreler, hücre göçü (veya ekstravazasyon) ölçmek için bir okuma olarak kullanılmaktadır.

Sıfırdan deneyde / yara iyileşmesi analiz, hangi hücrelerin plakalara ekilir ve ortak akışkanlığa gelinceye kadar büyütülür 10. Deney plakaları ayar bağlı olarak örneğin fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin, önceden kaplanmış olabilir. Sıfırdan her tarafında hücre tek tek hücreleri kazıyarak yara çizik / oluşturduktan sonra / yara böylelikle 10 şifa / dolum, boşluğa geçirebilirsiniz. Sıfırdan / yaraların iki tarafı arasındaki mesafe belirlenirzaman bağlı olarak ve hücreler 10 göç aktivitesi için bir okuma olarak kullanılır. Ancak, time-lapse video mikroskopi ve tek hücre 10 izleme ile tahlil birleştirmek için tavsiye edilir ve hücre göçü (ayrıca çizik / yaranın dolum / iyileşmeye neden olabilir), hücre çoğalması arasındaki ayrımcılık.

Ancak, Boyden odası / Transwell tahlil ve iyileşmesi deneyini çizik tahlil / yara, hem fizyolojik bir benzeri hücresel çevre ile ilgili oldukça kusurlu. Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili sıfırdan deney hücreleri iyileştirme deneyi / yara, iki boyutlu bir önceden kaplanmış plastik bir levha üzerine ekilir ise, plastik bir gözenekten geçiş gerekir. Aynı şekilde, iyi göç davranışı iki boyutlu ve 3 boyutlu bir ortamda 3 arasında belirgin farklılık olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, fibroblastlar üç boyutlu matris adezyonlar ile karakterize edici özelliği, iki fokal ve fibriler adezyonlardan farklıdırα5β1 ve αvβ3 integrinler, paxillin, diğer hücre iskeleti bileşenleri ve fokal yapışma kinaz 14 tirosin fosforilasyonu içindeki yoğunluğu boyutlu takım alt-tabakalar. Aynı şekilde, bir 3D ortamı içinde gömülü hücreler de değişmiş bir göç davranışı 15 görüntülenir. Böylece, daha doğru bir şekilde hücre göçünü analiz etmek için göç deneyi 3B, fizyolojik veya fizyolojik gibi bir ortam içinde tek hücre göçünü ölçmek için izin önerilir.

İntravital görüntüleme / mikroskop 3D fizyolojik bağlamında hücre göçü ölçmek için altın standarttır. Bu şimdiye kadar sadece nedeniyle mümkün olduğu, ancak, aynı zamanda, lenf düğümü 17, 16 ya da içindeki ekstravazasyon lenfosit ticaretinde tümör hücreleri ve endotelyal hücreler gibi farklı hücre tipleri arasında etkileşimler, hücre dışı matris-hücre etkileşimlerinin ait değil örneğin 2-foton şeklinde geliştirilmiş bir floresan mikroskopi teknikleri,konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri sentezleyen türevleri 12,16,17 hayati floresan boyalar ve transgenik fare suşlarının kullanılması. Buna ek olarak, intravital görüntüleme / mikroskop indirin otomatik hücre 18 izlemek için birleştirilebilir. Bununla birlikte, bir 2-foton odaklı lazer tarama mikroskobu ihtiyacı hem de hayvanlarda (ve uygun transjenik hayvan modellerinde) intravital görüntüleme / mikroskop oldukça maliyet-yoğun bir yöntemdir.

Boyden odası / Transwell tahlili ve çizik tahlil / yara iyileştirici testin sınırlamaları aşmak ve 3D kollajen matris göç deneyi 11,19 geliştirilen bir 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç analiz etmek. Böylece, göç edici hücrelerin 3B kolajen lif şebekesi, in vivo olarak daha fazla benzeyen, bir durum içinde gömülürler. Müştereken, time-lapse video mikroskopi gerçek hücre göçü nedeniyle saptamaya olanak ölçülürBirkaç göç parametreler yanı sıra yanlısı göçmen faktörler veya inhibitörleri tepki olarak kendi değişikliklerin ulus. Çeşitli hücre tipleri lenfosit ve lökositlerin 11,20, hematopoietik sap / 21-24 progenitör hücreleri ve tümör hücreleri dahil olmak üzere bu 5,25-29 teknik kullanılarak analiz edilebilir. Tek hücre yanı sıra, aynı zamanda, hücre kümeleri veya sferoidler 30,31 kafes kalojee Zigotun / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir.

In vivo durumu yakın sonuçlar veren bir in vitro yöntemle - Bu protokol, 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz etmek için basit, ama güçlü tekniği hakkında genel bir bakış sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Göç Odaları 1. Hazırlık

  1. Karışım kadar karışım ve ısı eridi: Bir parafin / vazelin (1 1) hazırlayın. Bir boya fırçası kullanarak parafin balmumu / petrol peltesi 2-3 katmanları çizmek (1: 1) Şekil 1B-1D uygun olarak cam slayt ortasında karıştırın.
    NOT: Biz ortak cam slaytlar kullanarak (76 x 26 x 1.0-1.5 mm (G / D / Y))
  2. Çizim sırasında katılaşma önlemek için cam slayt hızla eridi parafin / vazelin karışımı uygulayın. Parafin / vazelin tabakası uzunluğu yaklaşık 2-2.5 cm genişliğinde ve 0.3-0.5 cm olduğundan emin olun. Parafin mum / petrol jeli tabakanın kalınlığı yaklaşık 0.1-0.15 cm olmalıdır.
  3. Katılaşmış parafin / vazelin karışımı bir coverslip ekleyin ve 2-3 katmanları mum / vazelin karışımı parafin (Şekil 1E, 1F) ile kapatın. Ortak bir hücre göçü deneyi için 4-8 geçiş odaları kullanın. Yer göç odaları iBir rafa dik bir pozisyon n tane.

Kolajen Süspansiyon Hücre Mix 2. Hazırlık

  1. Hasat (örneğin,% 0.25 tripsin / EDTA) ve ilgili hücreleri sayın. Tam fetal buzağı serumu (FCS) içeren ortama, antibiyotikler hücrelerin tekrar ve ek önerilir. 4-8 1.5 ml'lik tepkime tüpleri ve 4-6 x 10 4 hücreleri (hücre toplam sayısı, analiz edilecek hücre türüne göre değişir) ihtiva eden 20 ul hücre süspansiyonu hazırlamak ve tam ortam maddesi ile 50 ul'ye kadar doldurun.
    Not: ek bileşikler (örneğin, büyüme faktörleri, kemokinler, inhibitörleri, vs), hücre süspansiyonu ilave edilir. Hücre süspansiyonunun nihai hacim 50 ul aşmayacak şekilde uygun bir stok solüsyonları kullanın.
  2. Dört hücre göçü deneyleri için 452 ul nihai kollajen süspansiyonun toplam miktar hazırlayın. 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) ve% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 27 ul (pH 9,0-9,5 ekleme), 1.5 ml'lik tepkime tüpüne ve iyice karıştırın. Yoğun mor (pH 9.0-9.5) sarı-turuncu çözüm renk dönüşü gözlemleyin. 10x MEM / sodyum bikarbonat solüsyonuna 375 ul sıvı kollajen süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai kollajen süspansiyonun pH değeri yaklaşık 7.5 olmalıdır (açık mor bir renk ile belirtilir).
    NOT:% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi ile pH değeri kontrol edilir. PH, yaklaşık 7.5 bir yerde bir kuluçka makinesi içinde bir açık kapağa sodyum bikarbonat çözeltisi ise (37 ° C,% 5 CO2) CO2 ile doyurulmuş ve pH (yaklaşık 9,0-9,5) yükseltmek için. Kollajen hücre süspansiyon karışımı pH kolajen ağının istikrarı için çok önemlidir. Eğer çok düşük ise, kollajen kafes hücre göçü deneyi sırasında çökecektir.
    NOT: Bu protokol için, sığır Arkadan gelen sıvı kolajen (pH 1.9-2.2) kullanın (2.9-3.3 mg / ml kollajen,% 95 kollajen tip I,% 5 kollajen tip IV). Kullanılarak daha fazla kolajen kafes hazırlık protokolleri örnekleriBöyle domuz ya da sıçan gibi diğer kaynaklardan kollajen tip I, 32,33 verilmiştir. Bu 1.67 mg / ml kafesinin nihai kollajen konsantrasyonunu değiştirmek gibi kullanılan çözeltilerin hacimleri değiştirmez. Daha yüksek ya da daha düşük yoğunluğu kolajen, kolajen liflerinin yoğunluğu ve hücrelerin göç davranışları 34 ile birlikte bunların arasındaki ortalama mesafe üzerinde bir etkisi vardır.
  3. 50 ul hücre süspansiyonu nihai kollajen süspansiyonu 100 ul ve thoroughly.The son kollajen süspansiyonu (1,67 mg / ml kolajen) karışımı hafif ağdalıdır. Doğru miktarda (100 ul) aktarmak için, hücre süspansiyonu aktarmadan önce bir kez yukarı ve aşağı nihai kollajen çözüm pipetle.
    Not: kolajen hücre süspansiyon karışımı, pH değeri 7.5 olarak değiştirildi 10x MEM / sodyum bikarbonat çözeltisi ile bir araya sonra kolajen lifleri hemen polimerize başlar.
  4. Th nihai kollajen süspansiyon hücre karışımı aktarıngöç odalarına e reaksiyon tüpleri. Hafifçe eşit geçiş odası (Şekil 1 H) alt kollajen hücre süspansiyon karışımı dağıtmak için geçiş bölmesinin dokunun. Rafa dik bir konumda geçiş odaları yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika inkübe edilir (37 ° C,% 5 CO2) kolajen liflerinin polimerleşmesine izin vermek.
  5. Polimerize kollajen kafes biraz bulanık ama hala açık mor renk olan dikkat edin. Ilgi takviyeleri ile, tam bir ortamda veya tam ortam ile geçiş odaları kadar doldurun ve parafin balmumu / vazelin karışımı (Şekil 1 i, 1 i) ile geçiş bölmesini sızdırmaz.

3. Kayıt ve Hücre Göç Analizi

Bu bölüm, manuel hücre takibi ile zaman atlamalı görüntü mikroskopi ve hücre göçü analizi ile hücre göçü kaydı tanımlamaktadır.

  1. Mikroskop ve mikroskop sahne Västergötland açınter. 37 ° C sıcaklık ayarlayın. 10X objektif kullanın. Mikroskop altında geçiş bölmesi yerleştirin ve görüş alanı, yaklaşık 50 ya da daha fazla hücre odaklanır.
  2. Bir çok kamera video izleme yazılımı uygulamasını kullanarak time-lapse modunda kaydedin hücre göçü. Örneğin, uygun bir formatta hücre göçü film kaydet, "* .avi" veya "* .mov". Böyle hücre tipine ve deney şartları, destekleyici bilgileri içeren bir veritabanı hücre göçü film dosyalarını bağlayın.
    NOT: time-lapse 0.75 sn gerçek zamanlı olarak 1 dakika eşit olduğu anlamına gelir 1:80 bir time-lapse faktörü kullanarak kadar 2 saat boyunca lenfositler ve HSPCs kaydediyor. Tümör hücreleri, yavaş hareket eden hücreler ve bu nedenle 1 bir zaman atlamalı faktörü kullanılarak, en az 16 saat boyunca kaydedilir: 1.800 (hızlandırılmış 0.5 sn gerçek zamanlı olarak 15 dakika eşittir).
  3. ImageJ yazılım eklentileri gibi uygun bir hücre izleme yazılımı uygulamasını kullanarak hücre göçü film Analiz(Genel 18'de verilmiştir). Tarafsız bir analiz için hücrelerin aktif ya da değil, göçmen olup olmadığını hücreleri rastgele bilgisi olmadan seçilmiş olacağı önem taşımaktadır.
    NOT: Biz manuel (çekirdeğine yerleştirilmiş) fare imleci ile doğru hareket hücrelerini takip ederek deney başına en az 30 hücre yollarını izlemek için kendi geliştirdiği yazılım uygulamasını kullanıyor. Takip ederken, izlenen hücrelerin xy koordinatları otomatik olarak kullanılan time-lapse moduna göre belirlenmektedir. Tümör hücreleri için xy-koordinatları (15 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.5 saniyede tespit edilir ise lenfositlerin / HSPCs xy-koordinatları, (1 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.75 sn belirlenir.
  4. Tipik bir hücre göçü deney için hücre başına 60 xy-koordinatlarının toplam belirleyin. Bu tümör hücreleri için lenfositler / HSPCs ve 15 saat için gerçek zaman 1 saat gerçek zamana eşittir. A "," hücre tw arasında taşınamaz olduğunu gösteriro zaman noktaları, bir "sayısal değer" ise "piksel" hücre 2 zaman noktalarında (Şekil 2A) arasında taşındı yılında mesafeyi gösterir.
    NOT: Manuel hücre izleme deneyimi gerektirir. Özellikle hızlı göç edici hücrelerin izlemek için zor olan ve her hücre tipi sergi takviye faktörler tarafından tetiklenebilir belirgin bir göç davranışları. Izleme sırasında hücre bölünmesi durumunda, rastgele izleme devam için bir kızı hücre seçin. Görüş alanının dışına göç veya izleme ihmal değil iken ölmek, ama analiz için kabul edilir Hücreler.

4. Veri Analizi

  1. Örneğin uygun bir yazılım uygulaması, bir elektronik tablo programı kullanılarak hücre izleme verilerini analiz edin.
    1. Bir öz-tasarlanmış elektronik tablo şablonu içine ham verileri (Şekil 2A) izleme hücreyi, kopyalayarak hücre izleme verilerini analiz edin. Temsil eden, "sayısal değerleri" toplamı çarpıntoplam mesafe bir hücre "um" içine "piksel" dönüştürmek için bir düzeltme faktörü ile göç etti.
    2. İki hücre göçü parametrelerini belirlemek: ve aktif hareket (Şekil 2C, 2D) zamanında (göç hızına eşdeğerdir) lokomotor aktivite.
    3. Hareketsiz hücreleri (yanlış-pozitif hücrelerin sayısını azaltmak için eşik değeri) 25 um den daha az göç eden hücrelerin belirlenmesi. "," Ile bu hücrelerin "sayısal değerlerini" değiştirin.
      NOT: parametre "lokomotor aktivite" (ya da göç oranı) iki kez puan (Şekil 2B) arasındaki taşındı izlenen hücre popülasyonunun hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Bir "sayı" "," ise, hareket eden bir hücre olarak tanımlanan bir hareketsiz hücre olarak tanımlanmıştır. Parametre "aktif hareket zamanı" (zaman aktif) bir hücre yeniden göç etti toplam süre yüzdesini temsilgözlem dönemi (Şekil 2C) zaman dilimine Lation. Bir "sayısal değer" "," bir hücre hareket değil belirtirken, bir hücre, hareket ettiğini gösterir. Bu parametre, daha fazla hareket değil hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılır.
  2. Istatistiksel olarak anlamlı ve ekran hücre göç verileri hesaplayın.
    1. Mann-Whitney U testi kullanılarak hücreler (göç oranı) ortalama lokomotor aktivite istatistiksel olarak anlamlı hesaplayın. P-değeri <anlamlı olarak 0.05 düşünün.
    2. Xy-diyagramı, Boxplot diyagram, ya da bir çubuk grafik diyagram olarak hücrelerin ortalama lokomotor aktivitesini gösterir. Bir çubuk grafik diyagram veya bir histogram gibi aktif hareket veya hız saati gibi tek bir hücre tabanlı veri, görüntüleme.
      NOT: seçilen tablosu programı uygulaması Boxplot grafik veya çubuk grafik grafik aracı içermiyorsa bir online arama uygun TU arıyor için yapılmalıdırtorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zaman atlamalı video mikroskobu ve bilgisayar destekli izleme hücre ile birlikte, kullanılan 3D-kollajen matris, göç deneyi popülasyon bazlı parametre (örneğin, lokomotor aktivitesi ortalama) dahil olmak üzere çeşitli hücre göçü parametreleri ve tek bir hücre bazlı parametrelerinin belirlenmesine izin verir (örneğin, aktif hareket, hız, mesafe zaman göç). Elde edilen hücre izleme veri setleri, veri işleme ve veri sunumu bir örneği Şekil 2'de verilmektedir. Veri dosyası takip eden bir hücre, bir tablo (Şekil 2A) benzer. Hücre göçü deney başına 30 hücre izlenir sayede her sütun, bir paletli hücre için duruyor. Satırlar, bir hücre taşınmış veya iki zaman aralığında olup olmadığını bilgileri içerir. "Pixel" bir hücrede mesafeyi temsil eden "sayısal değerleri", toplamı iki kez puan arasında taşındı, bu hücre göç etmiş toplam mesafedir. Bu ac ile çarpılır"um" içine "piksel" dönüştürmek orrection faktörü. 25 um den daha az göç etmiş hücreler, yanlış-pozitif hücrelerin sayısını azaltmak için hareketsiz hücreler olarak tanımlanmaktadır. Her hücrenin hızı (mm / dk) "gözlem süresi toplam süresi (dakika)" tarafından "göç, toplam mesafe" bölünmesi ile hesaplanır.

Genel olarak iki parametre kullanılan hücre lokomotor davranışını karakterize etmek için. Aktif hareketi (Şekil 2C) zaman hücre gözlem süresi içinde göç ettiği toplam süre ise lokomotor aktivitesi gösterir (Şekil 2D), analiz hücre popülasyonunun ortalama lokomotor aktivitesinin (ya da geçiş ücreti) temsil eder. İkinci parametre daha fazla değil taşınmış hücre sayısını belirlemek için kullanılır. Analizi için, iki hücre göçü parametre kullanılmasının nedeni, hücre lokomotor aktivitesi differe tetiklenebilir gerçeğine atfedilirnt mekanizmaları. , Örneğin, bir büyüme faktörü, hücre göçünü "yaratılması" nasıl üç olasılık vardır: a) daha fazla hücre göç etmekte kontrol ile karşılaştırıldığında, b) kontrol ile karşılaştırıldığında hücrelerin hareket sayısı değişmedi, fakat büyüme faktörü tedavi hücrelerin bu hücrelerin uzun bir süre boyunca hareket edeceği anlamına gelir aktif hareket, bir artış sergileyen bir zaman ve c) bir kombinasyon: a) ve b).

Şekil 2B'de şematik diyagram aktif hareketi lokomotor aktivitesi ve zaman nasıl hesaplandığını gösterir. Bu örnekte (dört bağımsız deneyden eşittir) 120 hücrelerinin göç aktiviteleri gösterilir. Her elmas bir hücrenin en azından iki zaman noktaları arasında hareket ettiğini gösterir (bağımsız hücre göç ettiği mesafenin!). Gri çizgiler hücrelerin analiz nüfus hareketli ve hareketsiz hücrelerden oluşur olduğunu göstermek için bu şemaya ilave edildi. Parametre "Locomotory aktivitesi ", her bir zaman noktasında (Şekil 2D) bağımsız olan analiz hücre popülasyonunun lokomotor aktivitesini temsil etmektedir. Örneğin, t = 5 saat sonra% 10 bir lokomotor etkinliği t = 4.45 saat ve T = 5 saat arasındaki analiz hücrelerin% 10 taşınmış gösterir. Xy-diyagram olarak gösterilen, parametre lokomotor aktivitesi analiz hücre popülasyonunun Dinamisitesi gösterir. Bir hücre popülasyonunun lokomotor aktivite göstermek için bir başka olasılık Boxplot şeması (Şekil 2F) 'dir.

"0" aktif bir zaman bir hücre (Şekil 2C) atmadığını belirten sayede parametre "aktif hareket zamanı" (zaman aktif) bir hücre gözlem döneminde taşındı toplam süre, bağıntılı. Hücrelerin etkin süresi, bir histogram olarak görüntülenebilir.

EGFR / HER2 / PLC-γ1 ve HER2 / HER3 / PI3K sinyalizasyon etkileşimi bir katkıda, EGFR / HER2 / HER3 pozitif göğüs kanseri hücrelerinin 25 göç fenotipi. PI3K sinyal böylece reseptör tirosin kinazlann 35 ile aktive edilmesi, sonra plazma zarına bu enzimi alımı, PLC-1 için bir çapa molekül olarak görev yapan fosfatidil-3,4,5-trifosfat (PIP3) 'in üretimi için gereklidir. EGFR sadece pozitif MDA-MB-468-NEO (MDA-NHN) göğüs kanseri hücrelerinin uyarılması sürekli IP3 ve sinüsoidal kalsiyum salınımlar 27 üreten DAG seviyeleri ile uzun süreli PLC γ1 tirozin fosforilasyonu eşlik eden sonuçlandı. Buna karşılık, EGFR / HER2 pozitif MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) meme kanseri hücrelerinde gösteren, kısa süreli PLC γ1 tirosin aktivasyonu ve kısa süreli IP3 ve DAG hacmi 27 EGF tedaviden sonra normal geçici kalsiyum salınımları gösterildi: Bu HER2 ekspresyon diferansiyel PLC-γ1 kinetik ve sinyal bir korelasyon saptandı.

MDA-HER2 ve MDA-N göç davranış analiziEO göğüs kanseri hücre çizgisi de hücre çizgileri de benzer bir spontan lokomotor aktiviteye sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır (MDA-HER2: 23,0-28,9% medyan MDA-NEO vs 26.7% 19,3-24,4%, ortalama 21.5%, Şekil 3A-3D ). MDA-NEO meme kanseri hücreleri ile karşılaştırıldığında (, aktif parametre zaman, gözlem süresi ile ilgili olarak, tek hücrelerin aktif olarak hareket zamanı temsil eden, kendiliğinden hareket eden MDA-HER2 hücre biraz daha yüksek bir sayı (Şekil 3E% 64) elde edilmiştir % 53; Şekil 3F). 100 ng ile stimülasyon / ml EGF her iki hücre arasında belirgin bir şekilde artan lokomotor etkinliği ile sonuçlanmaktadır. EGF göç aktivitesi, MDA-HER2 30.4 kaldırdı tedavi -% 35.2; hareket eden hücreler artan bir sayıda (/ ml EGF ng 100 hem atfedilen (ortanca 33.7% Şekil 3A, 3C),: kontrolü vs% 81: % 64) ve aktif bir hareket daha yüksek bir zaman. Örneğin, MDA-HER2 hücre miktarı% 40 aktif olduğunu gösteren bir saat% 28 (100 ng / ml EGF)% 20 (kontrol) yükselmiştir. (, Şekil 3B, 3D ortalama% 30.4), EGF stimülasyonu üzerine benzer veriler göç aktivitesi 25,2-35,2 yükseltildi, MDA-NEO meme kanseri hücreleri için elde edilmiştir. Birleşik olarak, daha MDA-NEO hücrelerinin EGF uyarılmaya karşılık olarak geçirilmiş (100 ng / ml EGF: 66 kontrol karşısında% 53%) ve değiştirilmiş bir zaman aktif bir yapısı (Şekil 3F) görülür. Örneğin,% 60 aktif olan bir süre sahip hücre miktarı belirgin bir şekilde muamele edilmemiş, MDA-NEO hücreleri (% 13) ile karşılaştırıldığında, EGF varlığında% 30 yükselmiştir.

MDA-HER2 ve PLC-γ1 inhibitörü U73122 MDA-NEO meme kanseri hücrelerinin tedavisi hücreleri (Şekil 3A-D) ve EGF kendiliğinden neden olduğu migrasyon her ikisinin bir inhibisyonu ile sonuçlanmıştır. MDA-NEO göğüs kanseri hücreleri MDA-HER2 hücrelerin spontan göçü üzerindeki U73122 inhibe edici etkisi oldukça ılımlı, ama yine deanlamlı (kontrol: 23,0-28,9% median: 26.7% vs 2 mcM U73122: 17,8-21,5% median: 20.0% Şekil 3C). Etkin süre parametre analizi U73122 varlığında, hareketsiz hücreler hafif bir artış miktarı belirlendi (% 36 vs 2 uM U73122: kontrol% 48; Şekil 3E). 30,4-35,2%, ortalama 33.7 ve% 100 ng / ml EGF '+ 2 uM U73122: 19,3-24,1% 22.6 ortalama Benzer şekilde, U73122 tedavi / ml EGF ng, MDA-HER2, göğüs kanseri hücrelerinin neden olduğu göçün EGF (100 bloke % Şekil 3C). Uygun olarak, sadece bu U73122 önleyici etkisi çok hareketsiz hücrelerde artmış miktarda atfedilmiştir, MDA-HER2 işlenen hücrelerde değil, değiştirilmiş bir zaman aktif bir yapısı (Şekil 3C). Gerçekte, aktif hareketi artan bir zaman doğru hafif bir kayma, MDA-HER2 hücreleri EGF ve U73122 (Şekil 3C) ile muamele edilmeden göç bulgulanabilmiştir.

Buna, 2 mcM U73122 ile MDA-NEO hücrelerin tedavisi belirgin% 10.7 (ortanca:% 9.3; Şekil 3F) için 5.6 lokomotor aktivitesini azalmış bir sonuçlandı öncelikle sigara hareketli hücreler (kontrol miktarının artmasına bağlandı: 47% vs 2 mcM U73122:% 79; Şekil 3F). / Ml EGF ng hareketsiz hücrelerde artmış miktarda (100 atfedildi: Benzer şekilde, MDA-NEO göğüs kanseri hücrelerinin neden olduğu migrasyon EGF belirgin% 7.4 (% 4.8 ortalama) 1,1 ila için U73122 tarafından engellendi 34 ve% 100 ng / ml EGF '+ uM U73122 2:% 70) ve aynı zamanda azalan bir zaman aktif bir yapısı (Şekil 3F) için.

Şekil 1
Hücre göçü odalarının hazırlanması 1. şematik bir bakış Şekil. (AE), bir Hücre göçü, bir erimiş paraffi bölme arasında 2-3 çizim katmanları ile hazırlanırn mum / petrol jeli, bir cam slayt üzerine karıştırın. (F, G), bir lamel ilave edilmiş ve eritilmiş parafin balmumu / vazelin karışımı ile izole edilir. (Y) geçiş bölmesi kolajen hücresi ilave edilmiş, dik bir konumda yerleştirilir süspansiyonu. Daha sonra, geçiş bölmesi kollajen hücreli bir süspansiyon polimerleşmeye bırakılması bir kuluçka makinesine yerleştirilir. (I, J) geçiş bölmesi ortamı ile doldurulur ve dördüncü yan erimiş parafın balmumu / vazelin karışımı ile kapatılır. Bundan sonra, göç odaları mikroskop altında yerleştirilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2
Hücre göçü veri analizi 2. şematik bir bakış Şekil. (A) Hücre izleme veri dosyası. Th60 kez puanları incelendiğinde bu sayede 30 hücre e göç faaliyetleri deney başına belirlenir. Bir "," bir "sayısal bir değer" hücre hareketi işaret eder Hücre, iki nokta arasında hareket etmediği gösterir. (B), bu diyagram, (A) içinde sunulmakta olan verilerin bir şematik görünüşüdür. Her elmas bir iki zaman aralığında hareket ettiğini gösterir; daha uzun bir çizgi hareketi gösterir. Gri çizgiler hücre popülasyonu hücreleri olmayan hareketli ve hücreleri (ki, ancak, duraklamalar yapmak) hareket oluştuğunu görselleştirmek için alındı. (C) Zaman aktif hareketi (zaman aktif) bir hücre vardır toplam süre yüzdesini temsil gözlem döneminin toplam süresi ile ilgili olarak göç etmiştir. 20 ve% 15 saatlik bir toplam süre aktif bir kez bu hücre, 3 saat boyunca, toplam hareket ettiğini gösterir. Bu parametre, ayrıca% 0 aktif bir zamana denk olmayan hareket eden hücre sayısını belirlemek için kullanılır. (D) (E) Alternatif olarak, analiz hücrelerin lokomotor etkinliği bir Boxplot diyagram olarak görüntülenebilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
MDA-HER2 ve MDA-NEO göğüs kanseri hücrelerinin Şekil 3. Örnek hücre göçü verileri. Hücreler, 2 uM U73122 veya bir eş ile 100 ng / ml EGF ile muamele edildi Her iki mbination. (A, B), MDA-HER2 (A) ve MDA-NEO (B), zaman bağlı olarak hücrelerin lokomotor aktivitesi idi. (C, D) için 2 saat temsil eden ortalama lokomotor aktivite Boxplot diyagramı, 13 saatlik zaman aralığı, MDA-HER2 (C) ve MDA-NEO (D) hücreleri ((A, B) olarak bir bar bakınız). İstatistiksel anlamlılık Mann-Whitney U-testi kullanılarak hesaplandı. *** = P <0.001. (E, F), MDA-HER2 (E) ve MDA-NEO (F) hücrelerin aktif olarak zaman histogram planı. % 0 aktif bir zaman hücreler gözlem döneminde hareket olmadığını göstermektedir. Müştereken,% 20 aktif bir zaman 15 saat bir gözlem dönemi dikkate alındığında, bu hücreler 3 saat kadar için taşındık, gösterir. Gösterilen en az üç bağımsız deneyin ortalamasıdır."boş> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Göç yeteneği tümör hücrelerinin 4 bir özelliğidir. Primer tümörün ayırmak ve neredeyse tüm kanser hastalarının ölüm ana nedeni olan ikincil lezyonlar, tohum mümkün olmayacaktır çevreleyen bağ dokusu tümör hücrelerine yoluyla göç yeteneği olmadan. Çünkü bu ilişkinin pek çok çalışma kanser hücresi göçü üzerinde duruluyor. Bu çalışmaların amacı, verimli bir şekilde ve böylece zarar veya metastaz oluşumu yavaşlatan, tümör hücresi göçünü bloke yeni hedef moleküllerin ve hedef yolların tanımlanmasıdır. Üç negatif meme hastalarda geliştirilmiş bir relaps yaşamda kalma ile birlikte, in vivo, in vitro ve 36 meme kanser hücrelerinin yayılmasını inhibe ettiği gösterilmiştir metastatik olan ve β-blokerler, olabilir, böyle bir çabanın bir örneği Kanser hücreleri 37. Yakın zamanda göstermiştir ki SPONTAN türetilmiş hibrid hücrelerin, bir insan meme epitelyal hücre soyu, bir insan göğüs kanser hücre hattı, fakat ana hücreler arasında lı füzyon Olayları, artmış bir göç aktivitesi 26, kemokin CCL21 yanıt verdi. CCL21 tümör (hibrid) hücreleri metastatik özelliklerini 39,40 elde nasıl bir süreç olduğu hücre füzyonu düşündüren, meme 38 de dahil olmak üzere çeşitli kanser türleri, lenf nodu metastazı oluşumu ile ilişkili olmuştur.

3D kollajen matris göç deneyi Boyden odası / Transwell tahlili ve iyileşmesi deneyini çizik tahlil / yaraya kıyasla birçok faydası vardır. Öncelikle, hücreler 3D fizyolojik bir ortamda gömülü. Yukarıda belirtildiği gibi, hücrelerin göç davranışları, iki boyutlu ve 3 boyutlu bir ortamda 3,14,15 arasında belirgin bir farklılık gösterir. Böylece, 3 boyutlu bir kolajen kafes içinde gömülü hücrelerin göç davranışları Locom göre, in vivo durumu için daha fazla benzer olduğu sonucu çıkarılabilirİki boyutlu yüzey tarama hücre otory aktivitesi. Ikinci olarak, zaman atlamalı video kaydına çeşitli hücre göçü parametrelerinin belirlenmesini sağlayan bir belirli bir zaman aralığı, içinde birkaç hücre göçünü analiz etmek mümkündür. Buna karşılık, Boyden haznesi / Transwell tahlilinde yalnızca bu hücreler alt bölmeye göç etmiş analiz için kabul edilir. Membran üstüne, örneğin göç olan bu hücreler aktif göçmen olsa bile veri analizine dahil edilmemiştir.

3D kollajen matris, mikroakışkan cihazlar ile kombine edilebilir, aynı zamanda, fibroblastlar, kanser hücreleri, endotel hücreleri, çeşitli hücre türleri, morfolojisi ve değiştirmesine etki gösterilmiştir bağırsak sıvısı, taklit mi hücre dışı matrisi taklit ilaveten ve mezenkimal kök hücreler 41. Haessler ve ark. Veri akışı interstisyel yüzdesini arttırdığını ortayaHücrelerin 42 yaklaşık% 20 Göçmen hızını arttırır hem de göç hale hücre. Hücreler, örneğin, lökosit / lenfosit veya tümör hücreleri kemotaktik davranışını incelemek için ek olarak, 3D mikroakışkan ayar tümör hücre içeri geçiş ve endotel bariyer fonksiyonunu 43 incelemek için uygun bir araçtır.

3D kollajen matris, göç deneyi her ikisi de bir arada sahip bir uyarıcı ya da bir inhibitörüne veya ye tepki olarak hücreler göçünü analiz etmek için uygun bir araç, bu deney açtığı ifade edilmelidir rağmen bazı sınırlamalar vardır. Sözgelimi, kolajen tip I, ancak, aynı zamanda fibronektin ve laminin gibi olan ve proteoglikanlar olmayan proteoglikan (örneğin hiyalüronik asit), kolajen lifleri dahil olmak üzere çeşitli bileşenleri bir karışımıdır hücre dışı matrisi için kullanılan taklit bileşim, ayrıca farklı organlarda farklı bağ dokular arasında belirgin farklılık 45 eş zamanlı bir diferansiyel sonuçla ise farklı sinyal iletim kademeli dizilerin aktifleştirilmesinde neden olabilir farklı hücre-dışı matris bileşenlerini, kabul çeşitli integrin molekülleri gösterir. Β2-stimülasyon 46 ise gelmediğini Örneğin, β1-integrin stimülasyon monositlerindeki ERK aktivasyonuna neden. Benzer şekilde NF-KB aktivasyonunu 46 aracılı, PI3K β1-integrin- için gereklidir ancak β2-integrin- değildir. Diğer taraftan, kolajen tip I hücrelerinin göç esas olarak bu tipi kolajen tarafından tetiklenen düşündüren insan vücudunda 47 en bol bulunan kollajen.

Hücreler göç etkinliği çözmekte bir diğer kritik nokta hücre izleme işlemdir. Geçerli ve objektif veriler elde etmek için bu tek hücre yolu doğru analiz olması zorunludur. Hücre izleme hücre izleme deneyimi için talep elle, manuel yapılırobjektif veri almak. Ayrıca verileri geliştirmek için ve biz göç etmiş hücreleri, az daha 25 um veri analizi çıkarıldı anlamına 25 um bir cut-off düzeyi, kullandığınız yanlış pozitif hücrelerin kritik bir dizi önlemek için. Aynı şekilde, hücreler rastgele onlar önyargılı veri önlemek için aktif göçmen olup olmadığını bilmeden izlemek için seçilir.

Bazıları bir 3D hücre ve parçacık izleme 18 ayar analiz müsait olmaktadır Geçtiğimiz yıl içinde birkaç otomatik hücre izleme yazılım uygulamaları geliştirilmiştir. Bu tür uygulamaların avantajı Göç eden hücreler gerçekten objektif bir şekilde analiz edilir olmasıdır. Elle yapılmış hücre izleme verisi ile otomatik hücre izleme verilerini karşılaştırmak ilginç olacağını yüzünden.

Yukarıda zikredildiği gibi, altın standart 3B kapsamında, fizyolojik hücre göçünü analiz intravital görüntüleme kombine wi kullanımıdırth 2-foton lazer tarama konfokal mikroskopi. Bu tahlilin avantajı, göç edici hücrelerin fizyolojik belirli bir çözünebilir faktörleri, hormonlar, vb, hücre dışı matris bileşenleri kapsayan çevreye hem de hücre-hücre etkileşim içinde gömülü olmasıdır. Bu lenfositler bağışıklık hücreleri birbirleri 48 veya iletişim nasıl bir lenf düğümünde 17, içinde ticareti nasıl gösteren filmleri görmek için dikkat çekici olan ilaçların bir tek hücre düzeyinde 12,49 in vivo nasıl dağıtılacağını.

Bununla birlikte, intravital görüntüleme bakımından iyi bir mikroskop ve uygun hayvan modellerinin ihtiyacına 2-fotonlu lazer-konfokal tarama mikroskobu ile oldukça pahalı bir maliyet tekniği birleştirilmemektedir. Benzer şekilde, özel bir hücre ya da hücre göçü ile ilgili sinyal transdüksiyon geçiş kademeli dizilerin analizi tek bir çözünür faktör / inhibitörlerinin etkisini incelemek için çok uygun değildir. Bu amaçlar hücre mil içinbütünleştirme deneyler, tanımlanmış deneysel koşullarda, daha da modifiye edilebilir farklı hücre tipleri, örneğin, aşın veya hedef molekülleri yok etme analizini sağlayan tavsiye edilir. Çünkü 3 boyutlu bir ortamda ve hücrelerin lokomotor davranışı arasındaki kilit ilişkisi biz 3D kollajen matris, göç deneyi ve böylece in vivo olarak bir duruma daha yakındır, bir in vitro ortamda hücrelerin göç çalışması için çok yönlü bir yöntem olduğu sonucuna varılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

Biyomühendislik Sayı 92 hücre göçü 3D kollajen matriks hücre izleme
Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter