Abstract
アナスタシス（「生活に上昇する」ためのギリシャ語）は、死細胞の回復を指します。これらの細胞が回復する前に、それらはミトコンドリアの断片化、細胞質ゾルへのミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼの活性化、クロマチン凝縮、DNA損傷、核の断片化、原形質膜小疱形成、細胞収縮、細胞表面の曝露を含む、アポトーシスの重要なチェックポイントを通過したホスファチジルセリン、およびアポトーシス体の形成。アポトーシス刺激、それによって瀕死細胞がアポトーシスと潜在的に他の死のメカニズムを逆にすることができ、死の前に削除されたときアナスタシスが発生する可能性があります。したがって、アナスタシスも不適切に損傷した細胞を維持することができ、生理的治癒過程を含むようである。アナスタシスの機能とメカニズムは明らかに健康な細胞を回収した後、過去のイベントを検出するための限られたツールによって部分的に妨げられて、まだ不明である。 anastaを検出するための戦略SISはアナスタシスを変調するために生理学的メカニズムの研究、疾患の病状でアンデッドの細胞の危険性、および潜在的な治療が可能になります。ここでは、生細胞顕微鏡および哺乳動物細胞でアナスタシスを特定し、追跡するための哺乳類のカスパーゼバイオセンサーを使用して効果的な戦略について説明します。
Introduction
アポトーシス（「死に立ち"のギリシャ語）は、一般的に細胞自殺1-7で終わる一方向のプロセスであると仮定される。すでにアポトーシス経路8,9を開始した細胞を含むそれ以外の動物全体で死んでしまう余分な細胞の生存率のプロ死遺伝子結果の遺伝子破壊。同様に、遺伝子操作は、人工的に表示される信号を「私を食べる」、またはそれは、それらの細胞外マトリックスへの接着性を失い、健康、哺乳動物細胞は、細胞全体の食作用またはentosis、それぞれ10,11による死を免れることができます。しかし、その他の遺伝子操作することなく、正常な健康な哺乳動物細胞および細胞株は、アポトーシス12-15の初期段階から回復することができることを示している。細胞はその典型的な重要なチェックポイントに合格した後に個々の細胞を追跡するためのツールを使用して、我々はさらに、アポトーシス12,13の後期段階からの回復を実証しているLY 2-6「ノーリターンのポイント」をマークします。後期アポトーシスのこれらのチェックポイントは、ミトコンドリアのシトクロムc の放出、カスパーゼの活性化、核の断片化、およびアポトーシス体の形成が含まれる。我々は、細胞死2-6の瀬戸際でアポトーシスのこの逆転を記述するために、「生活に上昇」を意味し、ギリシャ語の複合語「アナスタシス」を採用した。
全体瀕死回復プロセスは、ライブセルイメージングによって観察されていない限り、それはアポトーシス事象を経験したことのない細胞からアナスタシスを受けた細胞を区別するために挑戦している。仕事の数十年は、アポトーシスによる細胞自殺の形態学的特徴は進化的に保存され、生化学的および分子事象16〜19によって駆動されることを明らかにした。これらのイベントは、損傷またはdを排除することにより、単細胞と多細胞生物の発達とhomoeostaticプロセスを調節するために細胞の自己破壊を促進するangerous細胞16-19。アポトーシス細胞は、容易に標準化された形態学的に、アポトーシス1,5,6,16,20の生化学的および分子症状によって区別することができるが、現在アナスタシス12,13に固有の既知のマーカーは存在しない。重要なことは、アナスタシスを受けた細胞は、正常な健康な細胞、およびだけアポトーシスを逆転開始細胞として表示され、アポトーシス死細胞12,13のように見える。このように、新しいツールが与えられた生存細胞は、以前にアクティブなアポトーシス過程を経験したことを確実に締結することが必要である。
それが迅速かつ大規模な破壊プロセスであるため、アポトーシスは、一般的に不可逆的なカスケードとして想定されます。ミトコンドリアは、細胞質ゾル21,22へのシトクロム cなどのアポトーシス誘発要因をリリースした後、いくつかの細胞は、アポトーシスを開始することが日に数分かかることがありますが、カスパーゼは、5分23,24内で活性化細胞質が続くことができるとその後すぐに10分25〜27、及び細胞死内の核凝縮25-27。活性化カスパーゼはそのようなエンドヌクレアーゼ阻害剤DFF45 / ICAD 29,30などの細胞解体2,28、の目的のために重要な構造と機能部品を切断し、不活性化することによりアポトーシスを調整する。カスパーゼはまた、 シトクロム c 31,32のミトコンドリアの放出を促進するために、ミトコンドリアに移行し、BCL-2ファミリーメンバーBID、などのプロアポトーシス因子を活性化する。カスパーゼ活性はまた、貪食33を介してマクロファージまたは隣接セルによる死細胞の貪食を促進するための「私を食べる」信号としてホスファチジルセリンの細胞表面露出をもたらす。さらに、アポトーシス事象は、細胞の生体エネルギーと代謝34,35,36を破壊し 、ミトコンドリアが機能不全にレンダリング。したがって、このような破壊からの回復は、直感的には考えにくい。
オリジナルとは逆に期待管理ポイント、細胞がさえ後期アポトーシス細胞死の過程を逆にすることができます。連続的に培養物中の死細胞の運命をモニターすることにより、我々は、初代細胞および細胞株12,13の範囲内の後期アポトーシスの可逆性を観察した。死刺激の除去は、このようなミトコンドリアの断片化、クロマチン凝縮、DNA損傷、原形質膜小疱形成、ホスファチジルセリンの細胞表面露出、ミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼ活性化、核の断片化、細胞収縮のようなアポトーシスの明白な特徴からの回復を可能にしたとアポトーシス体の形成。これらの観察は、アナスタシスの機能、結果、およびメカニズムに関する未回答の質問を上げる。これらの質問に対処するために、前提条件は、確実にアナスタシスを受けた細胞を同定することである。ここでは、以前に後期アポトーシスおよび第反転した細胞を検出するためのライブ顕微鏡法およびカスパーゼバイオセンサーを記載ENが生き残った。
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Protocol
生細胞イメージングのための細胞の調製
- 形態学的変化の検出を容易にするために、このような優れた原形質膜および細胞内小器官の変化を視覚化するために、基板上に平坦であるHeLa細胞（ヒト子宮頸癌）細胞などの接着細胞を選択する。
アポトーシスの逆転は、初代マウス肝細胞、初代マウスマクロファージ、初代ラット心筋細胞を含む様々な哺乳動物細胞12,13において観察され、また、ヒト胚腎臓HEK-293T細胞のようなラインをセルされた、アフリカミドリザル腎上皮COS：注意-7細胞は、マウス心筋HL-1細胞、マウスNIH 3T3線維芽細胞、フェレット（Mustelaのはフロputoris）脳CRL1656細胞、ヒト皮膚癌A375細胞、ヒト精巣癌CRL1973細胞、ヒト小細胞肺癌H446細胞、ヒト肝癌HepG2細胞、ヒト乳癌MCF7細胞、ヒト前立腺癌PC3細胞、及びヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞。 - 洗浄及び殺菌のための無水エタノールでガラス底細胞培養皿の前洗浄ガラスカバースリップ。
注1：ガラスボトムディッシュの使用は、高品質の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡検査、および高倍率共焦点またはエピ蛍光顕微鏡（議論を参照）をお勧めします。
注2：高倍率の場合（40X、60 / 63Xまたは100Xの目的と高開口数1.3または1.4）、シンナーガラスボトム（厚さ0.085〜0.16ミリメートル）と細胞培養皿の使用は、イメージングのための長い作動距離を提供しています（プロトコル3を参照してください）。 - 細胞型に応じて、ガラス底培養皿は、ポリ-d-リシン（0.1 mg / ml）で、コラーゲン（0.01 M酢酸中の0.01％溶液）、および/またはフィブロネクチン（5μg/ ml）を播種の前に有するコーティングを必要とすることが細胞。
注：コーティング剤の種類及び濃度の最適化は、異なる細胞株に必要とされる。 HeLa細胞は、コーティングなしのガラスに直接接着することができる。しかし、いくつかの細胞のsuマウス心筋HL-1細胞のようなCH、ガラス表面に直接接着するが、具体的な文化やコーティングのプロトコル37を必要とすることはできません。 - 種子は、〜35ミリメートルプレコーティングされたガラス底細胞培養皿上で2-3×10 5細胞を80％の集密度を達成するための日、5％CO 2（℃）37摂氏温度でインキュベートする。
注1：細胞密度、培養時間、および培養条件の最適条件は、細胞型に依存して変化し得る。細胞集密度は、細胞のアポトーシス応答を（プロトコル2を参照してください）影響を与えることができます。高集密度で、細胞をアポトーシス刺激の同じ濃度にあまり敏感である可能性があります。
注2：高細胞密度は、個々の細胞とその細胞小器官の形態変化を不明瞭にすることができますように、コンフルエント細胞を上にしないでください。
2.アプリケーションおよびアポトーシス細胞刺激の除去
- 使用直前に、37℃の細胞培養培地でのアポトーシス誘導剤をプレミックス。エタノール（3.6から4.5％の体積/体積）は、本デモではアポトーシス誘導を務めた。
注1：当社の公表と未発表データは、細胞はまた、ジメチルスルホキシド（DMSO、24時間8％容量/容量）、のためのスタウロスポリン（STS、0.5μMとして、他のアポトーシス刺激12,13によってトリガーされるアポトーシスを逆にすることができますことを実証1時間）、およびタキソール（12時間1μM）。アポトーシスを誘発するための投与量の最適化は、アポトーシスを受けるように集団中の細胞の大部分をトリガすることができる最小の投与量を達成するために、細胞の異なる種類のために必要とされる。
注2：細胞培養培地とプレミキシングアポトーシス誘導剤、アポトーシス刺激に対する細胞の不均一な曝露を避けることが重要である。 - 画像ベースライン形態を確立するためのアポトーシス誘導剤を適用する前に、細胞培養皿で健康細胞群。
- 細胞培養皿から元の培地を除去し、その後に皿に予混合アポトーシス誘導剤の2ミリリットルを適用アポトーシスを受けるように細胞を誘発する。 5％CO 2（または他の通常の培養条件）で、37℃で細胞をインキュベートする。
- インキュベーション後、アポトーシスの特徴の進行をモニターするために、光、エピ蛍光または共焦点顕微鏡により細胞を観察する。
注1：アポトーシスを受けている細胞は、顕微鏡および蛍光ベースのバイオセンサによって検出することができ、アポトーシスの形態的、生化学的および分子的特徴を表示する（参照プロトコル3および4）。
注2：異なるアポトーシス誘導物質と細胞のインキュベーション時間は、細胞型（例えば、密集度および栄養状態など）、細胞条件、及び適用死刺激の投与量に依存して変化する。慎重な滴定が必要な場合があります。 - 細胞がアポトーシスの特徴を表示すると、温かい（37℃、または他の通常の培養温度）新鮮な細胞培養培地で細胞を1回洗浄することにより、アポトーシス誘導剤を除去する。
注1：アポトーシス細胞はもっと緩く上で接続されているとおり培養プレートは、それが適用されると、細胞が洗い流されないように静かに培地を除去することが重要である。
注2：ライブ懸濁した細胞を穏やかに遠心分離（160×gで1分間）によって上清から回収し、バック培養皿に添加することができる。 - 2ミリリットル/ 5％CO 2中で新鮮な細胞培養培地の35mm皿で37℃で細胞をインキュベートする。あるいは、使用条件培地（健康な細胞から採取した細胞を含まない培養培地）は、さらに、アポトーシス細胞の生存を増強する。
注：洗浄し、新鮮な培地でインキュベートした細胞は、細胞の大部分はエタノール曝露後12,13エタノール誘発性アポトーシスを逆転することを可能にする。しかし、細胞は他のアポトーシス刺激にさらされているときに、この洗浄工程が必要な場合があり、繰り返し（説明を参照してください）。
3.生細胞顕微鏡
- 私たちは、37℃（環境制御反転し、共焦点またはエピ蛍光顕微鏡を使用することをお勧め生細胞の顕微鏡検査のため、5％CO 2）。
注：これは、細胞が水浸漬対物直立顕微鏡を用いて画像にすることも可能である。画像セルに培養培地中に直接目的を浸し。しかし、細胞は、フォーカシング時浸漬対物レンズによって破砕することができる。 - 予め温めて（例えば、環境制御室、ステージインキュベーター、対物ヒーターなど）顕微鏡イメージングの前に少なくとも2時間である。
注：これは、フォーカスとxy平面のシフトのドリフトを避けることができるように、顕微鏡の部品により構成部品の熱膨張及び収縮、熱平衡に達することを可能にする。 - 培養細胞を35mmガラスボトムディッシュを置き、倒立顕微鏡のステージ上に（プロトコル1を参照）からの細胞をイメージングするための開口数（NA）1.3または1.4で40Xまたは63Xプラン - アポクロマート対物レンズを用いて細胞画像を取り込むカバーガラスを通して皿の底。
注意：メディアの2以上の溶液を適用することは避けてください媒体の重量が同じ焦点面に画像が困難細胞のフィールドを作り、ガラス底部の曲率を引き起こす可能性としての35mmガラスボトムディッシュに。 - 全体の画像化プロセスの間に、37℃または対応する常温で細胞を維持する。
注：アポトーシスのプロセス、およびアポトーシスの可能性が高い逆転は、温度に敏感な酵素活性に依存します。したがって、（顕微鏡ステージトップインキュベーターで例えば ）37℃で細胞を維持することが実験を通して重要である。減少温度はアポトーシス刺激を除去した後にアポトーシス応答と回復のレスポンスが遅くなる可能性があります。 - 湿度·デバイスを使用するか、メディアからの蒸発による水の損失を減らすために培養皿上（材料を参照）は、透明ホイルを敷く。
注：ホイルは、DIC顕微鏡用の光の極性を破壊する可能性があります。光路の偏光板を調整することにより、極性を復元します。 - でpHを維持顕微鏡上の環境制御室で5％CO 2でインキュベートすることにより細胞培養培地（pHは6.8 -7.3）。
注：メンテナンス培地のpHはまた、（材料を参照）HEPES緩衝液を添加することにより、または商業CO 2非依存培地を使用することによって達成することができる。最適条件は、細胞型に依存して変化し得る。 - 細胞/細胞内構造または発現バイオセンサ（プロトコル4で詳細）の高品質画像を得るために必要な最低の蛍光強度を減少させることによって光毒性を避けるために、画像形成プロセスの間に細胞の蛍光/レーザー（励起光強度）の曝露を最小限。
中およびアポトーシスのイベントの後の検出と追跡アナスタシス4.戦略
- 原形質膜小疱形成、細胞質の凝縮、細胞収縮及びアポトーシス小体の形成（ 図1Aを参照してください- C、E）。
- タイムラプス生細胞diffeを実行しますrential干渉コントラスト（DIC）または位相差顕微鏡健康セルのグループを追跡し、（生細胞顕微鏡検査のためのプロトコル3を参照してください、との説明を参照）、その細胞形態を観察する。
注1：セルに光毒性を避けるために、DIC /位相契約イメージングのための光源の強度を減らします。
注2：DIC及び位相差顕微鏡を使用できない場合は、共焦点または落射蛍光顕微鏡法のための生細胞の形態を概説すると、細胞形態をモニタするために、細胞質ゾルの染色にCellTrackerを使用する。 - （アプリケーションおよびアポトーシス刺激の除去のためのプロトコル2を参照）アポトーシスを受けるように細胞を誘発する細胞死刺激を適用する。
- そのような細胞膜小疱形成、細胞質の凝縮、細胞収縮およびアポトーシス体形成（ 図1A、1B、1C、1E）として、アポトーシスの形態学的特徴のために処理した細胞を観察します。
- 新鮮な培地を細胞と死の刺激、および再供給細胞を洗い流すdisplaアポトーシスのyの形態学的特徴。
注1：細胞死刺激を適用または灌流細胞培養チャンバーを使用することによって達成することができるタイムラプス生細胞イメージングの間、顕微鏡ステージ上の細胞培養培地を変え、または慎重に触れずにピペッティングして細胞培養皿上で直接実行することができる撮像間隔中皿。
注2：使用フォーカスドリフト補償システム（議論を参照）細胞培養培地を変更した後顕微鏡システムの熱平衡の損失による細胞の焦点が合っていないようにする。 - 連続タイムラプスイメージングは、アポトーシスの特徴を示す細胞の運命を追跡する。アポトーシスを逆細胞が損傷を修復し、正常なフラット形態（ 図1A、1B、1C、1E）を取り戻すことができる。
- タイムラプス生細胞diffeを実行しますrential干渉コントラスト（DIC）または位相差顕微鏡健康セルのグループを追跡し、（生細胞顕微鏡検査のためのプロトコル3を参照してください、との説明を参照）、その細胞形態を観察する。
- ミトコンドリアの断片化、DNA /クロマチン凝縮、核断片化（ 図1D、1F、1Gを参照してください）。
- mitochondを可視化リアス、50nMののMitoTracker赤/深赤色/緑色蛍光色素で染色細胞と同時に、5％CO 2、37℃で20分間、培養培地中のヘキスト33342青色核染料を10μg/ mlの核を染色する。
注1：細胞毒性を回避したときに必要性バックグラウンド蛍光を減少させるために染料およびインキュベーションの期間の濃度を低下させる。染色のための染料およびインキュベーション時間の最小量のノイズ比に対する良好な信号を得るために染色条件を最適化する。
注2：そのようなアポトーシスの間にミトコンドリアから漏れないのMitoTrackerレッドCMXRos、のMitoTrackerディープレッドFM、またはのMitoTrackerグリーンFM、ミトコンドリア用の蛍光汚れを使用してください。これは、アポトーシスとアナスタシス時のミトコンドリアの形態を可視化することができます。これらの汚れの詳細については、資機材の表を参照してください。 - 光退色を避けるために、暗闇の中で染色された細胞を保管してください。
- 細胞を洗浄することにより余分な汚れを削除する3、各洗浄の間に、新鮮な培地中で1分間インキュベートし、37℃のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液または新鮮な細胞培養培地と時間後、さらに過剰な許可する最終洗浄前に20分間、新鮮な培地中で培養する汚れは、イメージングのために、非特異的バックグラウンドシグナルを低減するために、細胞を終了します。
注：イメージングのための高いバックグラウンドを生じ得る染色した後、細胞培地でインキュベーション時間を短くしてください。 - アポトーシス誘導が適用される前に画像の健康な細胞へのリアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡を実行する（生細胞の顕微鏡検査のためのプロトコル3を参照）。
注：健康な細胞は、ほとんどの細胞型（ 図1D、1F、1G）に管状ミトコンドリアと丸い核を表示する。 - アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）。
- タイムラプス生細胞のミトコンドリアの変化を観察する顕微鏡や原子力morphologを継続死刺激が細胞に適用された直後にIES。管状のミトコンドリアと丸い核を表示する健康な細胞とは対照的に、そのようなミトコンドリアの断片化と腫れ、クロマチン凝縮、核断片化などのアポトーシスの特徴を表示するために、細胞を観察します。
- 細胞がアポトーシスの特徴を表示すると、新鮮な培地で洗浄し、供給細胞、および細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続ける。アポトーシスを逆に細胞は、正常なミトコンドリアと核形態（ 図1D、1F、1G）を取り戻す。
注：細胞（DIC顕微鏡法のためのプロトコル4.1を参照）の同じグループに細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための付加的な情報を得ることが可能な場合に並列にDIC顕微鏡法を実行する。
- mitochondを可視化リアス、50nMののMitoTracker赤/深赤色/緑色蛍光色素で染色細胞と同時に、5％CO 2、37℃で20分間、培養培地中のヘキスト33342青色核染料を10μg/ mlの核を染色する。
- 安定してシトクロム c -GFP融合広報を発現する細胞を使用してシトクロムcのミトコンドリア放出を検出するotein（ 図2を参照）。
- ステイン細胞が安定的に（生細胞のミトコンドリア染色4.2.3するには、手順4.2.1を参照してください）偏細胞のミトコンドリアを標識しのMitoTrackerレッドで-GFP 23,24シトクロムcを表現する。
- 健康な細胞（生細胞イメージングのためのプロトコル3に詳細を）追跡するために、リアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡検査を行います。
注： シトクロム c -GFP信号は主に健康な細胞（ 図2A のi、2B）のミトコンドリアに局在する。 - アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）。細胞質ゾルへのミトコンドリアからシトクロム c -GFPの転位を観察するタイムラプス顕微鏡検査を続行（ 図2Aii-III、2B）。
注：サイトゾルへのシトクロムc のミトコンドリア放出は、ミトコンドリア外膜透過（MOMP）のマーカーである4、ミトコンドリア依存性アポトーシス21,22における重要なステップ - 細胞は細胞質中のシトクロム c -GFP信号を表示すると、細胞死刺激を削除し、新鮮な培地に供給細胞（プロトコル2を参照してください）。細胞質のGFPを有する細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続行します。
注：アポトーシスを逆に細胞が正常な細胞形態を取り戻し、バックミトコンドリア（ 図2Aiv-VII、2B）の劣化または転座を通じて、おそらく彼らのサイトゾルのシトクロム c -GFP信号を減らす。 - （DIC顕微鏡のプロトコル4.1を参照）は、単一の細胞または細胞群における細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための追加情報を取得するために並列にDIC画像をキャプチャする。
- カスパーゼのバイオセンサーを用いてカスパーゼ活性を検出した（ 図3を参照）。
- のためのカスパーゼバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLSとのトランスフェクト細胞16アポトーシス刺激13にそれらをさらす前に、24時間である。
- （生細胞核染色するための手順を4.2.3に4.2.1を参照してください）細胞核を標識し、ヘキスト33342でトランスフェクションした培養物を染色する。
- 健康な細胞（生細胞イメージングのためのプロトコル3に詳細を）追跡するために、リアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡検査を行います。
注：NES-DEVD-YFP-NLSバイオセンサ信号は、主にその核外移行シグナル（NES）に起因する健康な細胞の細胞質ゾルに局在する（ 図3A、3Biと3C、ディスカッションを参照してください）。 - アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）。 YFPの核移行を観察するタイムラプス顕微鏡検査を続行します。
注：カスパーゼを切断の活性化カスパーゼのバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLSでDEVDモチーフ、（ 図3A、3Bii-IV、ディスカッションを参照）核に細胞質ゾルからYFP-NLS転になる。
- 核YFPを表示する細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続行します。
注：核YFP信号は、おそらくそのようなプロテアソーム分解などの正常な細胞クリアランス機構を通じて（ 図3B、VI-X、セル1、結果と考察を参照してください）細胞がアポトーシスを逆転している数時間後に劣化します。 - 単一細胞または細胞群における細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための追加情報を取得するために並列にDIC画像をキャプチャする。 （DIC顕微鏡検査のためのプロトコル4.1を参照してください）。
- GL上にシード細胞お尻は、（プロトコル1を参照してください）80％の細胞集密度を達成するためにカバースリップ。
- 赤蛍光のMitoTrackerとそれぞれミトコンドリアおよび核、青ヘキスト33342染色で細胞を共染色（生細胞のミトコンドリアと核染色のために4.2.3へのステップ4.2.1を参照してください）。
- アポトーシス誘導剤を使用することによりアポトーシスを受けるトリガー細胞（プロトコル2を参照してください）。
- アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリンの暴露を検出するためのアポトーシス誘導剤の除去の前に、37℃でのアポトーシス細胞を10分間染色する（材料を参照）、蛍光標識したアネキシンVを印加する。
注1：ホスファチジルセリンは、通常、細胞原形質膜38の内側のリーフレットに隔離されているため、健康な細胞はアネキシンVで染色されていない。アポトーシス細胞は、（ 図4Aおよび図4B）、細胞表面上のホスファチジルセリンに結合するアネキシンVで染色されている。
注2：蛍光標識アネキシンVはまた、アポトーシス細胞のimmのを染色するために適用することができるediately 10分間のインキュベーションとアポトーシス誘導剤の除去、後に。 - 細胞死刺激を取り除く回暖かいPBSまたは新鮮な培地で染色された細胞を洗浄し、次いで（プロトコル2を参照）を5％CO 2、37℃で2時間、新鮮な培地を細胞に供給する。
注1：アポトーシスは正常な形態を回復し、正常な形態取り戻した後、蛍光標識されたアネキシンV信号を保持する反転細胞（ 図4A、および4B）。
注2：アネキシンV信号は、回収した細胞に、時間とともに減少（議論を参照）。 - 室温で暗所で20分間、1×PBS中で8％のスクロースを含む4％パラホルムアルデヒドで選択された時点で細胞を固定し、退色防止封入剤でスライドガラスカバースリップ上の細胞をマウントする前にホルムアルデヒドを除去するために3回PBSで固定した細胞を洗浄共焦点またはエピ蛍光顕微鏡用（材料を参照）、アポトーシス誘導剤を除去した後、細胞にアネキシンVを観察します。
注1：固定液中のスクロースは、固定時に細胞膜構造を保持します。
注2：劣化を防止するために、4℃で暗所にパラホルムアルデヒド溶液を保管してください。
注3：細胞にコールドショックを回避するための固定のために細胞に適用する前に室温にパラホルムアルデヒド溶液をウォームアップ。
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Representative Results
アポトーシスの反転を研究するために、組織培養細胞は、最初にアポトーシスを誘発する死刺激にさらされている。細胞がアポトーシスの特徴を表示するとき、新鮮な培養培地は、次いで、刺激を洗い流し、その後回復した （ 図1A）を可能にするために死細胞を培養するために適用される。ここでは、アドレス指定されている重要な問題は、個々の死にかけ培養細胞がアポトーシスに向かって進行し、まだアナスタシスを受けることができるどの程度までである。この問題は、決定的に以下に記載する方法を用いて細胞の運命を追跡するためのバイオマーカーと連続モニタリングによって応答することができる。
まず、トラッキングのために必要とされるタイムラプス生細胞の顕微鏡検査を使用し、中、およびアポトーシス刺激12,13への曝露後、前の個々の細胞の応答を記録することによって、組織培養細胞におけるアポトーシスの反転を検出するための我々の戦略を説明する。それらに接続された基板上に広げ、健康な接着細胞（図1Bi）12,13、および糸状ミトコンドリアと治療前のラウンドの核を示した（ 図1CI、DI、EI、Fiの、GI）12,13。細胞培養培地中の3.8から4.5パーセントのエタノール（体積/体積）に曝露した後、DICまたは位相差顕微鏡は、細胞が細胞質の凝結、原形質膜小疱形成、および細胞収縮（1Biiフィギュア、1Cii-含む、アポトーシスの形態学的特徴を示すことを明らかにしたIII、および1Eii-VI）12,13。同じ細胞によるアポトーシス体の形成を容易にDIC（ 図1Eii-vi）で観察された。のMitoTracker標識ミトコンドリアの断片化は12,13だけでなく、ヘキスト染色した核DNAの凝縮（ 図1Dii-III、FII-III、GII）12,13、および核の断片化（1Dii-III、1Fii-VIフィギュア ） （ イチジクURES 1EviとFVI、白矢印）は、共焦点またはエピ蛍光顕微鏡によって同時に検出された。成功してアポトーシスを逆転細胞はその後、明らかに彼らの損傷（ 図1Biii、C及び本部-VI、E及びFVII-XII、およびGIII）12,13 の補修、正常な形態を取り戻すことが観察された。これらの条件下での細胞はまた、蛍光発光量子ドットの取り込みおよび細胞分裂13に基づいて細胞小器官の運動性、細胞移動、および機能的なエンドサイトーシスを回復することが示された。興味深いことに、尊敬アポトーシスは不規則な核形態（ 図1Fxii）、また、異常な細胞分裂と核の形成を示したいくつかの細胞が13、分裂細胞におけるDNA損傷、染色体切断および染色体全体の損失のバイオマーカーである（1Giv-七フィギュア ） 39、40。避難Chromosomes又は染色体断片、外核膜39,40で囲まれた娘細胞核に含まれることができない。このように、アナスタシスの結果、腫瘍形成および癌の進行につながる、中止されたアポトーシスの間に被害を受けたゲノムの保有する可能性があります。小核の存在は、癌細胞40,41においても一般的である。
ミトコンドリアのシトクロムc の放出を媒介する、またはカスパーゼ依存性アポトーシス20-22を増幅するための重要なステップである。安定的にGFPタグ付きシトクロム c を発現するHeLa細胞を用いて、共焦点顕微鏡によるアポトーシス及びアナスタシス中のシトクロムcの細胞内再配置をモニターした。 、23,24を報告したように、チトクロームC -GFP治療前（ 図2AIおよびB）にミトコンドリアに局在するが、その後死亡刺激が（ 図2Aii適用された後に、サイトゾル中に放出されました2AiiiおよびB）。そのようなミトコンドリアの断片化と細胞膜ブレブ形成などの他の特性形態は、またシトクロム c -GFP（ 図2Aiii）をリリースした細胞で観察された。これらの細胞は、 シトクロム c 23-27のリリース直後に細胞死を起こすことが報告された。しかし、死刺激を除去した後、我々は、サイトゾルのシトクロム c -GFPレベルは、繊維状構造を取り戻したミトコンドリアを減少し、原形質膜の通常の外観（ 図2Aiv-七を回収することが観察さ およびB）。したがって、アポトーシス細胞は、シトクロムc のミトコンドリアのリリース後アナスタシスを受けることができる。
下流DEVD切断カスパーゼの増幅は、一般的にアポトーシス2,5における「ノーリターンのポイント」とする。したがって、我々はカスパーゼバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLS式exprを使用ことが可能以前にカスパーゼ活性（ 図3A）を経験している生存細胞を検出すること、プラスミド13からessed。このカスパーゼのバイオセンサーは、N末端 核排除シグナル（NES）を有するリンカーカスパーゼ-3黄色蛍光タンパク質（YFP）、続い/ 7のコンセンサス切断部位（DEVD）26,42,43、及びを有するポリペプチドであるC末端核局在化シグナル（NLS）。健康な細胞では、このバイオセンサは、主にNESの関数としての細胞質ゾルに局在する13（3Bi、Ciを、静脈内 、 およびDの図 ）。アポトーシスの間、活性化したカスパーゼは効率的に同時に、またはその後に、そのようなDNA /クロマチン凝縮および細胞収縮（ 図3B IIなどのアポトーシスの他の機能を表示する細胞では核への細胞質ゾルから移行しYFP-NLSを放出、DEVDモチーフを切断-iv、およびD）13。このように、それ細胞は、カスパーゼ活性化後の核インポート機能を保持する。アポトーシス誘導剤を除去した後、カスパーゼの活性化は、（ 図3BV-xの発生した後もアナスタシス表示形態学的回復を受けた細胞、 およびD）13は 、明らかに後期アポトーシスを逆転。彼らは死の刺激（ 図3BV-X、セル1）13を除去した後にアポトーシスを逆に起動したときに正常な形態の回復時には、核YFPシグナルは、細胞が、おそらくにより、カスパーゼ切断バイオセンサーを劣化させることを示唆している、いくつかの細胞内の強度の減少アナスタシス中および後に、他のカスパーゼ切断生成物を除去するために使用されるのと同じメカニズム。
アナスタシスはまた、生細胞の顕微鏡検査することなく検出することができる。これは、（アポトーシスの早期の段階で、ホスファチジルセリン（PS）に結合し、マークが外部化、蛍光標識されたアネキシンV 38,44を用いることによって達成することができる
図1：ライブセルイメージングによるアポトーシスの追跡逆転。 （D - 、およびG。図1Aのために、Tangら、MBOC 23、2240から2252年 13 から許可を得て転載）。 （A）アポトーシスを誘導し、続いて培養された細胞は、アポトーシス誘導剤を洗い流した後に回復することを可能にするアプローチ。健全な初代マウス肝細胞の（B）タイムラプス生細胞の位相差顕微鏡（未処理）、処理した細胞の同じグループ5時間（処置）した後、洗浄し、さらに（洗浄）24時間新鮮な培地とインキュベートするための培地（体積/体積）4.5％エタノール。スケールバーは100μm。（C）ETHA以前と同じ初代マウス肝細胞の連続タイムラプス生細胞エピ蛍光顕微鏡タノールを2.5時間（二及びiii）、及び洗浄後のための細胞培養培地中の4.5％エタノールで処理した後の示した時間での処理は、（i）、および1時間の回復を可能にするために、新鮮な培地でインキュベートすること（四 - 六）。のMitoTrackerミトコンドリア染色（赤色）およびヘキスト核染色（青色）のマージされた画像は、DIC顕微鏡によるエピ蛍光顕微鏡、および細胞形態によって可視化した。スケールバーは、パネルCから10μmである。（D）合併蛍光画像のみ（DICなし）がオルガネラ形態を明らかにする。（E）をエタノール処理の前にヒト小細胞肺癌H446細胞の連続経時生細胞共焦点顕微鏡（i）を、2時間28分（二-vi）のための細胞培養培地中の3.8％エタノールで処理した後、洗浄後に回収（七、十二）を可能にするために、新鮮な培地でインキュベートする。のMitoTracker染色ミトコンドリア（赤色）およびヘキスト染色された核（青）のマージされた画像は、共焦点顕微鏡、およびcによって可視化した DIC顕微鏡によるエル形態。白矢印は、アポトーシス体（VI）で断片化された核を示している。スケールバーは10μm。（F）は、細胞小器官の形態を明らかにし、パネルEからのみ（DICせず）蛍光画像を合併。（G）連続 不正確な細胞分裂を受ける単一のHeLa細胞のモノクロヘキスト染色し、核イメージングのための経時生細胞の落射蛍光顕微鏡。エタノール処理は、（i）の前に、5時間（ii）のために、エタノールを除去（洗浄工程、iii-vi）の後の細胞培養培地中の4.3％エタノールで処理。パネルIVは、異常な細胞分裂を明らかにしている。赤矢印は、分割されたセル（IV-VI）の主要な核を示している。スケールバーは30μm。タイムズは、hrとして示されている：。分この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2： シトクロム c（A）を安定的（i）の前に、 シトクロム c -GFP（CYTO C -GFP）を発現するHeLa細胞の連続経時生細胞の共焦点顕微鏡のミトコンドリアのリリース後に、アポトーシスの反転を検出すること、（ii-iii）の間に細胞培養培地中の3.9％のエタノール（三-vii）の暴露後。 CytoC-GFP（緑色）のMitoTracker染色ミトコンドリア（赤）、ヘキスト染色した核（青）の合併共焦点画像は、DIC画像（左パネル）と組み合わされる。マージされていないバージョンでは、信号強度、ヒートマップ（左中段パネル）、CytoC-GFP（中央パネル）のモノクローム画像、及びミトコンドリアの白黒画像（右中パネル）ように提示され、CytoC-GFPのために別々に示した。 CytoC-GFPおよびミトコンドリアのマージ画像（右パネル）。（B）細胞の細胞質ゾルのシトクロムc-GFPシグナル強度の変化、チェルパネルAIのモノクロCytoC-GFPの画像に示すように、L 1とセル2、。タイムズは、hrとして示されている：。分この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：（図3AのためのTangら、MBOC 23、2240から2252年 13 から許可を得て転載、 - D。）カスパーゼ活性化の後にアポトーシスの反転を検出する。核外移行シグナル（NES）からなるカスパーゼバイオ融合タンパク質、DEVDカスパーゼ切断部位、黄色蛍光タンパク質（YFP）、および核局在化シグナル（NLS）の（A）、図（B）連続タイムラプスライブ中カスパーゼバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLS（i）の前に、発現するHeLa細胞の細胞を共焦点顕微鏡（二 -iv）と細胞培養培地中の4.3％のエタノール（VX）の曝露後。カスパーゼバイオセンサ（緑）の合併共焦点画像を、ヘキスト染色された核（青）およびDIC画像（左パネル）、YFPシグナル（中央パネル）のモノクロ画像、およびYFPシグナル強度を示すヒートマップ（右パネル）の間、およびエタノール曝露後の、および未処理のコントロールパネルBのように分析した。（C）未処理対照（D）個々の細胞における活性化核カスパーゼバイオセンサーについて定量化蛍光強度（パネルバイ1および2の番号が付け）の前に、 （パネルCiの3および4の番号が付け）は、核（核/全細胞YFPシグナル強度×100％）でYFPの存在のパーセントとして計算した。分：タイムズは、時間として示されている。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：蛍光標識アネキシンVによるアポトーシスの反転を検出するには（。 - B図4Aのため、Tangら、MBOC 23、2240から2252年 13 から許可を得て転載）。パネルBに使用されるアネキシンV-FITCのアナスタシスアッセイ（A）、図（B）新生児ラット初代心筋心室筋細胞を5時間、細胞培養培地中の4.5％エタノールに暴露した後、10のために、アネキシンV-FITCとインキュベートした分エタノール媒体の除去の前に。細胞は、どちらかすぐに固定（治療）、または追加の2時間の回復のために新鮮な培地で再給餌した後に固定した（洗浄した）。アネキシンV-FITCを暴露された未処理細胞を対照（未処理）として機能する。のMitoTracker染色ミトコンドリア（赤）、ヘキスト染色された核（青）及びアネキシンV-FITC（緑色）は、共焦点顕微鏡で可視化し、細胞形態は、DIC顕微鏡によって可視化した。 SCエールバー、10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
アナスタシスは、細胞死経路を活性化した細胞がその後死んでプロセスを逆にして生き残る現象を指す。ここでは、ライブセルイメージングが実際に同一の個々の細胞は後期アポトーシス細胞死のプロセスを逆にし、次いで生存及び再生し続けることができることを確認するために使用され得ることを実証した。我々のプロトコルは、アポトーシスを誘導し、細胞の大部分は、検証のために、いくつかのバイオマーカーを用いてモニターアポトーシスの反転を受けることができるように、いくつかの最適化された細胞型特異的な処理条件を記述する。技術的な問題については、ガラスボトムディッシュを理由高倍率で高品質のコンフォーカルまたはエピ、蛍光顕微鏡用のロング作動距離を可能にの細胞と顕微鏡対物間の高透明な薄いガラス、の、イメージング12,13、培養の細胞に用いられた、ミトコンドリア断片化を含む古典アポトーシスの観察を容易に、 シトクロム c、及び核凝縮及び断片化のリリース。ガラスはまた、アポトーシスの間、膜小疱形成、細胞の細胞収縮、アポトーシス小体の形成のモニタリングのための高品質のDIC顕微鏡観察を可能にするために、光の極性を歪曲しない。 DICは、細胞形態の検出を改善し、染色されていない透明な細胞試料のコントラストを高めるようにDIC顕微鏡法は、アポトーシスのこれらの形態学的特徴を観察するために位相差顕微鏡法を超える利点を有している。 DICおよび位相差顕微鏡を使用できない場合は、CellTracker共焦点またはエピ蛍光顕微鏡検査のために生きた細胞の形態を概説すると、細胞形態をモニタするために、サイトゾルを染色するために使用することができる。
死刺激の適切な用量のアプリケーションとの刺激の除去の戦略はアナスタシスの検出のための重要なステップである。我々は、実験のDESCRの死亡刺激としてエタノールの低濃度を使用することを選択した処理した細胞の大パーセントため、ここでアイベッド均一にアポトーシスを受けることができ、このから回復することができ、潜在的に穏やかな、死刺激。それにもかかわらず、これらのアプローチはまた、我々は12,13を報告しているように、他の死刺激に正常に適用することができる。しかし、いくつかの死の刺激は、スタウロスポリン（STS）、一般的に使用されるアポトーシス誘導剤などの他、より本質的により挑戦的である。それは、高い親和性46-48とその基質と結合するせいか、繰り返し洗浄は不可欠ですが、それでも効率的に細胞からSTSを削除しない場合があります。この場合には、依然としてアポトーシス死ぬプロセスを活性化することができる低い薬物濃度および薬物短いインキュベーション時間を使用すると、より多くの細胞がアポトーシスを逆転させるのに役立つかもしれない。再給新鮮な細胞培養培地よりも優れアポトーシスの逆転を高めることができる馴化細胞培養培地で細胞を。アポトーシス細胞は通常緩く特にガラスシュールで培養皿表面に結合している顔が、それ故に、それは静かに細胞を剥離を避けるためにアポトーシス誘導を洗い流すことが重要です。特にへの細胞の曝露後に、細胞培養ディッシュのガラス面上に適切に取り付けるために、そのような心筋細胞37のようなある種の細胞を、可能にするために細胞接着を増大させることができ、ポリ-D-リジン、コラーゲン及び/又はフィブロネクチンでガラス皿をコーティングする死刺激。
アポトーシスのプロセス、およびアポトーシスの可能性が高い反転が、温度によって影響され得る酵素活性に依存する。したがって、37℃で、またはそれらの正常な培養条件で細胞を維持することは、実験結果の再現性を確保するために、ライブイメージングプロセス全体を通して重要である。生細胞イメージングを開始する前に前加温顕微鏡はまた、顕微鏡成分が熱平衡に達することを可能にする重要なステップである。これは、熱膨張及び収縮にフォーカスとxy平面のシフトのドリフトを回避することができるライブセルイメージング中に部品。塗布又は、温度または培地の容量の変化にまだフォーカスのドリフトを引き起こす可能性がタイムラプス撮影中のいずれかピペットまたは予め温め顕微鏡システムにおける灌流培地を培養皿を変更することによって、死刺激を取り除く。 Zスタックの取得が正しい焦点面に画像セルに助けることができますが、原因の蛍光レーザーへの細胞の追加の暴露に光毒性の危険性が増加します。あるいは、このような赤外線レーザに基づく自動焦点補正系としてフォーカスドリフト補償システムを使用することは、追加のない細胞/ガラス及び対物との間の距離を維持することによって、経時生細胞イメージングの間、同じ焦点面で細胞を維持することができ短波長への細胞の曝露、光毒性蛍光。
ミトコンドリアなどのシトクロム cなどのアポトーシス誘発性タンパク質の放出、及びそのような下流/効果などのエフェクターカスパーゼの活性化またはカスパーゼ3およびカスパーゼ7は、一般的にアポトーシス細胞死プロセス2,5,6-において「復帰不能点」であると考えられてきた。ウェスタンブロットは、カスパーゼ3の切断（活性化）およびアポトーシス誘導時の全細胞集団におけるポリ（ADP）リボースポリメラーゼ-1（PARP）及びDFF45 / ICADとしてアポトーシスを除去した後、その基質を検出するために使用されている刺激、及び切断されたカスパーゼ3、ICAD、及びPARP死刺激に対する曝露の間に細胞に現れたことが明らかになったが、新鮮な培地13を有する細胞がされた後に再供給を消失した。しかしながら、これらの方法は、細胞集団における一般的な条件を明らかにしたが、最終的にアポトーシスを逆にして、生き残るものから死ぬ個々の細胞を区別しません。ミトコンドリアのシトクロムc の放出を分析するための生化学的分画は、同様の注意点がある。したがって、 シトクロム c の放出およびカスパーゼ交流後の個々の細胞の運命を追跡するそのような生細胞と組み合わせNES-DEVD-YFP-NLS、ここで使用したものとアポトーシス2,5,6-の最も有名な特徴で、GFPタグシトクロム c（CYTO C -GFP）とカスパーゼバイオセンサー、のtivation、2顕微鏡検査は、直接形態素回復と同じ細胞内CYTO C -GFPバイオセンサーの移動を観察することによってこれらの問題を回避する。これらの結果は、ミトコンドリアのシトクロム c放出およびカスパーゼ活性化の後にアポトーシスの可逆性を示している。
アナスタシスを研究するための現在の課題は、 インビボまたはインビトロで 、それらの寿命を通して任意の時点でアナスタシスを受けた細胞を検出するための標識技術の欠如である。カスパーゼバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLSの安定発現は、カスパーゼが将来再び作動している場合にもカスパーゼ活性の検出を可能にするが、活性化したバイオセンサーはsustaずに分解されるように恒久的にカスパーゼ活性を記録しませんINEDカスパーゼ活性13。そのようなFRETベースのSCATバイオセンサーなどの他の以前に報告されたカスパーゼバイオセンサー、（ 例えば ECFP- [DEVD] -Venus）26,49と同様に蛍光レポーターをApoliner（CD8-RFP- [DQVD] -GFP）50とCPV（ 例えば CD8 - [DEVD] -Venus）51,52は 、全動物および培養細胞におけるカスパーゼ活性を検出するために使用されるが、同様の制限を有することができる。同様に、CYTO C -GFPは、アポトーシスの間にミトコンドリアからサ イトゾルに放出され、続いて分解されるように、長期的にアポトーシスを逆転した細胞を追跡するために使用することができない。アネキシンV標識、アポトーシスを逆転細胞を追跡するために使用されているが、信号強度は、時間とともに低下するので、アナスタシス13,45の長期追跡に有用ではない。 in vivoイメージングの連続長期死刺激の曝露後の同じ細胞の運命を追跡するために使用することができる。しかし、in vivoイメージングにおける長期的にはまだトンに挑戦しているOほとんどの生きた動物で行う。したがって、追加のアプローチは全体の動物研究にアナスタシス研究を拡張し、組織培養細胞を用いアナスタシスを促進または阻害し得る薬剤をスクリーニングするために必要とされる
将来的には、長期の細胞の運命を追跡する新しいプロトコルおよび技術を開発し、アナスタシスの生理病理学的および治療的意味をテストするために必要とされる。私たちは、アナスタシスがそのような成熟した神経細胞および心臓細胞13のように、交換が困難な損傷細胞を救出する一般的な細胞生存メカニズムである可能性があることを提案した。しかし、化学療法の治療後のアポトーシス癌細胞のアナスタシスは、耐性腫瘍12,13の再発につながる危険な細胞の回収につながる可能性があります。彼らはアポトーシス13を逆転させた後に、いくつかの細胞が癌化を表示するようにアナスタシスまた、腫瘍形成の重要なメカニズムである可能性があります。したがって、アナスタシスを強化することは、新しいティラ可能性癌を予防または治療するための新しい方法としてアナスタシスを抑制しつつ、神経変性および心不全を阻害するためpeutic戦略。疾病モデル系におけるアポトーシスの逆転を追跡するためのバイオセンサーを開発するアナスタシスを変調することによって難病に細胞生存アナスタシスのメカニズム、および潜在的な治療薬の理解を進めるであろう。
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Acknowledgments
当社は、単語 "アナスタシス」アポトーシスの逆転を記述するための示唆のために牧師先生ラルフBohlmannと牧師先生ジェームスVoelzに感謝、安定してシトクロム c -GFPを表現するHeLa細胞についてダグラス·R·グリーン; H446細胞用のチャールズM.ルーディンとエリックE.ガードナー。ビデオでの漫画の図面をアシストするためにヘザーラム。この原稿の貴重な議論のためのイーホイヨ。この作品はサー·エドワード·ユード記念フェローシップ（HLT）、博士ウォルターSzeto記念奨学（HLT）、フルブライト助成金007から2009（HLT）、ライフサイエンス研究財団フェローシップ（HLT）によってサポートされていました、NIHはNS037402（JMH）付与とNS083373（JMH）、および香港大学補助金委員会のAoE / B-07/99（MCF）。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローである。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | ||
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
References
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