Abstract
Anastasis（希腊的“上升到生命”）是指垂死细胞的恢复。之前，这些细胞恢复，它们通过细胞凋亡的重要的检查站，包括线粒体碎裂，释放线粒体细胞色素C进入细胞质，活化胱天蛋白酶的，染色质凝集，DNA损伤，核碎裂，细胞膜起泡，细胞收缩，细胞表面暴露已经过去了磷脂酰丝氨酸的，和凋亡小体形成。当凋亡刺激被死前删除，从而使死亡的细胞逆转细胞凋亡和潜在的其他死亡机制Anastasis可能发生。因此，anastasis似乎涉及生理愈合过程也可以维持受损细胞不适当。的功能和anastasis的机制仍不清楚，阻碍在部分由有限的工具为明显健康细胞的恢复之后检测过去的事件。策略来检测anasta矽统将使生理机制的研究，不死细胞疾病的病理的危害和潜在的治疗方法来调节anastasis。在这里，我们将介绍使用活细胞显微镜和哺乳动物蛋白酶生物传感器的识别和跟踪anastasis在哺乳动物细胞中有效的策略。
Introduction
细胞凋亡（希腊的“坠落死亡”）被普遍认为是一个单向的过程，细胞自杀1-7结束。亲死亡的基因产生额外的电池，否则死在整体动物，包括细胞已经开始凋亡通路8,9的生存基因的破坏。同样，基因操作使健康的哺乳动物细胞人为显示“吃我”的信号，或者说失去粘附性的细胞外基质难逃一死的全细胞吞噬或entosis期间，分别为10,11。然而，我们和其他人已经表明，如果没有遗传操作正常健康的哺乳动物细胞和细胞系还可以从细胞凋亡12-15的早期阶段中恢复。使用工具来追踪单个细胞，我们进一步证明凋亡12,13的后期恢复，细胞已通过检查站的重要典型的后LY标记“不归路”2-6。晚期凋亡的这些检查点包括线粒体释放细胞色素c，活化胱天蛋白酶的，核碎裂和凋亡小体形成。我们通过一个希腊复合词“anastasis”，意思是“上升 到生活”，来形容这种逆转细胞凋亡的细胞死亡2-6的边缘。
除非整个垂死恢复过程是由活细胞成像观测，它是具有挑战性的区分也从没有经历过的事件凋亡细胞发生anastasis细胞。几十年来的工作人士透露，细胞自杀凋亡的形态特征是由进化上保守的生化和分子事件16-19驱动。这些事件促使自我毁灭的细胞通过消除受损或D，有利于在单细胞和多细胞生物的发育和homoeostatic流程angerous细胞16-19。而凋亡细胞可以通过细胞凋亡1,5,6,16,20标准化形态学，生物化学和分子表现容易地区别，目前有特定于anastasis 12,13没有已知的标记物。重要的是，经历了anastasis细胞似乎是正常的健康细胞，而细胞刚刚开始扭转凋亡出现凋亡死亡的细胞12,13。因此，新的工具来完成与给定的细胞存活此前曾经历了积极的凋亡过程肯定需要的。
凋亡通常假设为一个不可逆的级联，因为它是一种快速，大规模破坏的过程。而它可能需要几分钟到几天对某些细胞以引发细胞凋亡，一旦线粒体已经发布凋亡因子如细胞色素C进入细胞质21,22，胱天蛋白酶可以在5分钟23,24内被激活，接着细胞质和在10分钟内25-27核缩合，细胞死亡，此后不久25-27。激活胱天蛋白酶裂解和失活对蜂窝拆卸2,28，目的关键的结构和功能部件，如内切酶抑制剂DFF45 / ICAD 29,30编排凋亡。半胱氨酸蛋白酶还能激活促凋亡因子，如BCL-2家族成员BID，其中转运至线粒体，促进细胞色素线粒体释放C. 31,32。蛋白酶活性也导致磷脂酰丝氨酸的细胞表面暴露作为一个“吃我”的信号，促进通过吞噬垂死33细胞巨噬细胞或相邻细胞吞噬。此外，细胞凋亡事件使线粒体功能失调，破坏细胞的生物能学和新陈代谢34,35,36。因此，从这种破坏复苏看起来可能性不大直观。
相反，原来的期望ations，细胞甚至可以在后期阶段扭转凋亡细胞死亡的过程。通过连续地监测在培养濒死细胞的命运，我们观察到晚期凋亡的可逆性的范围内的初级细胞和细胞系12,13。除去死亡的刺激的允许回收从细胞凋亡的显性功能，如线粒体碎裂，染色质凝聚，DNA损伤，质膜起泡，磷脂酰丝氨酸的细胞表面暴露，线粒体细胞色素c释放，caspase激活，核碎裂，细胞皱缩，和凋亡小体形成。这些观察结果提出有关的功能，后果和anastasis机制悬而未决的问题。为了解决这些问题，一个先决条件是要可靠地识别已发生anastasis细胞。在这里，我们描述了活显微镜的方法和胱天蛋白酶的生物传感器，用于检测细胞先前已逆转晚期凋亡和第恩幸存。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.准备细胞活细胞成像的
- 为了方便的形态变化的检测，选择贴壁细胞例如HeLa（人宫颈癌）细胞是平坦的基板上，以更好地可视化改变质膜和细胞器的。
注：细胞凋亡的逆转已在各种哺乳动物细胞中12,13，包括原代小鼠肝细胞，原代巨噬细胞，原代大鼠心肌细胞中观察到，并且还细胞系，例如人胚胎肾HEK-293T细胞，非洲绿猴肾上皮的COS -7细胞，小鼠心肌的HL-1细胞，小鼠NIH 3T3成纤维细胞，雪貂（ 鼬putoris呋喃 ）脑CRL1656细胞，人类皮肤癌A375细胞，人睾丸癌CRL1973细胞，人小细胞肺癌H446细胞，人肝癌HepG2细胞，人乳腺癌MCF7细胞，人前列腺癌PC3细胞，和人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞。 - 的玻璃底细胞培养皿以用于清洁和灭菌的无水乙醇预洗涤盖玻片。
注1：使用的玻璃底培养皿被推荐用于高质量微分干涉对比（DIC）显微镜，和高放大倍数的共焦或落射荧光显微镜（见讨论）。
注2：对于高放大倍率（40X，60 / 63X或100X的目标，高数值孔径1.3或1.4），使用的细胞培养皿更薄的玻璃底部（厚度0.085-0.16毫米），提供更长的工作距离成像（见协议3 ）。 - 取决于细胞类型，玻璃底培养皿可能需要涂覆有聚-D-赖氨酸（0.1毫克/毫升），胶原蛋白（在0.01M的乙酸0.01％溶液）和/或纤连蛋白（5微克/毫升）之前播种细胞。
注意：需要对不同的细胞系的类型和涂布剂的浓度的优化。 HeLa细胞可以直接在玻璃上附着无涂层。然而，一些细胞，苏CH小鼠心肌的HL-1细胞，不能直接附着于玻璃表面，但需要特定的培养和涂层协议37。 - 种子〜2-3×10 5个细胞在35 mm预涂覆的玻璃底部的细胞培养皿中，并在37摄氏度（℃），用5％的CO 2，每天达到80％汇合。
注1：细胞密度，孵育时间，和培养条件的最佳条件可以变化，这取决于细胞类型。细胞汇合可以影响细胞（见方案2）的凋亡反应。在高汇合，细胞可以是细胞凋亡刺激的相同浓度的较不敏感。
注2：避免过度融合细胞，为高密度可以掩盖单个细胞和细胞器的形态变化。
2.应用和删除凋亡细胞的刺激
- 不久在使用前，用37℃的细胞培养液中预混合的细胞凋亡诱导剂。乙醇（3.6-4.5％体积/体积）作为细胞凋亡诱导剂，在本示范。
注1：我们的公布和未公布的数据表明，细胞也可逆转是受其他凋亡刺激12,13触发凋亡，如二甲亚砜（DMSO，8％体积/体积为24小时），星形孢菌素（STS，0.5微米为1小时），和紫杉醇（1μM12小时）。需要优化剂量的用于触发凋亡为不同类型的细胞，以达到可触发大部分细胞在人口中进行细胞凋亡的最低剂量。
注2：预混合的细胞凋亡诱导剂具有细胞培养基是重要，以避免细胞的不均匀接触凋亡刺激。 - 图像的一组健康的细胞在细胞培养皿的施加的凋亡诱导剂来建立基线形态之前。
- 除去从细胞培养皿原始介质，然后应用2毫升预混细胞凋亡诱导剂的菜触发细胞凋亡。孵育所述细胞在37℃，5％的CO 2（或其它正常培养条件）。
- 孵育后，观察细胞的光，落射荧光或共聚焦显微镜来监测凋亡特征的进展。
注1：细胞经历凋亡，将显示可以由显微镜和基于荧光的生物传感器来检测凋亡的形态学，生物化学和分子标志（见议定书3和4）。
注2：细胞不同的细胞凋亡诱导剂的孵育时间会有所不同，这取决于细胞类型，细胞的条件（如汇合和营养状态），和死亡的刺激的施加剂量。小心滴定可能需要。 - 当细胞显示凋亡的标志，通过用温热（37℃，或其他正常培养温度）新鲜细胞培养基一次洗涤细胞除去细胞凋亡诱导剂。
注1：由于凋亡细胞是较为松散的连接培养板，以应用和轻轻取出介质，使得细胞不会被冲走是重要的。
注2：在线悬浮的细胞可以从上清液通过温和离心（160×g离心1分钟）来回收，并重新添加到培养皿。 - 孵育细胞，在37℃用2ml /新鲜细胞培养基在5％CO 2 35毫米的菜。可替代地，使用的条件培养基（从健康细胞中收集无细胞的培养基中），以进一步增强凋亡细胞的存活。
注意：洗涤和温育的细胞用新鲜培养基使大多数细胞乙醇暴露12,13后逆转乙醇诱导的凋亡。然而，重复的，可能需要此洗涤步骤时，细胞暴露于其它细胞凋亡刺激（见讨论）。
3.活细胞显微镜
- 我们建议使用一个倒置的共焦或落射荧光显微镜环境控制（37°C，5％的CO 2），用于活细胞显微镜检查。
注意：也可以将图像的使用直立显微镜用与水浸渍目标细胞。直接蘸目标到培养基中图像的细胞。然而，细胞可以通过浸渍物镜聚焦过程中压碎。 - 预暖显微镜（如环境控制室，舞台孵化器，客观加热器）成像前至少2小时。
注意：这允许显微镜部件达到热平衡，这样它可避免焦点和xy平面的偏移的漂移，由于各组分的热膨胀和收缩。 - 放置培养细胞的35毫米的玻璃底培养皿（参见方案1）在倒置显微镜的阶段，并用40X或63X计划复消色差透镜物镜具有的数值孔径（NA）为1.3或1.4捕获细胞图像，用于从成像单元透过玻璃盖玻片的菜底部。
注意：避免将超过200毫升培养基到35毫米的玻璃底皿中，作为介质的重量会导致玻璃底的曲率，使得难以图像单元的字段在同一焦平面上。 - 在整个成像过程中保持细胞在37℃或相应的正常温度。
注：细胞凋亡的方法，和细胞凋亡的可能逆转，取决于温度敏感酶活性。因此，在37℃下保持的细胞（ 例如，用显微镜阶段顶部孵化）是在整个实验重要。降低温度能减缓细胞凋亡反应和清除细胞凋亡刺激后恢复响应。 - 使用湿度设备或躺在一个透明的箔（见材料）上的培养皿中蒸发介质，以减少水分流失。
注：箔可能会破坏光的极性DIC显微镜。通过调整偏振片在光路恢复极性。 - 保持pH值在细胞培养基（pH为6.8 -7.3）孵育在5％CO 2在显微镜的环境控制腔室。
注意：维护在培养基中的pH值可以通过添加HEPES缓冲剂来达到的，或者通过使用商用CO 2独立培养基（见材料）。最佳条件可以变化，这取决于细胞类型。 - 在成像过程中最小化荧光/激光（激发光强度）暴露于细胞，以避免光毒性通过降低的荧光强度为最低，以获得细胞/亚细胞结构或表达的生物传感器（在协议4详细内容）的高品质的图像必需的。
期间和之后细胞凋亡活动4.策略检测和跟踪Anastasis
- 质膜出泡，细胞质凝聚，细胞皱缩和凋亡小体的形成（参见图1A - C，E）。
- 执行时间推移活细胞迪菲rential干涉对比（DIC），或相差显微镜跟踪一组健康细胞，并观察其细胞形态（见协议3的活细胞显微镜，并见讨论）。
注1：减少的光源，用于DIC /相位合同成像强度，以避免光毒性的细胞。
注2：如果DIC和相差显微镜不可用，则使用CellTracker染色胞浆勾勒活细胞的形态为共焦或落射荧光显微镜和监测细胞形态。 - 应用细胞死亡的刺激触发细胞凋亡（参见协议2的应用程序，并清除凋亡刺激）。
- 观察处理的细胞的细胞凋亡的形态学特点如质膜起泡，细胞质凝聚，细胞皱缩和细胞凋亡体的形成（ 图1A，1B，1C，1E）。
- 洗去死亡的刺激，并重新供应细胞与细胞时新鲜培养基DISPLA细胞凋亡形态Ÿ标志。
注1：应用细胞死亡的刺激或在时间推移活细胞成像改变显微镜舞台上的细胞培养液中可以通过使用灌注细胞培养室来实现，也可以直接在细胞培养皿中不小心触碰进行吹打盘中，中成像之间的时间间隔。
注2：使用焦点漂移补偿系统，以避免出由于显微镜系统的热平衡的损失的细胞的焦点的改变的细胞培养基（见讨论）之后。 - 持续时间推移成像追踪细胞凋亡显示的标志的命运。要彻底扭转凋亡细胞可以修复损伤，恢复正常的形态持平（ 图1A，1B，1C，1E）。
- 执行时间推移活细胞迪菲rential干涉对比（DIC），或相差显微镜跟踪一组健康细胞，并观察其细胞形态（见协议3的活细胞显微镜，并见讨论）。
- 线粒体分裂，DNA /染色质浓缩和核碎裂（ 见图1D，1F，1G）。
- 可视化和线粒体RIA，染色细胞用50nM的MitoTracker红/深红/绿荧光染料，并同时染色用的Hoechst 33342蓝色核染料在培养基中10μg/ ml的20分钟的核，在37℃，5％的CO 2。
注1：减少染料和孵育时间的浓度，以避免细胞毒性和降低背景荧光时的需要。优化染色条件，得到了良好的信噪比与染料和温育时间为染色的最小量。
注2：使用荧光染料的线粒体，如MitoTracker红CMXRos，MitoTracker深红FM，或MitoTracker绿色FM，从线粒体细胞凋亡过程中不会泄露出去。这使得细胞凋亡和anastasis在可视化线粒体形态。请参阅材料和设备表中有关这些污渍的详细信息。 - 保持染色的细胞在黑暗中，以避免光漂白。
- 由洗涤细胞去除多余的污点3次，用37℃的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液或新鲜的细胞培养液中，用1分钟温育在每次洗涤之间的新鲜培养基，然后在最后一次洗涤之前进一步孵育在新鲜培养基中20分钟，以允许过大的渍退出细胞减少非特异性背景信号进行成像。
注意：缩短培养时间与细胞培养基后染色可能导致高背景用于成像。 - 前凋亡诱导施加执行实时活细胞共聚焦或落射荧光显微镜图像的健康细胞（参见方案3为活细胞显微术）。
注：健康的细胞显示管状线粒体和细胞核周围的大多数细胞类型（ 图1D，1F，1G）。 - 触发细胞凋亡（参见方案2为应用和去除凋亡刺激向细胞）。
- 持续时间推移活细胞显微镜观察线粒体和核形态学改变IES后立即死亡刺激被施加到细胞。观察细胞显示凋亡的标志，如线粒体碎片和肿胀，染色质凝聚和核碎裂，而相比之下，健康细胞显示管状线粒体和圆形核。
- 当细胞显示凋亡的标志，洗净，用新鲜培养基供给细胞，并继续延时成像追踪细胞的命运。要彻底扭转凋亡细胞恢复正常的线粒体和核形态（ 图1D，1F，1G）。
注意：在并行执行的DIC显微镜时可能获得的附加信息通过观察细胞形态的改变，在同一组中的细胞（参见协议4.1 DIC显微镜）的访问凋亡的阶段。
- 可视化和线粒体RIA，染色细胞用50nM的MitoTracker红/深红/绿荧光染料，并同时染色用的Hoechst 33342蓝色核染料在培养基中10μg/ ml的20分钟的核，在37℃，5％的CO 2。
- 检测细胞色素线粒体释放c。使用细胞稳定表达细胞色素C-GFP融合公关otein（参见图2）。
- 染色稳定表达细胞色素C-GFP 23,24与MitoTracker红色标记极化细胞的线粒体（参见4.2.1步骤4.2.3活细胞线粒体染色）。
- 执行实时活细胞共焦或落射荧光显微镜追踪健康细胞（在协议3的活细胞成像细节）。
注：细胞色素C-GFP信号主要定位于健康细胞（ 图2A I，2B）的线粒体。 - 触发细胞凋亡（参见方案2为应用和去除凋亡刺激向细胞）。持续时间推移显微镜观察细胞色素C-GFP易位从线粒体到细胞质（ 图2Aii-III，2B）。
注意：线粒体释放细胞色素c到胞质溶胶是线粒体外膜透化的标记物（MOMP）4，在线粒体依赖性凋亡21,22的关键步骤 - 当细胞显示在细胞质中的细胞色素C-GFP信号，去除细胞死亡的刺激和供应电池用新鲜培养基（见协议2）。持续时间推移成像追踪细胞胞浆GFP的命运。
注：反向凋亡细胞恢复正常的细胞形态，并可能是通过降解或易位减少细胞内细胞色素C-GFP信号反馈到线粒体（ 图2Aiv-VII，2B）。 - 捕获的DIC图像在平行于获得附加信息用于通过在单细胞或细胞群（参见协议4.1 DIC显微镜）细胞形态观察改变访问凋亡的阶段。
- 检测使用胱天蛋白酶的生物传感器caspase活性的（ 见图3）
- 转染的细胞与胱天蛋白酶的生物传感器NES-DEVD-YFP-NLS为16至24小时对他们进行细胞凋亡刺激13之前。
- 染色染培养用Hoechst 33342标记细胞的细胞核（参见4.2.1步骤4.2.3活细胞核染色）。
- 执行实时活细胞共焦或落射荧光显微镜追踪健康细胞（在协议3的活细胞成像细节）。
注意：NES-DEVD-YFP-NLS生物传感器信号，主要定位于由于其核输出信号（NES）（ 图3A，3Bi和3C，见讨论）的健康细胞的胞质溶胶中。 - 触发细胞凋亡（参见方案2为应用和去除凋亡刺激向细胞）。持续时间推移显微镜观察YFP核易位。
注：半胱氨酸蛋白酶切割激活的DEVD主题的蛋白酶生物传感器NES-DEVD-YFP-NLS，导致YFP-NLS易位从细胞质到细胞核（ 图3A，3Bii-IV，见讨论）。
- 持续时间推移成像跟踪细胞显示核YFP的命运。
注：核YFP信号将成为降级的几个小时后，细胞已经逆转细胞凋亡（ 图3B，VI-X，单元1，见结果与讨论）大概是通过细胞的正常通关机制，如蛋白酶体降解。 - 捕获的DIC图像在平行于获得附加信息用于通过在细胞形态在单细胞或一组细胞观察改变访问凋亡的阶段。 （见协议4.1 DIC显微镜）。
- 在GL种子细胞屁股盖玻片达到80％细胞汇合（参见协议1）。
- 联合染色细胞红色荧光MitoTracker和蓝色的Hoechst 33342染色的线粒体和细胞核，分别为（参见4.2.1步骤4.2.3活细胞线粒体和细胞核染色）。
- 触发细胞通过使用细胞凋亡诱导发生凋亡（参见方案2）。
- 应用荧光标记的膜联蛋白V（参见材料）在37℃下除去细胞凋亡诱导剂，以检测凋亡细胞的表面上的磷脂酰丝氨酸的暴露前进行染色的凋亡细胞10分钟。
注1：健康细胞不染色膜联蛋白V，因为磷脂通常螯合上的内小叶的细胞质膜38。凋亡细胞被染色，膜联蛋白V，其结合到磷脂酰丝氨酸在细胞表面上（ 图4A和4B）。
注2：荧光标记的膜联蛋白V，也可以适用于染色的凋亡细胞IMM除去细胞凋亡诱导剂，用10分钟温育后ediately。 - 除去细胞死亡刺激物，用温PBS或新鲜培养基一次洗涤染色的细胞，然后在37℃下供给的细胞用新鲜的培养基进行2小时，用5％的CO 2（见方案2）。
注1：细胞逆转细胞凋亡恢复正常的形态和恢复正常的形态后保留荧光标记的膜联蛋白V信号（ 图4A和4B）。
注2：随着时间的推移对回收的细胞（见讨论）的膜联蛋白V信号减小。 - 固定细胞，用4％多聚甲醛含8％蔗糖在1×PBS中进行20分钟，在黑暗中在室温下选择的时间点，并清洗所述固定的细胞用PBS进行3次在载玻片上固定的细胞之前去除低聚甲醛盖玻片与抗褪色封固剂（见材料）的共焦或落射荧光显微镜和清除细胞凋亡诱导剂后，观察细胞的膜联蛋白V。
注1：蔗糖固定液固定期间保持细胞膜结构。
注2：存储在黑暗的多聚甲醛溶液在4℃，以防止退化。
注3：将它应用到细胞固定，以避免冷休克到细胞中之前预热多聚甲醛溶液至室温。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
研究细胞凋亡的逆转，组织培养细胞的第一次接触到死亡刺激触发细胞凋亡。当细胞凋亡显示的标志，新鲜的培养液中，然后应用到洗去刺激，然后孵化死亡的细胞，使恢复（ 图1A）。这里，正在解决的关键问题是个人的濒死细胞培养多远，能对细胞凋亡的进展，仍然接受anastasis。这个问题可以明确回答连续监测的生物标记物来跟踪使用下面描述的方法的细胞命运。
我们首先描述我们的策略通过使用时间推移活细胞显微术，这是需要用于跟踪和记录之前各个单元的响应，在此期间，检测逆转细胞凋亡的组织培养的细胞，并暴露于细胞凋亡刺激后12,13。健康的贴壁细胞铺在自己的附加基板（图1Bi）12,13，并显示丝状线粒体和治疗前一轮核（ 图1CI，迪，EI，网络，GI）12,13。暴露在细胞培养基中（体积/体积）3.8-4.5％的乙醇后，DIC或相差显微镜发现该细胞表现出的细胞凋亡的形态学特点，包括胞质缩合，质膜起泡和细胞收缩（ 图1Bii，1Cii-三，和1Eii-VI）12,13。凋亡小体的形成由同一个细胞容易被观察到的DIC（ 图1Eii-VI）。 MitoTracker标记线粒体的碎片（ 图1Dii-ⅲ，1Fii-ⅵ）12,13以及Hoechst的染色核DNA的缩合（ 图1Dii-ⅲ，FII-ⅲ，GII）12,13，和核碎裂（ 无花果URES 1Evi和FVI，白色箭头），共聚焦或落射荧光显微镜同时检测。成功地扭转凋亡细胞随后观察到恢复正常的形态，显然修复的伤害（ 图1Biii，C和div-VI，E和FVII-XII和GIII）12,13。在这些条件下，细胞也已被证明重新获得基于荧光发射量子点和细胞分裂13摄取的细胞器运动，细胞迁移，和功能性细胞内吞。有趣的是，某些细胞凋亡尊称显示不规则核形态（ 图1Fxii），并且还异常细胞分裂和形成微核（ 图1Giv-ⅶ）13，其是DNA损伤，染色体断裂和整个染色体损失的分裂细胞的生物标记39，40。流离失所Çhromosomes或染色体片段外不能被包括在子细胞核由核膜39,40被封闭。因此，anastasis的结果可能是流产的细胞凋亡过程中被损坏的基因组的窝藏，从而导致肿瘤发生和癌症的发展。微核的存在也是癌细胞40,41常见。
线粒体细胞色素c释放是调解或放大caspase依赖的细胞凋亡20-22的关键步骤。使用HeLa细胞稳定表达GFP标记的细胞色素C，我们监测细胞色素C的亚细胞凋亡搬迁和anastasis共聚焦显微镜中。据报道23,24，定位于线粒体在治疗之前（ 图2AI和B），但随后的细胞色素C-GFP被释放到胞质溶胶后死亡的刺激已应用于（ 图2Aii，2Aiii和B）。其他特征形貌，如线粒体碎片和质膜起泡，也观察到在该释放了的细胞色素C-GFP（ 图2Aiii）细胞。这些细胞报道细胞色素C 23-27释放后不久发生细胞死亡。然而，去除死亡的刺激后，我们观察到细胞内细胞色素C-GFP的水平有所下降，细胞线粒体恢复丝状结构，以及细胞膜恢复正常外观（ 图2Aiv-VII， 和B）。因此，凋亡细胞色素c线粒体释放后接受anastasis。
下游DEVD切割半胱天冬扩增普遍认为是“不归路”，在细胞凋亡2,5。因此，我们使用了胱天蛋白酶的生物传感器NES-DEVD-YFP-NLS EXPR从质粒13 ESSED，使得它能够检测先前已经历caspase活性（ 图3A）的存活细胞。此蛋白酶的生物传感器是一个具有N-末端核排斥信号（NES），与接头的胱天蛋白酶3/7共识切割位点（DEVD）26,42,43，其次是黄色荧光蛋白（YFP）和多肽C-末端核定位信号（NLS）。在健康的细胞，该生物传感器主要定位于胞质溶胶作为NES的功能（ 图3Bi，次-ⅳ和D）13。在细胞凋亡，激活半胱氨酸蛋白酶切割DEVD主题，释放YFP-NLS，它有效地从细胞质到细胞核转位的细胞同时或随后，细胞凋亡显示其他功能，如DNA /染色质浓缩和细胞皱缩（ 图3B II -iv，和D）13。因此，该SE细胞保留以下caspase激活核导入功能。除去细胞凋亡诱导后，细胞经历已经发生，即使caspase激活（anastasis显示形态恢复图3BV-X， 和D）13，显然扭转晚期凋亡。在正常形态的恢复时，核YFP信号在某些细胞中的强度降低时，他们开始去除死亡的刺激（ 图3BV-X，小区1）13的后逆转细胞凋亡，这表明细胞降解的蛋白酶裂解的生物传感器，可能是通过用同样的机制来中和anastasis后除去其它胱天蛋白酶裂解产品。
Anastasis也可以不活细胞显微镜检测。这可以通过使用荧光标记的膜联蛋白V 38,44，其结合并标记在细胞凋亡的早期步骤（外部磷脂酰丝氨酸（PS）来实现
图1：由活细胞成像跟踪逆转细胞凋亡。 （授权转载唐等人，MBOC 23，二二四○年至2252年13，为图1A - D和G）。 （A）的方法，以诱导细胞凋亡，并随后允许培养的细胞洗去细胞凋亡诱导后回收。（B）的时间推移活细胞相衬的健康初级小鼠肝细胞（未处理的）显微镜，同一组细胞的治疗在培养基（体积/体积）4.5％的乙醇5小时（经处理），然后洗涤，并进一步温育用新鲜培养基进行24小时（洗涤）。比例尺为100μm。（C）连续时间推移活细胞落射荧光ETHA前相同的主小鼠肝细胞的显微镜NOL处理（i）中，在所指示的时间与4.5％乙醇处理的细胞培养基中2.5小时（II和III），并且洗涤后后，用新鲜的培养基孵育，以允许恢复1小时（四 - 六）。 MitoTracker染色线粒体（红色）和Hoechst的染色核（蓝色）的合并后的图像进行落射荧光显微术，并通过DIC显微镜细胞形态观察。比例尺，10μm以下。（D）的合并荧光只（无DIC）从图C的图像揭示了细胞器的形态。（E）的乙醇处理前的人小细胞肺癌H446细胞的连续时间推移活细胞共聚焦显微镜（ⅰ）与在细胞培养基中3.8％乙醇处理2小时28分钟（II-VI）后，并经过洗涤和用新鲜培养基孵育，以允许恢复（VII-12）。 MitoTracker染色线粒体（红色）和赫斯特染色细胞核（蓝色）的合并图像通过共聚焦显微镜和c可视化 ELL形态由DIC显微镜。白色箭头表示凋亡小体（六）一个支离破碎的核心。从图 E比例尺，10微米。（F）合并荧光图像只（不DIC）揭示细胞器的形态。（G）连续 时间推移活细胞落射荧光显微镜对单个HeLa细胞是经过不精确细胞分裂单色赫斯特染色核成像。乙醇处理（i），治疗用4.3％的乙醇在细胞培养基中进行5小时之前（ii）和乙醇除去后（洗涤，III-VI）。面板IV显示异常的细胞分裂。红色箭头表示在分割单元（IV-VI）的主要核。比例尺，30微米。时间表示为小时：分钟，请点击这里查看此图的放大版本。
古尔2“SRC =”/文件/ ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg“/>
图2：在细胞色素C线粒体释放（A）HeLa细胞之前（一）稳定表达细胞色素C-GFP（ç细胞病毒- GFP）的连续时间推移活细胞共聚焦显微镜， 检测后，逆转细胞凋亡 （Ⅱ-Ⅲ）和之后（III-VII）暴露于3.9％的乙醇在细胞培养基中。 CytoC-GFP（绿色），MitoTracker染色线粒体（红色）和赫斯特染色细胞核（蓝色）的合并共聚焦图像相结合，与DIC图像（左图）。未合并版本分别显示CytoC-GFP，表现为信号强度的热图（左中间面板），CytoC-GFP（中图）的单色图象，和线粒体的单色图像（右中图）。合并后的图像CytoC-GFP和线粒体（右图）的。（B）的细胞，Cel脱气的胞浆细胞色素C-GFP信号强度的变化升1和小区2，如在面板艾单色CytoC-GFP的图像表示。时间表示为小时：分钟，请点击这里查看此图的放大版本。
图3：caspase激活（唐等人，MBOC 23日，2240至2252年 13 授权转载，为图3A - Ð。）后逆转检测细胞凋亡。核输出信号（NES），在DEVD胱天蛋白酶切割位点，黄色荧光蛋白（YFP）和核定位信号（NLS）构成的生物传感器的caspase融合蛋白（A）的示意图。（B）的连续时间推移活HeLa细胞表达该蛋白酶的生物传感器NES-DEVD-YFP-NLS之前（I），在此期间的细胞共聚焦显微镜（ⅱ -iv）和之后（VX）暴露于4.3％的乙醇在细胞培养基中。该蛋白酶生物传感器（绿色）的合并共聚焦图像，赫司特染色细胞核（蓝色）和DIC的图像（左图），YFP信号（中间面板）的单色图像，热图表明YFP信号强度（右图） （C）的过程中进行分析作为在面板B。（D）的量化的荧光强度在单个细胞（编号1和2中面板的Bi）的活化的核的caspase生物传感器之前，未处理的对照，和乙醇暴露后，并在未处理的对照（编号为3和4在面板次）进行了计算，作为YFP存在于细胞核中（核/总细胞YFP的信号强度×100％）的百分比。时间显示为小时：分钟。比例尺，10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：通过荧光标记的膜联蛋白V反转检测细胞凋亡（授权转载唐等人，MBOC 23日，2240年至2252年13，为图4A - B）。在面板B。（B）的新生大鼠原发性心脏心室肌细胞暴露于细胞培养基中4.5％的乙醇5小时，然后与膜联蛋白V-FITC对10中使用的膜联蛋白V-FITC anastasis测定的（A）的图分钟，然后除去乙醇介质中。将细胞或者立即固定的（处理过的），或固定用新鲜培养基再投喂另外2小时后恢复（洗涤）。这暴露膜联蛋白V-FITC未经处理的细胞作为对照组（未处理）。 MitoTracker染色线粒体（红色），赫司特 - 染色的细胞核（蓝色）和膜联蛋白V-FITC（绿色）通过共聚焦显微镜观察，和细胞形态是可视化通过DIC显微镜。 SC啤酒酒吧，10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anastasis指现象，已激活的细胞死亡途径细胞随后扭转死亡过程和生存。在这里，我们已经证明，活细胞成像，可用于确认同一个体细胞其实可以在后期阶段逆转细胞凋亡的过程，然后继续生存和繁殖。我们的协议描述了几种优化的小区类型特定的处理条件，以诱导细胞凋亡和使细胞的相当大的比例，以进行细胞凋亡的逆转与几个生物标记进行验证监控。关于技术问题，玻璃底培养皿使用，因为高度透明的薄板玻璃细胞和显微镜物镜之间，它允许长的工作距离为高品质的共焦或落射荧光显微镜中的高倍率来培养细胞进行成像12,13，便于观察的经典凋亡，包括线粒体碎片，细胞色素C，和核固缩，碎裂的释放。玻璃也不会扭曲的光的极性，以使高品质的DIC显微镜对细胞凋亡的过程中监视膜出泡，细胞的细胞收缩和细胞凋亡体的形成。 DIC显微镜具有优势相差显微镜观察细胞凋亡形态，这些标志，作为DIC提高未染色的，透明的细胞样本的对比度，提高检测细胞形态的。如果DIC和相差显微镜不可用，CellTracker可以用来染色细胞溶质勾勒活细胞的形态为共焦或落射荧光显微镜和监测细胞形态。
适当的剂量死亡刺激的应用程序和去除刺激的战略是检测anastasis的关键步骤。我们选择使用低浓度的乙醇作为死亡刺激实验DESCRIBED这里，因为大百分比的处理的细胞可以均匀凋亡，可以从这种状态中恢复，可能较温和，死亡的刺激。然而，这些方法也可以成功地与其它死亡刺激施加，正如我们所报道12,13。然而，一些死亡刺激是本来就比其他诸如星形孢菌素（STS），通常使用的细胞凋亡诱导剂更具挑战性。也许是因为它结合了底材具有高亲和力46-48，重复洗涤非常重要，但是从细胞仍然不能有效地去除STS。在这种情况下，使用较低的药物浓度和较短的药物孵育时间仍然能够激活细胞凋亡死亡过程可能是有用的，以允许更多的细胞逆转细胞凋亡。再供给细胞与细胞条件培养基也可以增强逆转细胞凋亡比新鲜的细胞培养液中的更好。凋亡细胞通常松散地附着到培养皿表面特别是对玻璃河畔面孔，因此它是洗去细胞凋亡诱导剂轻轻地避免分离细胞的重要。涂覆玻璃的菜肴用聚-D-赖氨酸，胶原蛋白和/或纤连蛋白可以增加细胞粘附，以允许某些类型的细胞，如心肌细胞37，以适当地附着在细胞培养皿的玻璃表面，特别是细胞暴露于一个后死亡的刺激。
细胞凋亡的过程中，与细胞凋亡的可能逆转，取决于可以通过温度的影响酶活性。因此，在37℃或在其正常培养条件维持细胞在整个实时成像过程很重要，以确保试验结果的重现性。开始活细胞成像之前的预暖显微镜也允许在显微镜组件达到热平衡的关键一步。这可避免焦点和xy平面的偏移的漂移由于的热膨胀和收缩在活细胞成像组件。施加或除去死亡的刺激，通过改变介质的培养皿与任一吸管或通过灌注在预温热显微系统中延时成像仍然可造成聚焦的漂移由于温度变化或介质的体积。 Z堆叠采集有助于图像的细胞在正确的焦平面，反而会增加，由于细胞的额外暴露于荧光的激光器光毒性的风险。可替代地，使用焦点漂移补偿系统，例如红外激光为基础的自动聚焦校正系统，可以在时间推移活细胞成像通过维持细胞/玻璃和物镜之间的距离，而无需额外的细胞保持在相同的焦平面曝光的细胞对短波长，光毒性荧光。
线粒体释放促细胞凋亡蛋白如细胞色素c，和活化的效应半胱氨酸蛋白酶，如在下游/效果的或caspase-3的和caspase-7，已被普遍认为是“不归路”，在细胞凋亡过程2,5,6。 Western印迹被用于检测胱天蛋白酶-3的裂解（活化）和它的底物，如聚（ADP）核糖聚合酶-1（PARP）和DFF45 / ICAD在整个细胞群中的凋亡诱导和去除凋亡后刺激，并发现，裂解的caspase-3，ICAD，和PARP露面在细胞暴露于死亡刺激时，消失的细胞后重新进料与新鲜培养基13。然而，这些方法揭示在细胞群体的一般状况，但不区分，这将最终从那些将扭转凋亡然后生存模具的各个细胞。生化分离分析线粒体细胞色素c释放也有类似的警告。因此，跟踪单个细胞的细胞色素c释放和caspase-AC后的命运释放等，2凋亡2,5,6的最被认可的特点之一，GFP标记的细胞色素C（的Cytoç-GFP）和胱天蛋白酶的生物传感器，如一个在这里使用的NES-DEVD-YFP-NLS，结合活细胞显微镜直接观察形态学复苏和的CytoÇ-GFP生物传感器在相同的细胞中的易位规避了这些问题。这些结果表明，细胞凋亡的线粒体细胞色素c释放和caspase激活后的可逆性。
目前的挑战为研究anastasis是缺乏标记技术来检测已经经过anastasis在任何点在其整个寿命， 在体内或体外细胞中。胱天蛋白酶的生物传感器NES-DEVD-YFP-NLS稳定表达也允许检测胱天蛋白酶活性的胱天蛋白酶，如果在以后再次激活，但不会永久记录caspase活性的活化的生物传感器将不susta劣化独立非执行董事caspase活性13。其它先前报道蛋白酶的生物传感器，如基于FRET的SCAT生物传感器（ 例如 ECFP- [DEVD] -Venus）26,49以及荧光报告Apoliner（CD8-RFP- [DQVD] -GFP）50和CPV（ 例如 CD8 - [DEVD] -Venus）51,52，可以用来检测半胱氨酸天冬氨酸酶活性在整个动物和培养的细胞，但也有类似的限制。同样，的CytoÇ-GFP不能用于追踪细胞在长期逆转细胞凋亡，因为它是从线粒体释放到胞质溶胶的细胞凋亡过程中和随后降解。膜联蛋白V标记已被用于追踪细胞逆转细胞凋亡，但信号强度也下降用的时间，因此是不适合anastasis 13,45的长期跟踪是有用的。连续长期的体内成像可用于死亡刺激的曝光后追踪同一细胞的命运。然而，长期的体内成像仍然具有挑战性吨o在最活的动物表演。因此需要额外的方法来延长anastasis研究整体动物研究和筛选药物，可以促进或利用组织培养细胞抑制anastasis
在未来，即跟踪长期细胞命运新协议和技术，需要开发和测试anastasis的生理，病理和治疗意义。我们建议anastasis可能是一个普通的细胞存活机制抢救损伤的细胞，很难更换，例如成熟的神经元和心肌细胞13。然而，化学治疗后anastasis凋亡的癌细胞可能导致危险的细胞，导致复发性肿瘤12,13的恢复。 Anastasis也可能是肿瘤发生的重要机制，一些细胞显示恶性转化后，他们逆转细胞凋亡13。因此，提高anastasis可能是一个新的Therapeutic策略用于抑制神经变性和心脏衰竭，同时抑制anastasis作为用于预防或治疗癌症的新方法。开发生物传感器来跟踪逆转凋亡疾病模型系统会提前anastasis的细胞存活机制和潜在的治疗顽固性疾病的理解通过调节anastasis。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们感谢牧师博士拉尔夫Bohlmann和牧师詹姆斯Voelz博士提出了这个词“anastasis”来形容逆转细胞凋亡;道格拉斯·R·格林对HeLa细胞稳定表达细胞色素C-GFP;查尔斯·M.·鲁丁和Eric E.加德纳的H446细胞;希瑟羔羊，在视频卡通画援助;怡辉杨本手稿的价值的讨论。这项工作是由尤德爵士奖学金（HLT），博士沃尔特·司徒纪念奖学金（HLT），富布赖特资助007-2009（HLT），生命科学研究基金会的奖学金（HLT）的支持下，美国国立卫生研究院授予NS037402（JMH）和NS083373（江铃控股），以及香港大学教育资助委员会的AoE / B-07/99（MCF）。何林堂是生命科学研究基金会的Shurl和凯库尔奇基金会研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | ||
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
References
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
- Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
- Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
- Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
- Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
- Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
- Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
- Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
- Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
- Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
- Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
- Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
- Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
- Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
- Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
- Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
- Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
- Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).
