Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Strategier for sporing Anastasis, A Cell Survival fenomen som reverserer apoptose

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/51964
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1, 2
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Abstract

Anastasis (gresk for "stiger til liv") refererer til utvinning av døende celler. Før disse cellene komme seg, har de gått gjennom viktige sjekkpunktene av apoptose, inkludert mitokondrie fragmentering, frigjøring av mitokondrie cytokrom c inn i cytosol, aktivering av kaspaser, kromatin kondens, DNA-skade, kjernekraft fragmentering, plasmamembran blebbing, celle krymping, celleoverflaten eksponering av fosfatidylserin, og dannelse av apoptotiske legemer. Anastasis kan oppstå når apoptotiske stimuli fjernes før døden, og dermed lar døende celler å reversere apoptose og potensielt andre dødsmekanismer. Derfor synes Anastasis å involvere fysiologiske helbredende prosesser som også kan opprett skadede celler upassende. Funksjoner og mekanismer Anastasis er fortsatt uklart, hemmet delvis av de begrensede verktøy for å oppdage tidligere hendelser etter utvinning av tilsynelatende friske celler. Strategier for å oppdage anastasis vil gjøre studier av fysiologiske mekanismer, farene av vandøde celler i sykdom patologi, og potensielle therapeutics å modulere Anastasis. Her beskriver vi effektive strategier bruker levende celle mikroskopi og en pattedyr caspase biosensor for identifisering og sporing av Anastasis i pattedyrceller.

Introduction

Apoptose (gresk for "å falle til døden") er generelt antatt å være en enveisprosess ender i celle selvmord 1-7. Genetisk forstyrrelse av pro-døden gener resulterer i overlevelse av ekstra celler som ellers ville ha omkommet i hele dyr, inkludert celler som allerede har satt i gang apoptose pathway 8,9. Tilsvarende genetiske manipulasjoner tillate sunne pattedyrceller som kunstig viser "spiser meg" signaler eller som mister klebeevne til sin ekstracellulære matrise for å unnslippe døden ved helcelle fagocytose eller entosis henholdsvis 10,11. Imidlertid, vi og andre har vist at uten genetisk manipulasjon normale, friske pattedyrceller og cellelinjer kan også komme fra de tidlige stadier av apoptose 12-15. Ved hjelp av verktøy for å spore enkeltceller, har vi ytterligere demonstrert utvinning fra sene stadier av apoptose 12,13, etter at cellene har passert viktige sjekkpunkter som typiskly markere "point of no return" 2-6. Disse sjekkpunkter for sent stadium apoptose inkludere mitokondrie frigjøring av cytokrom c, aktivering av kaspaser, kjernekraft fragmentering, og dannelse av apoptotiske legemer. Vi har vedtatt en gresk sammensatt ord "Anastasis", som betyr "stiger til liv", for å beskrive denne reversering av apoptose ved randen av celledød 2-6.

Med mindre hele døende-gjenopprettingsprosessen er observert av levende celle bildebehandling, og det er utfordrende å skille celler som har gjennomgått Anastasis fra celler som aldri opplevd apoptotiske hendelser. Tiår med arbeid har avdekket at de morfologiske trekk ved celle selvmord ved apoptose er drevet av evolusjonært konserverte biokjemiske og molekylære hendelser 16-19. Disse hendelsene fremme selvdestruksjon av celler for å regulere utviklings- og homoeostatic prosesser i encellede og flercellede organismer ved å eliminere skadet eller dangerous celler 16-19. Mens apoptotiske celler kan lett preget av standardiserte morfologiske, biokjemiske og molekylær manifestasjoner av apoptose 1,5,6,16,20, for tiden er det ingen kjent markør spesifikk Anastasis 12,13. Viktigere, celler som har gjennomgått Anastasis synes å være normale, friske celler, og celler som bare begynner å reversere apoptose vises som apoptotiske døende celler 12,13. Dermed er nye verktøy som trengs for å konkludere med sikkerhet at en gitt gjenlevende celle tidligere hadde opplevd aktive apoptotiske prosesser.

Apoptose er generelt antatt som en irreversibel kaskade, fordi det er en hurtig og massiv ødeleggelse prosessen. Mens det kan ta minutter til dager for noen celler å initiere apoptose, når mitokondriene har sluppet apoptogenic faktorer som cytokrom c inn i cytosol 21,22, kan kaspaser aktiveres innen fem minutter 23,24, etterfulgt av cytoplasma ogatom kondens i 10 min 25-27, og celledød kort tid etterpå 25-27. Aktiverte caspaser organisere apoptose ved å spalte og inaktive viktige strukturelle og funksjonelle komponenter for det formål av cellulær riving 2,28, for eksempel endonuklease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Kaspaser aktiverer også pro-apoptotiske faktorer, som BCL-2 familiemedlem BID, som translocates til mitokondriene for å fremme mitokondrie frigjøring av cytokrom c 31,32. Caspase aktivitet resulterer også i celleoverflaten eksponering av fosfatidylserin som en "spise meg" signal for å fremme engulfment av døende celler ved makrofager eller nabo celler gjennom fagocytose 33. Videre apoptotiske hendelser gjengi mitokondriene dysfunksjonelle, forstyrre mobilnettet bioenergi og metabolisme 34,35,36. Dermed synes intuitivt usannsynlig utvinning fra slike ødeleggelser.

I motsetning til originalen forventeasjon, kan cellene reversere apoptotisk celledød prosessen enda på et sent stadium. Ved kontinuerlig å overvåke skjebnen til døende celler i kultur, observerte vi den er reversibel sent stadium apoptose i en rekke primærceller og cellelinjer 12,13. Fjerning av død stimulans tillatt utvinning fra utilslørt funksjoner i apoptose, som mitokondrie fragmentering, kromatin kondens, DNA-skade, plasmamembran blebbing, eksponering av fosfatidylserin celleoverflaten, frigjøring av mitokondrie cytokrom c, caspaseaktivering, kjernekraft fragmentering, celle krymping, og dannelse av apoptotiske legemer. Disse observasjonene heve ubesvarte spørsmål angående funksjoner, konsekvenser og mekanismer for Anastasis. Å ta opp disse spørsmålene, er en forutsetning for å pålitelig identifisere celler som har gjennomgått Anastasis. Her beskriver vi live-mikroskopi metoder og en caspase biosensor for å påvise celler som tidligere har snudd sent stadium apoptose og thno levde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av celler for Live-Cell Imaging

  1. For å lette deteksjonen av morfologiske endringer, velger adherente celler så som HeLa (human cervikal karsinom) celler som er flatt på underlaget for bedre å visualisere endring av plasmamembranen og intracellulære organeller.
    Merk: Tilbakeføring av apoptose har blitt observert i ulike pattedyrceller 12,13, inkludert primær museleverceller, primær mus makrofager, primær rotte cardiomyocytes, og også cellelinjer som menneske embryonale nyre HEK-293T celler, afrikansk grønn ape renal epitel COS -7 celler, mus hjertemuskel HL-1 celler, mus NIH 3T3 fibroblaster, ilder (Mustela putoris furo) hjerne CRL1656 celler, menneske hudkreft A375 celler, menneske testikkelkreft CRL1973 celler, menneske småcellet lungekreft H446 celler, menneskelige leverkreft HepG2 celler, menneskebrystkreft MCF7 celler, menneskelige prostata kreft PC3 celler og menneskelige neuroblastom SH-SY5Y celler.
  2. Pre-wash dekkglass av glassbunn cellekultur retter med absolutt etanol for rengjøring og sterilisering.
    Merknad 1: Bruk av glassbunn retter anbefales for høy kvalitet differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi, og høy forstørrelse confocal eller epi-fluorescens mikroskopi (se diskusjon).
    Merknad 2: For høy forstørrelse (40X, 60 / 63x eller 100X mål og høye numeriske åpninger 1.3 eller 1.4), gir bruk av cellekultur retter med tynnere glass bunn (tykkelse 0,085 til 0,16 mm) lenger arbeider avstander for imaging (Se protokoll 3 ).
  3. Avhengig av celletypen, kan glassbunn kulturskåler krever belegg med poly-D-lysin (0,1 mg / ml), kollagen (0,01% løsning i 0,01 M eddiksyre) og / eller fibronektin (5 pg / ml) forut for såing celler.
    Merk: Optimalisering av typen og konsentrasjonen av beleggmiddel er nødvendig for forskjellige cellelinjer. HeLa celler kan følge direkte på glass uten belegg. Men noen celler, sulm som mus hjertemuskel HL-1 celler, ikke kan forholde seg direkte til glassflater, men krever spesielle kultur og belegg protokoller 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 celler på 35 mm pre-belagte glassbunn-cellekulturskåler og inkubert ved 37 grader Celsius (° C) med 5% CO2 i en dag for å oppnå 80% konfluens.
    Note 1: Optimale betingelser for celletetthet, inkubasjonstid, og dyrkingsbetingelser kan variere, avhengig av celletypen. Cell konfluens kan påvirke den apoptotiske respons av celler (Se protokoll 2). Ved høy konfluens, kan cellene være mindre følsom for de samme konsentrasjoner av apoptotiske stimuli.
    Merknad 2: Unngå over konfluente celler, så høy celletetthet kan tilsløre morfologiske endringer av individuelle celler og deres organeller.

2. Søknad og fjerning av apoptotiske Cell Stimuli

  1. Kort tid før bruk, før blande apoptose-induserende middel med 37 ° C cellekulturmedium. Etanol (03.06 til 04.05% Vol / vol) tjente som apoptose induser i foreliggende demonstrasjon.
    Note 1: Vår publiserte og upubliserte data viser at celler kan også reversere apoptose som utløses av andre apoptotiske stimuli 12,13, slik som dimetylsulfoksid (DMSO, 8% vol / vol i 24 timer), staurosporin (STS, 0,5 pM for 1 time), og taxol (1 uM i 12 timer). Optimalisering av dosering for å utløse apoptose er nødvendig for forskjellige typer av celler for å oppnå den minimumsdose som kan utløse de fleste av cellene i populasjonen til å gjennomgå apoptose.
    Note 2: Pre-blande apoptose-induserende midler med cellekulturmedium er viktig å unngå ujevn eksponering av cellene til apoptotisk stimuli.
  2. Bilde en gruppe av helse celler i cellekulturskål før påføring av apoptose-induserende middel for å etablere basislinje morfologi.
  3. Fjerne det opprinnelige mediet fra cellekultur fatet, og deretter bruke 2 ml ferdigblandet apoptose-induserende middel til parabolen tilutløse celler til å gjennomgå apoptose. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO2 (eller andre vanlige kulturbetingelser).
  4. Etter inkubasjon, observere cellene ved lys, epi-fluorescens eller konfokalmikroskopi å overvåke utviklingen av apoptotiske funksjoner.
    Note 1: Celler gjennomgår apoptose viser morfologiske, biokjemiske og molekylære kjennetegnene ved apoptose som kan detekteres ved fluorescens mikroskopi og baserte biosensorer (Se protokoll 3 og 4).
    Note 2: Inkubasjonstid av celler med forskjellige indusere apoptose, vil variere, avhengig av celletype, celler tilstander (slik som konfluens og næringsstatus), og dosen av død stimulus påført. Forsiktig titrering kan være nødvendig.
  5. Når cellene viser kjennetegnene ved apoptose, fjerner apoptose-induserende middel ved vasking av cellene en gang med varm (37 ° C, eller andre normale dyrkingstemperatur) friskt cellekulturmedium.
    Merknad 1: Som apoptotiske celler er mer løst festet påkulturplaten, er det viktig å påføre og fjerne mediet forsiktig, slik at cellene ikke blir vasket bort.
    Note 2: Levende suspendert celler kan utvinnes fra supernatanten ved forsiktig sentrifugering (160 xg for 1 min) og lagt tilbake til kulturen fatet.
  6. Inkuber cellene ved 37 ° C med 2 ml / 35 mm skål av frisk cellekulturmedium i 5% CO2. Alternativt bruk kondisjonert medium (cellefrie kulturmedium oppsamlet fra friske celler) for ytterligere å øke overlevelsen av apoptotiske celler.
    Merk: Vasking og inkubere celler med friskt medium tillate at mesteparten av cellene til å reversere etanol-indusert apoptose etter eksponering etanol 12,13. Imidlertid gjentas dette vasketrinn kan være nødvendig når cellene utsettes for andre apoptotiske stimuli (se diskusjon).

3. Live-Cell Mikros

  1. Vi anbefaler å bruke en omvendt confocal eller epi-fluorescens mikroskop med miljøkontroll (37 ° C,5% CO2) i levende celler mikroskopi.
    Merk: Det er også mulig å avbilde cellene ved hjelp av stående mikroskoper med en vann dipping objektiv. Dypp målet direkte i kulturmediet til bildeceller. Imidlertid kan celler bli knust av dyppe mål ved fokusering.
  2. Forvarme mikroskop (slik som miljø- styrekammer, trinn inkubator, og objektiv varmeapparat) i minst 2 timer før avbildning.
    Merk: Dette tillater mikroskop komponenter for å oppnå termisk likevekt, slik at den kan unngå avdrift av fokus og forskyvning av xy-planet på grunn av termisk utvidelse og sammentrekning av komponentene.
  3. Plasser en 35 mm glassbunn rett av dyrkede celler (se protokoll 1) på scenen av en invertert mikroskop og ta celle bilder ved hjelp av en 40X eller 63X plan-Apochromat objektiv med en numerisk apertur (NA) 1.3 eller 1.4 for bildebehandling celler fra bunnen av fatet gjennom dekkglass.
    Merk: Unngå å bruke over 2 ml mediumtil 35 mm glassbunn fatet, som vekten av mediet kan føre til krumning av glasset bunnen, noe som gjør det vanskelig å avbilde et felt av celler på samme fokalplan.
  4. Opprettholde cellene ved 37 ° C, eller den tilsvarende normal temperatur under hele avbildningsprosessen.
    Merk: Prosessen med apoptose, og sannsynligvis reversering av apoptose, avhenger av temperatursensitive enzymatiske aktiviteter. Derfor opprettholde cellene ved 37 ° C (for eksempel med en objektbord toppen inkubator) er viktig gjennom hele forsøket. Redusert temperatur kan forsinke apoptotisk respons og utvinning respons etter fjerning av apoptotisk stimulus.
  5. Bruk en fuktighets enhet eller legge et gjennomsiktig folie (Se Materials) på dyrkningsskålen å redusere vanntapet ved fordampning fra mediet.
    Merk: folien kunne forstyrre polariteten av lys mikroskopi for DIC. Gjenopprette polaritet ved å justere polarisator på lysbanen.
  6. Opprettholde pH icellekulturmedium (pH 6,8 -7,3) ved inkubering i 5% CO2 med et miljøstyrekammer på mikroskopet.
    Merk: Vedlikehold av pH i kulturmediet kan også oppnås ved tilsetning av HEPES-buffer, eller ved å bruke kommersielt CO 2-uavhengig medium (se Materials). Optimale betingelser kan variere, avhengig av celletypen.
  7. Minimer fluorescens / laser (eksitasjon lysintensitet) eksponering til celler i løpet av bildeprosessen for å unngå fototoksisitet ved å redusere fluorescens intensitet til den laveste nødvendig for å få bilder av celle / subcellulære strukturer eller uttrykt biosensorer (opplysninger i protokoll 4) av høy kvalitet.

4. Strategier for å avdekke og sporing Anastasis Under og etter apoptotiske Hendelser

  1. Plasmamembran blebbing, cytoplasmic kondens, celle krymping og apoptotisk kroppen formasjon (Se figur 1A - C, E).
    1. Utføre time-lapse levende celle differential interferens kontrast (DIC) eller fasekontrastmikroskopi for å spore en gruppe av helse celler og å observere deres cellemorfologi (Se Protokoll 3 for levende celle mikroskopi, og se diskusjon).
      Note 1: redusere intensiteten av lyskilden for DIC / fase kontrakt avbildning for å unngå fototoksisitet til cellene.
      Merknad 2: Hvis DIC og fasekontrastmikroskopi er ikke tilgjengelig, bruker CellTracker å farge cytosol å skissere morfologi av levende celler for confocal eller epi-fluorescens mikroskopi og overvåke cellemorfologi.
    2. Påfør celledød stimulans til å utløse celler til å gjennomgå apoptose (Se protokoll 2 for påføring og fjerning av apoptotiske stimuli).
    3. Observere behandlede celler for morfologiske kjennetegn på apoptose som plasma membran blebbing, cytoplasmic kondens, celle krymping og apoptotisk kroppen formasjon (figur 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Vaske bort død stimuli, og re-forsyning cellene med fersk medium når cellene display morfologiske kjennetegn på apoptose.
      Note 1: Bruk celledød stimulus eller endring av cellekulturmediet på objektbordet intervall levende celle avbildning kan oppnås ved hjelp av en perfusjon cellekulturkammer, eller kan utføres direkte på cellekulturskål ved forsiktig pipettering uten å berøre fatet, under intervallene mellom bildebehandling.
      Note 2: Bruk fokus drift kompensasjonssystemer for å unngå ute av fokus av cellene på grunn av tap av termisk likevekt av mikroskopet systemet etter endring av cellekulturmediet (se diskusjon).
    5. Sammenhengende time-lapse bildebehandling for å spore skjebnen til celler som viser kjennetegnene ved apoptose. Celler som reverserer apoptose kan reparere skader og gjenvinne normal flat morfologi (figur 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Mitokondrie fragmentering, DNA / kromatin kondens, og kjernefysisk fragmentering (Se figur 1D, 1F, 1G).
    1. For å visualisere mitochondria, beis celler med 50 nM MitoTracker rød / dyp rød / grønn-fluorescerende fargestoff, og samtidig flekke kjernen med 10 mikrogram / ​​ml Hoechst 33342 blå atom fargestoff i dyrkingsmedium for 20 min ved 37 ° C med 5% CO 2.
      Note 1: redusere konsentrasjonen av fargestoffer og varigheten av inkubasjonen for å unngå cytotoksisitet og redusere bakgrunnsfluorescens ved behov. Optimalisere fargingsbetingelser for å oppnå et godt signal-til-støy-forhold med den minimale mengde av fargestoff og inkubasjonstiden for farging.
      Merknad 2: Bruk fluorescerende flekker for mitokondrier som MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, eller MitoTracker Grønn FM, som ikke lekker ut fra mitokondrier under apoptose. Dette gjør det mulig å visualisere mitokondrie morfologi i løpet av apoptose og Anastasis. Se de materialer og utstyr tabell for detaljer om disse flekkene.
    2. Hold fargede celler i mørket for å unngå fotobleking.
    3. Fjern overskudd av flekken ved vasking av cellene3 ganger med 37 ° C, fosfatbuffer-saltvann (PBS) oppløsning eller frisk cellekulturmedium, med 1 min inkubasjon i friskt medium mellom hver vask, og så videre inkubert i friskt medium i 20 min før den endelige vask for å tillate overdreven flekker for å gå ut av cellene til å redusere ikke-spesifikt signal bakgrunn for avbildning.
      Merk: Forkorte inkubasjonstid med celle medium etter farging kan resultere i høy bakgrunn for bildebehandling.
    4. Utføre sanntid levende celle confocal eller epi-fluorescens mikroskopi til bilde friske celler før apoptotisk induksjon er brukt (se protokoll 3 for levende celle mikroskopi).
      Merk: Friske celler vise rørformede mitokondrier og runde kjerner i de fleste celletyper (Tall 1D, 1F, 1G).
    5. Utløse celler til å gjennomgå apoptose (Se protokoll 2 for påføring og fjerning av apoptotiske stimuli til cellene).
    6. Fortsett time-lapse levende celle mikroskopi for å observere endringer i mitokondrie og atom morphologies umiddelbart etter døden stimulus tilføres til cellene. Observere celler til å vise kjennetegnene ved apoptose som mitokondrie fragmentering og hevelse, kromatin kondens og kjernefysiske fragmentering, i motsetning til friske celler viser rørformede mitokondrier og runde kjerner.
    7. Når cellene vise kjennetegnene ved apoptose, vaske og forsyne cellene med fersk medium, og fortsette time-lapse bildebehandling for å spore skjebnen til cellene. Celler som reverserer apoptose gjenvinne normal mitokondrie og kjernefysisk morfologi (Tall 1D, 1F, 1G).
      Merk: Utfør DIC mikros parallelt når det er mulig å innhente ytterligere opplysninger for å få tilgang stadier av apoptose ved å observere endringer av cellemorfologi i den samme gruppen av celler (se protokoll 4.1 for DIC mikroskopi).
  3. Påvisning av mitokondriell frigjøring av cytokrom c ved hjelp av celler som stabilt uttrykker en cytokrom c -GFP fusjon protein (Se figur 2).
    1. Flekk celler stabilt uttrykker cytokrom c -GFP 23,24 med MitoTracker Red å merke polarisert celle mitokondrier (Se trinn 4.2.1 til 4.2.3 for levende celle mitokondriene farging).
    2. Utføre sanntid levende celle confocal eller epi-fluorescens mikroskopi å spore sunne celler (Detaljer i protokoll 3 for live cell imaging).
      Merk: cytokrom c -GFP signal primært lokaliseres i mitokondriene av friske celler (figur 2A jeg, 2B).
    3. Utløse celler til å gjennomgå apoptose (Se protokoll 2 for påføring og fjerning av apoptotiske stimuli til cellene). Fortsett time-lapse mikroskopi å observere translokasjon av cytokrom c -GFP fra mitokondriene til cytosol (Tall 2Aii-iii, 2B).
      Merk: Mitokondrie frigjøring av cytokrom c inn i cytosol er en markør for mitokondrie yttermembran permeabilization (MOMP)4, et kritisk punkt i mitokondriene avhengig apoptose 21,22
    4. Når cellene vise cytokrom c -GFP signal i cytoplasma, fjern celledød stimulans, og forsynings cellene med fersk medium (se protokoll 2). Fortsett time-lapse bildebehandling for å spore skjebnen til celler med cytosolisk GFP.
      Merk: Celler som reverserer apoptose gjenvinne normal celle morfologi, og redusere deres cytosolisk cytokrom c -GFP signal antagelig gjennom nedbrytning eller trans tilbake til mitokondriene (Tall 2Aiv-vii, 2B).
    5. Fange DIC bilder parallelt å innhente ytterligere informasjon for å få tilgang stadier av apoptose ved å observere endringer i cellemorfologi i enkeltceller eller gruppe av celler (se protokoll 4.1 for DIC mikroskopi).
  4. Påvisning av kaspase-aktivitet ved anvendelse av en caspase biosensor (se figur 3)
    1. Transfektere celler med caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS for16 til 24 timer før å utsette dem for en apoptotisk stimulus 13.
    2. Flekken transfekterte kulturer med Hoechst 33342 å merke cellekjerner (Se trinn 4.2.1 til 4.2.3 for live cell nuclear farging).
    3. Utføre sanntid levende celle confocal eller epi-fluorescens mikroskopi å spore sunne celler (Detaljer i protokoll 3 for live cell imaging).
      Merk: NES-DEVD-YFP-NLS biosensor signal primært lokaliseres i cytosol av sunne celler på grunn av sitt atom eksport signal (NES) (figur 3A, 3BI og 3C, se diskusjon).
    4. Utløse celler til å gjennomgå apoptose (Se protokoll 2 for påføring og fjerning av apoptotiske stimuli til cellene). Fortsett time-lapse mikroskopi for å observere kjernefysisk translokasjon av YFP.
      Merk: Aktivering av kaspaser spalter DEVD motiv i caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS, noe som resulterer i YFP-NLS trans fra cytosol til kjernen (3A, 3Bii-iv, se diskusjon).
      5. Merk: Celler som reverserer apoptose gjenvinne normal cellemorfologi, men beholder den nukleære YFP signal (fig 3Bv-x, Celler 1 og 2, og 3D).
    5. Fortsett time-lapse bildebehandling for å spore skjebnen til celler som viser kjernefysisk YFP.
      Merk: Atom YFP signal vil bli degradert flere timer etter at cellene har snudd apoptose (Tall 3B, vi-x, celle 1, Se resultater og diskusjon) antagelig gjennom normale cellemekanismene som proteasom degradering.
    6. Fange DIC bilder i parallell for å oppnå ytterligere informasjon for å få tilgang stadier av apoptose ved å observere endringer i cellemorfologi i enkeltceller eller grupper av celler. (Se Protocol 4.1 for DIC mikroskopi).
  5. Eksponering av fosfatidylserin celleoverflaten (se figur 4)
    1. Frø celler på glass Dekk å oppnå 80% celle confluency (Se protokoll 1).
    2. Co-beis cellene med rød-fluorescerende MitoTracker og blå Hoechst 33342 flekken for mitokondrier og kjerner, henholdsvis (Se trinn 4.2.1 til 4.2.3 for levende celle mitokondrie og nukleær farging).
    3. Utløse celler til å gjennomgå apoptose ved anvendelse av en apoptose induser (se protokoll 2).
    4. Anvende fluorescerende merk annexin V (se Materials) for å farge apoptotiske celler i 10 minutter ved 37 ° C før fjerning av apoptose-indus å detektere påvirkning av fosfatidylserin på overflaten av apoptotiske celler.
      Note 1: Sunn celler er ikke farget med annexin V fordi fosfatidylserin normalt sequestered på indre-heftet av cellen plasmamembran 38. Apoptotiske celler er farget med annexin V, som binder seg til fosfatidylserin på celleoverflaten (figurene 4A og 4B).
      Note 2: Fluorescent-merket annexin V kan også brukes til å farge apoptotiske celler IMMediately etter fjerning av apoptose induktor, med 10 minutters inkubasjon.
    5. Fjern celledød stimulus, vasker de fargede celler med varm PBS eller friskt medium én gang, og deretter forsyne cellene med friskt medium i 2 timer ved 37 ° C med 5% CO2 (Se protokoll 2).
      Merknad 1: Celler som reverseres apoptose gjenvinne normal morfologi og beholde fluoresceinmerket annexin V signal etter å gjenvinne normal morfologi (4A, og 4B).
      Merknad 2: The annexin V signal avtar med tiden på gjenvunnet celler (se diskusjon).
    6. Fiks celler ved valgte tidspunkter med 4% paraformaldehyd inneholdende 8% sucrose i 1 x PBS i 20 minutter i mørke ved romtemperatur og vasker de fikserte celler med PBS til 3 ganger for å fjerne paraformaldehyd før montering celler på objektglass med dekk antifade mountant (Se Materials) for confocal eller epi-fluorescens mikroskopi og observere annexin V på celler etter fjerning av apoptose indus.
      Merknad 1: Sukrose i fiksativ bevarer cellemembranen struktur under fiksering.
      Note 2: Oppbevar paraformaldehyd løsningen i mørket ved 4 ° C for å hindre nedbrytning.
      Note 3: Varm opp paraformaldehyde løsning til romtemperatur før du bruker den til celler for fiksering for å unngå kuldesjokk til cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å studere reversering av apoptose, blir vevkulturceller først utsatt for en død stimulans til å utløse apoptose. Når cellene viser kjennetegnene ved apoptose, er friskt kulturmedium og deretter påføres for å vaske bort stimulus, og deretter inkuberes de døende celler for å tillate utvinning (figur 1A). Her er det sentrale spørsmålet som hvor langt enkelte døende dyrkede celler kan utvikle seg mot apoptose og fortsatt gjennomgå Anastasis. Dette spørsmålet kan definitivt besvart av kontinuerlig overvåking med biomarkører for å spore mobil skjebner ved hjelp av metodene som er beskrevet nedenfor.

Vi først beskrive vår strategier for å detektere reversering av apoptose i vevkulturceller ved hjelp av tidsintervall levende celle mikroskopi, som er nødvendig for sporing og registrering av responsen av individuelle celler før, under og etter eksponering til en apoptotisk stimulus 12,13. Sunne heftende celler spredt på sin vedlagte substrat (Figur 1Bi) 12,13, og vises trådformede mitokondrier og runde kjerner før behandling (Tall 1Ci, Di, Ei, Fi, GI) 12,13. Etter eksponering for 3,8 til 4,5% etanol i cellekulturmedium (vol / vol), DIC eller fasekontrast-mikroskopi viste at cellene oppviste morfologiske kjennetegn på apoptose, inkludert cytoplasmisk kondensasjon, plasmamembranen blebbing, og cellekrymping (fig 1Bii, 1Cii- iii, og 1Eii-vi) 12,13. Apoptotisk kropps dannelse av de samme cellene ble lett observert av DIC (Figurene 1Eii-vi). Fragmentering av MitoTracker merkede mitokondriene (tall 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 samt kondensering av Hoechst-farget kjerne-DNA (Tall 1Dii-iii, Fii-iii, Gii) 12,13, og fragmentering av kjerner (Figtiltak 1Evi og FVI, hvite piler), ble oppdaget samtidig ved confocal eller epi-fluorescens mikroskopi. Cellene som vellykket reverseres apoptose ble senere observert å gjenvinne normal morfologi, tilsynelatende reparere sine skader (Tall 1Biii, C og Div-vi, E og FVII-xii, og GIII) 12,13. Celler under disse forholdene også hadde vist seg å gjenvinne organelle bevegelighet, celle migrasjon, og funksjonell endocytose basert på opptak av fluorescens-utslipp Quantum Dots og celledeling 13. Interessant nok, noen celler som aktet apoptose viste uregelmessig atom morfologi (fig 1Fxii), og også unormal celledeling og dannelse av mikrokjerner (Figurene 1Giv-vii) 13, som er en biomarkør for DNA-skade, kromosombrudd og hele kromosom tap i delende celler 39, 40. Fortrengt chromosomes eller kromosomfragmenter utenfor unngå å bli inkludert i datter cellekjerner er omsluttet av kjernemembranen 39, 40. Således, kunne en konsekvens av Anastasis være husing av genomer som ble skadet under aborterte apoptose, som fører til tumorgenese og progresjon av kreft. Tilstedeværelsen av mikrokjerner er også vanlig i kreftcellene 40,41.

Offentliggjøring av mitokondrie cytokrom c er et kritisk punkt for å mekle eller forsterke caspase avhengig apoptose 20-22. Ved hjelp av HeLa-celler som stabilt uttrykker GFP-merket cytokrom c, overvåket vi subcellulært flytting av cytokrom c under apoptose og Anastasis av konfokal mikroskopi. Som rapportert 23,24, cytokrom c -GFP lokalisert til mitokondriene før behandling (Tall 2Ai og B), men deretter ble sluppet ut i cytosol etter dødsfall stimulus hadde blitt brukt (Tall 2Aii,2Aiii og B). Andre karakteristiske morfologi som mitokondrie fragmentering og plasmamembran blebbing, ble også observert i celler som hadde utgitt cytokrom c -GFP (figur 2Aiii). Disse cellene ble rapportert å gjennomgå celledød kort tid etter utgivelsen av cytokrom c 23-27. Men etter fjerning av død stimulans, observerte vi at cytosolisk cytokrom c -GFP nivåene gikk ned, mitokondrier gjenvunnet trådformede strukturer, og plasmamembranen gjenvunnet en normal utseende (Tall 2Aiv-vii, og B). Derfor kan apoptotiske celler gjennomgå Anastasis etter mitokondrie frigjøring av cytokrom c.

Forsterkning av nedstrøms DEVD-spalte kaspaser er generelt antatt å være "point of no return" i apoptose 2,5. Derfor brukte vi en caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS expressed fra et plasmid 13, noe som gjør det mulig å detektere overlevende celler som tidligere har hatt kaspase-aktivitet (figur 3A). Denne caspase biosensor er et polypeptid med en N-terminal atomeksklusjons signal (NES), en linker med caspase-3/7 konsensus spaltingssete (DEVD) 26,42,43, etterfulgt av et gult, fluorescerende protein (YFP) og en C-terminale nukleære lokaliseringssignal (NLS). I friske celler, dette biosensor overveiende lokaliserer til cytosol som en funksjon av NES (figur 3BI, Ci-iv, og D) 13. Under apoptose, aktiverte kaspaser spalte DEVD motiv, slippe YFP-NLS, som effektivt translocates fra cytosol til kjernen i celler som samtidig, eller i ettertid, vise andre funksjoner i apoptose som DNA / kromatin kondens og celle krymping (Tall 3B ii -iv, og D) 13. Dermed blirSE celler beholde atomimportfunksjon følgende caspaseaktivering. Etter fjerning av apoptose induser, celler som gjennomgår Anastasis skjerm morfologisk utvinning selv etter caspaseaktivering har oppstått (Figurene 3Bv-x, og D) 13, tilsynelatende reversering sent stadium apoptose. Under gjenvinning av normal morfologi, atom YFP signalet avtar i intensitet i enkelte celler når de begynner å reversere apoptose etter fjerning av død stimulus (fig 3Bv-x, Cell 1) 13, noe som tyder på at celler degradere caspase-spaltet biosensor, eventuelt ved den samme mekanismen som brukes til å fjerne andre kaspase-spaltet produkt under og etter Anastasis.

Anastasis kan også oppdages uten levende celle mikroskopi. Dette kan oppnås ved hjelp av fluorescensmerkede annexin V 38,44, som binder og merkene ekstern fosfatidylserin (PS) på et tidlig trinn i apoptose ( (figur 4B) 13, som fosfatidylserin er begrenset til den indre paknings av plasmamembranen av friske celler 38. I motsetning til dette, etanolinduserte apoptotiske døende celler utsettes fosfatidylserin på celleoverflaten (figur 4B) 13, og derfor kan merkes med fluorescerende annexin V 38,44. Merkbart, kan Annexin V-merkede celler gjenvinne normal morfologi etter fjerning av død stimuli, noe som tyder på at primær kardiomyocytter har snudd apoptose (figur 4B) 13. Andre har tidligere søkt en lignende strategi som tyder på at utvinning fra apoptose kan skje in vivo. I en in vivo modell av transient iskemisk skade, caspase-avhengig annexin V merking av kardiomyocytter i kaniner og mus tilsynelatende gjenresulterte i internalisering av annexin V ved overlevende celler etter forbigående iskemi 45, noe som tyder på at Anastasis kunne oppstå i levende dyr. I tillegg er to andre studier brukt cellesortering for å identifisere en brøkdel av annexin V-merket muse BCL en .3B3 B lymfomceller (eksponert for anti-immunoglobulin-antistoff som induserer apoptose i BCL en .3B3) og musebrystkjertelkreft MOD-celler som uttrykker temperatur -sensitive p53 (som forårsaker apoptose etter inkubert under givende temperatur) fortsatte å spre seg etter at de ble returnert til normale kultur forhold 14,15. Sammen er disse studier antyder at annexin V er nyttig for å bestemme skjebnen til celler som har reversert apoptose uten levende celler mikros avbildning. Det er imidlertid begrensninger med denne strategien som annexin V fluorescens er ikke permanent (figur 4B) 13, gjenværende påvisbar etter bare noen få timer etter fjerning av død stimulus, slik atDisse fremgangsmåter kan ikke gi langvarig sporing av celler som reverserer apoptose.

Figur 1
Figur 1: Sporing reversering av apoptose av levende celle bildebehandling. (Gjengitt med tillatelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for figur 1A -. D og G). (A) Approach å indusere apoptose og deretter tillate dyrkede celler for å komme seg etter vask bort apoptose indus. (B) Time-lapse levende celle fase kontrast mikroskopi av sunne primære mus leverceller (ubehandlet), den samme gruppen av celler som ble behandlet med 4,5% etanol i kulturmedium (vol / vol) i 5 timer (behandlet), og deretter vasket og videre inkubert med friskt kulturmedium i 24 timer (vasket). Scale bar, 100 mikrometer. (C) Kontinuerlig time-lapse levende celle epi-fluorescens mikroskopi av den samme muse lever celle før Ethanol behandling (i), ved de angitte tidspunkter etter behandling med 4,5% etanol i cellekulturmediet i 2,5 timer (II og III), og etter vasking og inkubering med friskt medium for å tillate utvinning i 1 time (iv - vi). Sammenslåtte bilder av MitoTracker-farget mitokondrier (rød) og Hoechst-farget kjerne (blå) ble visualisert ved epi-fluorescens mikroskopi, og cellemorfologi av DIC mikroskopi. Skala bar, 10 mikrometer. (D) fusjonerte fluorescens bilder bare (uten DIC) fra panel C avsløre organelle morfologi. (E) Kontinuerlig time-lapse levende celle konfokal mikroskopi av de menneskelige småcellet lungekreft H446 celler før etanolbehandling (i) Etter behandling med 3,8% etanol i cellekulturmediet i 2 timer 28 min (ii-vi), og etter vasking og inkubering med friskt medium for å tillate gjenvinning av (VII-XII). Sammenslåtte bilder av MitoTracker-farget mitokondrier (rød) og Hoechst-farget kjerner (blå) ble visualisert ved konfokal mikroskopi, og c ell morfologi av DIC mikroskopi. Hvite piler indikerer en fragmentert kjernen i apoptotiske legemer (VI). Skala bar, 10 mikrometer. (F) Sammenslåtte fluorescens bilder bare (uten DIC) fra panelet E avsløre organelle morfologi. (G) Kontinuerlig time-lapse levende celle epi-fluorescens mikroskopi for monokrom Hoechst-farget atom avbildning av en enkelt HeLa celler som gjennomgår upresis celledeling. Før etanol behandling (i), behandling med 4,3% etanol i cellekulturmediet i 5 timer (ii), og etter fjerning av etanol (vasket, iii-vi). Paneler iv avslører unormal celledeling. Røde piler indikerer de store kjerner i de delte celler (IV-VI). Skala bar, 30 mikrometer. Tider er angitt som hr. Min Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gur 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figur 2: Påvisning reversering av apoptose etter mitokondriell frigjøring av cytokrom c (A) Kontinuerlig time-lapse levende celle konfokal mikroskopi av HeLa-celler som stabilt uttrykker cytokrom c -GFP (Cyto C -GFP) før (i), under (ii-iii) og etter (iii-viii) eksponering for 3,9% etanol i cellekulturmedium. Sammenslåtte konfokale bilder av CytoC-GFP (grønt), MitoTracker-farget mitokondrier (rød), og Hoechst-farget kjerner (blå) er kombinert med DIC bilder (venstre panel). Unmerged versjoner vises separat for CytoC-GFP, presentert som en varme kart over signalintensitet (venstre midtre panelet), monokrome bilde av CytoC-GFP (midten panel), og monokrome bilde av mitokondrier (høyre midtre panelet). Sammenslåtte bilder av CytoC-GFP og mitokondrier (høyre panel). (B) Endringen av cytosolisk cytokrom c-GFP signal intensitet av cellene, Cell 1 og celle 2, som indikert i den monokrome CytoC-GFP bilde på Panel Ai. Tider er angitt som hr. Min Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Oppdager reversering av apoptose etter caspaseaktivering (Gjengitt med tillatelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for figur 3A - D.). (A) Diagram av caspase biosensor fusjonsprotein sammensatt av en kjernefysisk eksport signal (NES), den DEVD caspase spaltingssete, gul fluorescerende protein (YFP), og det nukleære lokaliseringssignal (NLS). (B) Kontinuerlig time-lapse levende celle konfokal mikroskopi av HeLa-celler som uttrykker de kaspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS før (i), under (ii -iv) og etter (vx) eksponering for 4,3% etanol i cellekulturmedium. Sammenslåtte konfokale bilder av caspase biosensor (grønn), Hoechst-farget kjerner (blå) og DIC bilder (venstre panel), en monokrome bilder av YFP signal (midten panel), og en varme kart som angir YFP signalintensitet (høyre panel) . (C) Ubehandlede kontroller ble analysert som i panel B. (D) kvantifiserte fluorescensintensiteter for det aktiverte atom caspase biosensor i enkeltcellene (nummerert 1 og 2 i panelet Bi) før, under og etter eksponering av etanol, og i ubehandlede kontroller (nummerert 3 og 4 i panelet Ci) ble beregnet som prosent av YFP tilstede i kjernen (kjernefysisk / total celle YFP signalintensitet x 100%). Tider er angitt som hr: min. Skala bar, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ays "> Figur 4
Figur 4: Oppdager reversering av apoptose ved fluorescerende-merket annexin V (Gjengitt med tillatelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for 4A - B.). (A) Diagram av annexin V-FITC Anastasis assay brukes i panel B. (B) neonatal rotte primære hjerte ventrikulære myocytter ble utsatt for 4.5% etanol i cellekulturmediet i 5 timer, og deretter inkubert med annexin V-FITC i 10 min før fjerning av etanol-medium. Celler ble enten fiksert umiddelbart (behandlet), eller fast etter refeeding med friskt medium i ytterligere 2 timer utvinning (vasket). Ubehandlede celler som ble eksponert annexin V-FITC tjene som kontroll (Ubehandlet). MitoTracker-farget mitokondrier (rød), Hoechst-fargede kjerner (blå) og annexin V-FITC (grønt) ble visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi, og cellemorfologi ble visualisert ved DIC mikroskopi. Scale bar, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis refererer til fenomenet hvor celler som har aktivert celledød pathway senere reversere dødsprosessen og overleve. Her har vi vist at levende celle bildebehandling kan brukes til å bekrefte at de samme individuelle celler faktisk kan reversere apoptotisk celledød prosessen på et sent stadium, og deretter fortsette gjenlevende og reproduksjon. Våre protokoller beskriver flere optimaliserte celletypespesifikke behandlingsbetingelser for å indusere apoptose og lar en stor andel av cellene å gjennomgå reversering av apoptose overvåkes med flere biomarkører for verifisering. Når det gjelder tekniske problemer, ble glassbunn retter som brukes til å dyrke celler for avbildning 12,13, på grunn av den meget tynn gjennomsiktig glass mellom cellene og mikroskopobjektiv, som tillater lange arbeidsavstander for høykvalitets konfokal eller epi-fluorescens mikroskopi med høy forstørrelse, letter observasjon av klassisk apoptose inkludert mitokondrie fragmentering, Frigjøring av cytokrom c, og kjernefysisk kondens og fragmentering. Glass heller ikke forvrenge polariteten av lys, for å tillate høy kvalitet DIC mikroskopi for overvåking av membran blebbing, cellekrymping av celler, og apoptotisk kroppsdannelse under apoptose. DIC mikroskopi har fordeler fremfor fasekontrastmikroskopi for å observere disse morfologiske kjennetegn på apoptose, som DIC øker kontrasten av ufargede og gjennomsiktige celleprøver, bedre påvisning av celle morfologi. Hvis DIC og fasekontrastmikroskopi er ikke tilgjengelig, kan CellTracker brukes til å farge cytosol å skissere morfologi av levende celler for confocal eller epi-fluorescens mikroskopi og overvåke cellemorfologi.

Anvendelsen av passende doser av døds stimuli og strategier for fjerning av stimuli er kritiske trinn for påvisning av Anastasis. Vi har valgt å bruke lave konsentrasjoner av etanol som en død stimulans for eksperimenter descrIbed her fordi en stor prosent av behandlede celler kan jevnt gjennomgå apoptose og kan komme seg fra dette, potensielt mildere, død stimulans. Likevel kan disse metodene også brukes med hell med andre døds stimuli, som vi har rapportert 12,13. Men noen døds stimuli er iboende mer utfordrende enn andre, så som staurosporin (STS), en vanlig brukt apoptose-induserende middel. Kanskje fordi det binder sine substrater med høy affinitet 46-48, gjentatte vaskinger er nødvendig, men fremdeles kan ikke effektivt fjerne STS fra cellene. I dette tilfelle kan bruke lavere medikamentkonsentrasjoner og kortere medikament inkubasjonstid som fortsatt kan aktivere apoptotisk død prosessen være nyttig for å tillate flere celler for å reversere apoptose. Re-mating celler med kondisjonert cellekulturmedium kan også forbedre reversering av apoptose bedre enn den friske cellekulturmedium. Apoptotiske celler blir vanligvis løst festet til dyrkningsskålen overflate spesielt på glass surflater, derfor er det viktig å vaske bort indusere apoptose forsiktig for å unngå å løsne cellene. Belegging av glass retter med poly-D-lysin, kollagen og / eller fibronektin kunne øke celle tilslutning for å tillate visse typer av celler, slik som kardiomyocytter 37, for å feste skikkelig på glassoverflaten av cellekulturskåler, særlig etter eksponering av celler til en død stimulans.

Prosessen av apoptose, og sannsynligvis reversering av apoptose, avhenger enzymatiske aktiviteter som kan påvirkes av temperaturen. Derfor opprettholde cellene ved 37 ° C eller ved deres normale dyrkingsbetingelser er viktig over hele det levende bildeprosessen for å sikre reproduserbarhet av forsøksresultater. Pre-varm mikroskop før du starter levende celle bildebehandling er også et kritisk punkt som gjør at mikroskop komponenter for å nå termo likevekt. Dette kan unngå avdrift av fokus og forskyvning av xy-planet på grunn av termisk utvidelse og sammentrekning avkomponenter under levende celle bildebehandling. Legge til eller fjerne død stimulans ved å endre medium en kultur tallerken med enten en pipette eller ved perfusjon i forvarmet mikros systemet under time-lapse bildebehandling kan likevel føre til drift av fokus på grunn av endringer i temperatur eller volum av mediet. Z-stack anskaffelse kan bidra til å avbilde celler på riktig fokusplan, men vil øke risikoen for fototoksisitet på grunn av ytterligere eksponering av celler til fluorescerende lasere. Alternativt kan bruken av fokus drift kompensasjonssystemer, som for eksempel en infrarød laserbasert automatisk fokuskorrigeringssystem kan holde cellene på samme fokalplan intervall levende celle avbildning ved å opprettholde avstanden mellom cellene / glasset og uten ytterligere eksponering av cellene til kort bølgelengde, fototoksisk fluorescens.

Mitokondriell frigjøring av apoptogenic proteiner slik som cytokrom c, og aktivering av kaspaser effektor, for eksempel nedstrøms / virkningeller caspase-3 og caspase-7, er generelt ansett for å være den "point of no return" i apoptotisk celledød prosess 2,5,6. Western blot har vært brukt til å detektere spaltning (aktivering) av kaspase-3 og dets substrater slik som poly (ADP) -ribose polymerase-1 (PARP) og DFF45 / ICAD i hele cellepopulasjonen i løpet av apoptotisk induksjon og etter fjerning av apoptotisk stimuli, og avslørte at spaltede caspase-3, ICAD, og PARP viste i celler under eksponering til døden stimuli, men forsvant etter cellene ble gjeninnmat med friskt kulturmedium 13. Men disse fremgangsmåter viser den generelle tilstanden i cellepopulasjonen, men ikke skille mellom de individuelle celler som til slutt vil dø enn de som vil reversere apoptose og deretter overleve. Biokjemiske fraksjone å analysere utgivelsen av mitokondrie cytokrom c har lignende advarsler. Derfor, for å spore skjebnen til enkeltceller etter cytokrom c utgivelsen og caspase-acrings, to av de mest anerkjente kjennetegnene ved apoptose 2,5,6, GFP-merket cytokrom c (Cyto C -GFP) og en caspase biosensor, slik som den som brukes her NES-DEVD-YFP-NLS, kombinert med levende celle mikros omgå disse problemene ved å direkte observere morfologisk utvinning og translokasjon av den Cyto C -GFP biosensor i de samme cellene. Disse resultatene indikerer om den er reversibel apoptose etter mitokondrie cytokrom c utgivelsen og caspaseaktivering.

Den nåværende utfordring for å studere Anastasis er mangelen på merkingsteknikker for å påvise celler som har gjennomgått Anastasis ved ethvert punkt i hele sin levetid, in vivo eller in vitro. Stabil uttrykk for caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS tillater også påvisning av caspase aktivitet hvis kaspaser aktiveres igjen i fremtiden, men ikke permanent registrere caspase aktivitet som den aktiverte biosensor vil bli degradert uten Sustabestemt caspase aktivitet 13. Andre tidligere rapporterte caspase biosensorer, for eksempel gnage baserte SCAT biosensorer (f.eks ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 samt fluorescerende reportere Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 og CPV (f.eks CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, kan brukes til å detektere kaspase-aktivitet i hele dyr, og i dyrkede celler, men har tilsvarende begrensninger. På samme måte kan Cyto C -GFP ikke benyttes til å spore celler som reverserer apoptose i lang sikt, som det frigjøres fra mitokondrier i cytosol under apoptose og deretter nedbrutt. Annexin V merking har blitt brukt til å spore celler som reverserer apoptose, men signalintensiteten også avtar med tiden, og er ikke anvendelig for langtids sporing av Anastasis 13,45. Kontinuerlig langsiktig in vivo avbildning kan brukes til å spore skjebnen til de samme cellene etter eksponering av døds stimuli. Imidlertid er langsiktig in vivo avbildning fortsatt utfordrende to utføre i de fleste levende dyr. Derfor flere tilnærminger er nødvendig for å forlenge Anastasis forskning til hele dyrestudier, og for screening medikamenter som kan fremme eller hemme Anastasis hjelp vevkulturceller

I fremtiden er nyere protokoller og teknikker som sporer langsiktig celle skjebne som trengs for å utvikle og teste de fysiologiske, patologiske og terapeutiske implikasjoner av Anastasis. Vi foreslo at Anastasis kan være en generell celleoverlevelse mekanisme for å redde skadde celler som er vanskelige å skifte ut, slik som modne neuroner og hjerteceller 13. Men Anastasis av apoptotiske kreftceller etter kjemoterapeutiske behandlinger kan føre til utvinning av farlige celler som fører til tilbakefall av resistente svulster 12,13. Anastasis kan også være en viktig mekanisme for tumorigenesis, som noen celler vise onkogene forvandling etter at de snudde apoptose 13. Derfor styrke Anastasis kan bli en ny Theradet terapeutiske strategi for å inhibere neurodegenerasjon og hjertesvikt, med demping Anastasis som en ny måte for å forebygge eller behandle cancer. Utvikler biosensorer å spore reversering av apoptose i sykdomsmodellsystemer vil fremme forståelsen av celleoverlevelsesmekanismer Anastasis, og potensielle therapeutics til problematiske sykdommer ved å modulere Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Rev. Dr. Ralph Bohlmann og Rev. Dr. James Voelz for å foreslå ordet "Anastasis" for å beskrive reversering av apoptose; Douglas R. Green for HeLa celler stabilt uttrykker cytokrom c -GFP; Charles M. Rudin og Eric E. Gardner for H446 celler; Heather Lamb for å få hjelp i tegneserie tegning på video; Yee Hui Yeo for verdifull diskusjon om dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright stipend 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fellesskap (HLT), gir NIH NS037402 (JMH) og NS083373 (JMH) og Universitetet Grants Committee of Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow av Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

Cellular Biology Anastasis apoptose apoptotiske legemer caspase celledød celle krymping celle selvmord cytokrom c DNA skader genetiske forandringer mitokondrie yttermembran permeabilization (MOMP) programmert celledød reversering av apoptose
Strategier for sporing Anastasis, A Cell Survival fenomen som reverserer apoptose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick,… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter