Abstract
Anastasis ("hayata yükselen" Yunanca) ölen hücrelerin iyileşme anlamına gelir. Bu hücreler kurtarmak önce, mitokondriyal parçalanma, sitozolüne mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, nükleer parçalanma, plazma zar kabarmasını, hücre büzülmesi, hücre yüzeyi maruz kalma dahil olmak üzere apoptoz önemli kontrol noktaları aracılığıyla geçti fosfatidilserin ve apoptotik cisimlerin oluşumu. Apoptotik uyaranlara böylece ölen hücrelerin apoptoz ve potansiyel diğer ölüm mekanizmaları ters izin ölüm öncesinde kaldırıldığında Anastasis oluşabilir. Bu nedenle, inişi de uygunsuz hasarlı hücreleri sürdürmek olabilir fizyolojik iyileşme süreçleri dahil görünüyor. fonksiyonları ve inişi mekanizmaları görünüşte sağlıklı hücrelerin kurtarma sonra geçmiş olayları algılamak için sınırlı araçları tarafından kısmen engel, hala belirsiz. Stratejiler Anasta tespit etmek içinsis Anastasis modüle fizyolojik mekanizmaların çalışmalarını, hastalık patoloji ölümsüz hücre tehlikeleri ve potansiyel terapötik sağlayacaktır. Burada, canlı hücre mikroskopi ve memeli hücrelerinde Anastasis tespit ve takip etmek için, memeli bir kaspaz bio-sensor aracılığıyla etkili stratejiler açıklanmaktadır.
Introduction
Apoptoz ("ölüme düşen" Yunanca), genellikle hücre intihar 1-7 biten tek yönlü bir süreç olarak kabul edilir. Zaten apoptoz yolu 8,9 başlatmış bulunuyoruz hücreleri dahil aksi takdirde bütün hayvanlarda öleceğini ekstra hücrelerin, hayatta yanlısı ölüm genleri sonuçları Genetik bozulması. Benzer şekilde, genetik manipülasyonlar yapay görüntüler sinyalleri "Bana yemek" ya da hücre dışı matriks yapışma kaybetmek sağlıklı memeli hücreleri tam hücre fagositozu veya entosis, sırasıyla 10,11 ölümü kaçmasına izin. Ancak bizler ve başkaları da apoptoz 12-15 erken aşamalarında kurtulabilir Genetik manipülasyon, normal, sağlıklı, memeli hücreleri ve hücre çizgileri olmadan göstermiştir. Hücreler tipik önemli kontrol noktaları geçtikten sonra tek tek hücrelerin izlemek için araçlar kullanarak, daha fazla, apoptoz 12,13 geç aşamalarında kurtarma göstermiştirly 2-6 "dönüşü olmayan noktaya" işaretleyin. Geç evre apoptoz Bu kontrol noktaları mitokondriyal sitokrom c salınımını, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin oluşumunu içerir. Biz hücre ölümü 2-6 eşiğinde apoptoz bu ters tanımlamak için, "hayata yükselen" anlamına gelen Yunanca bir bileşik sözcük "inişi", kabul.
Tüm ölüyor-kurtarma işlemi canlı hücre görüntüleme tarafından gözlemlenen sürece, bu apopitozisin yaşamamış hücrelerden Anastasis geçiren hücreleri ayırt etmek zordur. Iş Yılların apoptoz hücre intihar morfolojik özellikleri evrimsel olarak korunmuş biyokimyasal ve moleküler olayların 16-19 tarafından tahrik olduğunu ortaya koymuştur. Bu olaylar hasarlı veya d ortadan kaldırarak ile tek hücreli ve çok hücreli organizmalarda gelişimsel ve homoeostatic süreçleri düzenleyen hücrelerin kendini imha teşvikangerous hücreler 16-19. Apoptotik hücreler hali hazırda apoptoz 1,5,6,16,20 standart, morfolojik, biyokimyasal ve moleküler belirtileri ile ayırt edilebilir olsa da, şu anda inişi 12,13 özgü bilinen bir işaretleyici yoktur. Önemlisi, Anastasis geçirmiş hücreler normal sağlıklı hücreler, sadece apoptoz ters başlayın hücreleri görünür olarak apoptotik hücreler ölüyor 12,13 olduğu görülmektedir. Böylece, yeni araçlar belirli bir hayatta hücre önce aktif apoptotik süreçleri yaşamış kesinlikle sonuçlandırmak için gerekli.
Bu hızlı ve kitlesel imha süreci olduğundan Apoptoz genellikle geri dönüşümsüz kaskad olarak kabul edilir. Mitokondri gibi sitozolüne 21,22 içine sitokrom-c gibi apoptogenic faktörler yayımlandı kez bazı hücreler, apoptoz başlatmak için bu güne dakika sürebilir iken, kaspazlar, 5 dakika içinde aktif 23,24 sitoplazmik tarafından takip edilebilir veNükleer 10 dakika 25-27 içinde yoğuşma ve hücre ölümü kısa bir süre sonra 25-27. Aktif kaspazlar yarılması ve endonukleaz inhibitörü DFF45 / ICAD 29,30 olarak hücresel yıkım 2,28, amacıyla önemli yapısal ve işlevsel bileşenleri inaktive ederek apoptozu düzenlemişlerdir. Kaspazlar ayrıca 31,32 c sitokrom mitokondriyal serbest teşvik etmek mitokondri translocates BCL-2 aile üyesi BID, pro-apoptotik faktörler, etkinleştirin. Kaspaz aktivitesi fagositoz 33 ile makrofajlar veya komşu hücreleri hücreleri ölüyor yutulmasına teşvik etmek için bir "beni ye" sinyali olarak fosfatidilserin hücre yüzey maruz sonuçlanır. Ayrıca, apoptotik olaylar hücresel biyoenerjitiklerinin ve metabolizma 34,35,36 bozarak işlevsiz mitokondri, hale. Dolayısıyla, bu tür imha kurtarma sezgisel olası görünüyor.
Orijinal aksine bekliyoruzations, hücreler bile geç bir aşamada apoptotik hücre ölümü sürecini tersine çevirebilirsiniz. Sürekli kültür içinde ölen hücrelerden kaderi izleyerek, primer hücreler ve hücre çizgileri 12,13 bir dizi son evre apoptoz geri döndürülme oranı gözlendi. Ölüm uyaran kaldırılması gibi mitokondriyal parçalanma, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, plazma zar kabarmasını, fosfatidilserin hücre yüzey maruz, mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma, hücre büzülmesi gibi apoptoz açık özelliklerinden, kurtarma izin apoptotik cisimlerin ve oluşumu. Bu gözlemler inişi fonksiyonları, sonuçları ve mekanizmaları ile ilgili cevapsız soruları gündeme. Bu sorulara yanıt için, bir ön güvenilir Anastasis geçiren hücreleri tespit etmektir. Burada, biz canlı mikroskopi yöntemleri ve daha önce geç evre apoptoz ve th tersine çevirdi hücreleri tespit için bir kaspaz biyosensör tariftr kurtuldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Canlı Hücre Görüntüleme için Hücreleri 1. Hazırlık
- Morfolojik değişikliklerin saptanmasını kolaylaştırmak için, örneğin HeLa (insan servikal karsinom), daha iyi bir plazma zarı ve hücre içi organellerin değişiklik görselleştirmek için alt-tabaka ile düz olan hücreleri gibi yapışkan hücreleri seçin.
Not: apoptoz Ters primer fare karaciğer hücreleri, primer fare makrofaj primer Sıçan kardiyomiyositlerinde de dahil olmak üzere, çeşitli memeli hücreleri 12,13, gözlenen ve ayrıca, insan embriyonik böbrek HEK-293T hücreleri, Afrika yeşil maymunu böbrek epitelyal COS gibi hücre hatlarına olan -7 hücreleri, fare kalp kası HL-1 hücreleri, fare NIH 3T3 fibroblastlar, gelincik beyin CRL1656 hücreleri, insan deri kanseri A375 hücrelerini, insan testis kanseri CRL1973 hücreleri, insan küçük hücre akciğer karsinoması H446 hücreleri, insan karaciğer kanseri (Mustela -furo putoris) HepG2 hücreleri, insan göğüs kanseri, MCF7 hücreleri, insan prostat kanseri PC3 hücreleri ve insan nöroblastom SH-SY5Y hücreleri. - Temizlik ve sterilizasyon için mutlak etanol ile cam alt hücre kültürü yemekleri Ön yıkama cam lamelleri.
Not 1: cam alt yemekleri kullanımı yüksek kaliteli diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ve yüksek büyütme konfokal veya epi-floresan mikroskobu (Tartışma bakınız) için tavsiye edilir.
Not 2: yüksek büyütme (40X, 60 / 63X veya 100X hedefleri ve yüksek sayısal delikler 1.3 veya 1.4) için, ince cam alt (kalınlık 0,085-,16 mm) hücre kültürü yemekleri kullanılması görüntüleme mesafeleri daha uzun çalışma sağlar (Protokol 3 Bkz ). - Hücre tipine bağlı olarak, cam alt kültür tabakları, poli-D-lisin (0.1 mg / ml), kolajen (0.01 M asetik asit içinde% 0.01 çözelti) ve / veya fibronektin (5 ug / ml) önceden tohumlanma ile kaplama gerektirebilir Hücreler.
Not: Çeşidi ve kaplama maddesinin konsantrasyonu optimizasyonu farklı hücre hatları için gereklidir. HeLa hücreleri kaplama olmadan doğrudan camın üzerine yapışabilir. Bununla birlikte, bazı hücreler, such fare kalp kası HL-1 hücreleri gibi, cam yüzeylere doğrudan bağlı, ancak belirli bir kültür ve kaplama protokolleri 37 gerektirir olamaz. - Tohum ~ 35 mm önceden kaplanmış cam alt hücre kültür tabaklarında 2-3 x 10 5 hücre ve% 80 ortak akışkanlığa elde etmek için bir gün boyunca% 5 CO2 ile (° C) 37 derece Celsius'ta inkübe edilir.
Not 1: hücre yoğunluğu, kuluçka süresi, kültür durumun Optimal koşullar hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Hücre birleşmesi hücreleri (Protokol 2 bakınız) apoptotik yanıtı etkileyebilir. Yüksek Akışların birleştiği yerde hücreler, hücreler, apoptotik uyarıcının aynı konsantrasyonlarda daha az duyarlı olabilir.
Yüksek hücre yoğunluğu, bireysel hücrelerin ve organellerin morfolojik değişiklikler belirsiz gibi, birleşik hücreler üzerinde kaçının: Not 2.
2. Uygulama ve Apopitotik Hücre Uyaranlara çıkarılması
- Kullanımdan hemen önce, 37 ° C hücre kültürü ortamı ile apoptosis teşvik edici ajan, önceden karıştırın. Etanol (3,6-4,5% Hac / hac), mevcut gösteri apoptoz indükleyici olarak görev yaptı.
Not 1: yayınlanmış ve yayınlanmamış veri hücreleri, aynı zamanda, örneğin dimetil sülfoksit (DMSO, 24 saat süre ile% 8 hacim / hacim), staurosporin (STS, 0.5 uM olduğu gibi, diğer apoptotik uyarıcılar 12,13 tarafından tetiklenen apoptozu ters olduğunu göstermektedir 1 saat) ve taksol (12 saat boyunca 1 uM). Tetikleme apoptosis için dozunun optimizasyonu, apoptosise maruz popülasyonda hücrelerin çoğunluğu tetikleyebilir en düşük doz elde etmek için farklı hücre çeşitleri için gereklidir.
Not 2: hücre kültür ortamı ile apoptosis teşvik edici maddeler Ön karıştırma uyaranlara apoptotik hücrelerin düzensiz maruz kalmasını önlemek için önemlidir. - Resim temel morfolojileri kurmak için apoptosis teşvik edici ajan uygulanmadan önce, hücre kültürü çanağı içinde sağlık hücreleri grubu.
- Hücre kültürü kabı orijinal orta çıkarın ve çanak ile önceden karıştırılmış apoptosis teşvik edici madde 2 ml uygulamakapoptosise maruz hücrelerin tetikler. % 5 CO2 (ya da diğer normal kültür koşulları) ile 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- Inkübasyondan sonra, apoptotik özelliklere ilerlemesini izlemek için ışık, epi-floresan veya konfokal mikroskobu ile hücrelerin dikkate alınmalıdır.
Not 1: apoptoza hücreler mikroskop ve floresans bazlı biyosensör ile tespit edilebilir apoptozun morfolojik, biyokimyasal ve moleküler ayırt edici görüntüler (bkz Protokoller 3 ve 4).
Not 2: farklı apoptosis teşvik ediciler hücrelerin İnkübasyon süresi, hücre tipi (örneğin, konfluansa ve besin durum gibi) hücre koşulları ve uygulanan ölüm uyarıcı dozuna bağlı olarak farklılaşacaktır. Dikkatli titrasyon gerekebilir. - Hücreler apoptoz ayırt edici görüntüler zaman, sıcak (37 ° C, ya da diğer normal kültür sıcaklığı), taze hücre kültürü ortamı ile bir kez hücreler yıkanarak apoptosis teşvik edici ajan çıkarın.
Not 1: apoptotik hücreler daha gevşek takılı olduğundankültürü plakası, tatbik edilmesi ve bu hücreler yıkanır olmayacak şekilde dikkatli orta kaldırmak için önemlidir.
Not 2: Canlı süspansiyon hücreler yavaşça santrifüj (160 x g 1 dakika) ile yüzer kısımdan geri kazanılmasını ve kültür kaplarına eklenebilir. - 2 ml /% 5 CO2 taze hücre kültür ortamı içinde 35 mm çanak ile 37 ° C'de inkübe hücreleri. Seçenek olarak ise, kullanım koşullu ortam (sağlıklı hücrelerinden toplanan hücre içermeyen kültür ortamı), ayrıca, apoptotik hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için.
Not: Yıkama ve taze ortam ile inkübe edilmesi, hücrelerin büyük çoğunluğunun etanol maruz 12,13 sonra etanol-kaynaklı apoptosisi tersine izin verir. Bununla birlikte, hücreler, diğer apoptotic uyaranlara maruz kaldıkları zaman, bu yıkama aşaması gerekli olabilir tekrar (tartışmaya bakınız).
3. Canlı Hücre Mikroskopi
- Biz, çevre kontrolü ile ters konfokal veya epi-floresan mikroskop (37 ° C kullanmanızı öneririzCanlı hücreler mikroskopi için% 5 CO 2).
Not: Aynı zamanda bir su daldırma hedefi ile dik mikroskoplar kullanılarak hücrelerin görüntüye mümkündür. Görüntü hücrelere kültür ortamına doğrudan objektif batırın. Ancak, hücre odaklama sırasında daldırma hedefi ile ezilebilir. - Ön-sıcak (örneğin çevre kontrol odasına, sahne kuvöz ve objektif ısıtıcı gibi) mikroskop görüntüleme önce en az 2 saat.
Not: Bu odak ve xy düzleminin vardiya sapmasını önlemek, böylece mikroskop bileşenleri nedeniyle bileşenlerin ısıl genleşme ve daralma, termo-dengeye ulaşmasını sağlar. - Kültür hücrelerinin bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin ters bir mikroskop sahnede (Protokol 1 bakınız) ve hücreleri görüntüleme için bir sayısal açıklık (NA) 1.3 veya 1.4 ile 40X veya 63X plan Apochromat objektif kullanılarak hücre görüntüleri yakalayabilir Cam lamelleri ile çanak alt.
Not: orta 2 yılı ml uygulamaktan kaçınınorta ağırlığı aynı odak düzlemi görüntü zor hücrelerin bir alan yapım, cam alt eğrilik neden olabilir gibi 35 mm cam alt çanak için. - Tüm görüntüleme işlemi sırasında 37 ° C veya ilgili normal sıcaklıkta hücreleri koruyun.
Not: apoptoz bir işlem, ve apoptozun muhtemelen ters, sıcaklığa duyarlı olan enzimatik aktivitelerin bağlıdır. Bu nedenle, (a mikroskop aşamasında üst kuluçka örn), 37 ° C'de hücreler muhafaza deney boyunca önemlidir. Azalmış sıcaklık apoptotik yanıtı ve apoptotik uyaran çıkarıldıktan sonra kurtarma yanıtı yavaşlatabilir. - Orta buharlaşma yoluyla su kaybını azaltmak için kültür çanak şeffaf folyo (Bkz Malzemeleri) bir nem cihazı kullanın veya yatıyordu.
Not: folyo DIC mikroskopi için ışık kutuplarını bozabilir. Işık yolda polarize ayarlayarak polarite geri yükleyin. - PH muhafazaMikroskop bir çevresel kontrol gözü ile% 5 CO2 içinde inkübe edilerek, hücre kültür ortamı (pH 6.8 -7.3).
Not: kültür ortamı içinde, pH, aynı zamanda, HEPES tamponu ilave edilerek sağlanabilir bakım ya da ticari CO2-bağımsız ortamı kullanılarak (Malzeme bakınız). Optimal koşullar hücre tipine bağlı olarak değişebilir. - Hücre / hücre içi yapılar veya ifade biyosensörler (Protokolü 4 Ayrıntılar) yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gerekli en düşük floresan yoğunluğu azaltarak fototoksisite önlemek için görüntüleme işlemi sırasında hücrelere floresan / lazer (uyarma ışık yoğunluğu) maruziyetini en aza indirin.
Sırasında ve Apoptotik sonrası olaylar Algılama ve Takip inişi için 4. Stratejileri
- Plazma membran blebbing, sitoplazmik yoğunlaşma, hücre çekme ve apoptotik vücut oluşumu (Şekil 1A izle - C, E).
- Time-lapse canlı hücre farklılık sorumluluk yönün gerçekleştirinrential girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast mikroskopisi sağlık hücrelerinin bir grup izlemek için ve hücre morfolojisi (canlı hücre mikroskopi Protokolü 3 Bkz ve Tartışma bakınız) gözlemlemek.
Not 1: hücrelerine fototoksisite önlemek için DIC / faz sözleşme görüntüleme için ışık kaynağının yoğunluğunu azaltın.
Not 2: DIC ve faz kontrast mikroskobu mevcut değilse, konfokal veya epi-floresan mikroskopi canlı hücrelerin morfolojisi anahat ve hücre morfolojisi izlemek için sitoplazmada leke CellTracker kullanın. - (Uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetiklemek için hücre ölümü uyarıcı uygulanır.
- Plazma zar kabanr, sitoplazma yoğunlaştırma, hücre büzülmesi ve apoptotik vücut formasyonu (Şekil 1A, 1B, 1C, 1 E) olarak apoptosisin morfolojik özellikleri için işlenmiş hücreleri dikkate alınmalıdır.
- Taze orta hücreleri ile ölüm uyaranlara ve yeniden tedarik hücreleri yıkayacak displaapoptozun y morfolojik özellikleridir.
Not 1: Hücre ölümü uyaran uygulama veya bir perfüzyon hücre kültür odası kullanılarak elde edilebilir hızlandırılmış canlı hücre görüntüleme sırasında mikroskop sahnede hücre kültür ortamı değiştirmek ya da dikkatli bir şekilde dokunmadan pipetleme hücre kültürü tabağına doğrudan yapılabilir görüntüleme arasında aralıklarla sırasında çanak.
Not 2: kullan odak sapma telafisi sistemleri, hücre kültür ortamı (Tartışma bakınız) değiştirdikten sonra mikroskop sisteminin termo-denge kaybı nedeniyle hücrelerin odak dışına önlemek için. - Sürekli time-lapse görüntüleme apoptoz işaretlerinden görüntüler hücrelerin kaderini izlemek için. Apoptoz ters Hücreler hasarı onarmak ve normal düz morfolojisi (Şekil 1A, 1B, 1C, 1E) yeniden alabilirsiniz.
- Time-lapse canlı hücre farklılık sorumluluk yönün gerçekleştirinrential girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast mikroskopisi sağlık hücrelerinin bir grup izlemek için ve hücre morfolojisi (canlı hücre mikroskopi Protokolü 3 Bkz ve Tartışma bakınız) gözlemlemek.
- Mitokondriyal parçalanma, DNA / kromatin yoğunlaşması ve nükleer parçalanma (Şekil 1D, 1. Kat, 1G bakınız).
- Mitochond görselleştirmek içinRia, 50 nM MitoTracker kırmızı / koyu kırmızı / yeşil floresan boya ile boyama hücreleri ve aynı zamanda,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 20 dakika süre ile kültür ortamı içinde Hoechst 33342 nükleer mavi boya, 10 ug / ml çekirdeği leke.
Not 1: sitotoksiteyi önlemek ve zaman ihtiyaç arka plan floresan azaltmak için boyaların ve inkübasyon süresi konsantrasyonu azaltın. Boyama için boya ve inkübasyon süresi az miktarda gürültü oranı için iyi bir sinyal elde etmek için boyama koşulları optimize.
Not 2: Bu tür apoptozis sırasında mitokondri dışarı sızmaz MitoTracker Kırmızı CMXRos, MitoTracker Derin Kırmızı FM, ya MitoTracker Yeşil FM, gibi mitokondri için floresan lekeleri kullanın. Bu apoptoz ve inişi sırasında mitokondrial morfolojisi görselleştirme sağlar. Bu lekeler hakkında ayrıntılı bilgi için malzeme ve ekipman tabloya bakın. - Photobleaching önlemek için karanlıkta lekeli hücrelerin tutun.
- Hücreleri yıkayarak aşırı leke çıkarmakDaha sonra 1 dakika, her bir yıkama arasında yeni bir ortam içinde inkübasyon ile 37 ° C fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi ya da taze hücre kültürü ortamı ile 3 kez daha fazla izin vermek için son yıkama önce 20 dakika boyunca, taze ortam içinde inkübe lekeler görüntüleme için non-spesifik sinyal arka plan azaltmak için hücrelerin çıkmak için.
Not: boyama görüntüleme için yüksek arka planda neden olabilir sonra hücre ortamı ile inkübasyon sürelerini kısaltın. - Apoptotik indüksiyon uygulanmadan önce görüntü sağlıklı hücrelere gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskopi gerçekleştirin (canlı hücre mikroskopi Protokolü 3 bakınız).
Not: Sağlıklı hücreler çoğu hücre tiplerinde (Şekil 1D, 1F, 1G) tübüler mitokondri ve yuvarlak çekirdekleri görüntüler. - (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler.
- Mitokondriyal ve nükleer morfolojisi değişiklikleri gözlemlemek için canlı hücre mikroskopi zaman atlamalı devamölüm uyarıcı hücrelere uygulanır hemen sonra ies. Tübüler mitokondri ve yuvarlak çekirdekleri görüntüleyen sağlıklı hücrelerden farklı olarak, bu tür mitokondriyal parçalanma ve şişlik, kromatin yoğunlaşması ve nükleer parçalanma gibi apoptoz işaretlerinden görüntülemek için hücreleri gözlemleyin.
- Hücreler apoptoz işaretlerinden görüntüler zaman, yıkama ve taze ortam ile hücrelerin tedarik ve hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam ediyor. Apoptoz ters hücreler normal mitokondriyal ve nükleer morfolojisi (Şekil 1D, 1F, 1G) yeniden.
Not: hücreler (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız) aynı grupta hücre morfolojisi değişiklikleri gözlemleyerek apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi almak için mümkün olduğunda paralel olarak DIC mikroskopi gerçekleştirin.
- Mitochond görselleştirmek içinRia, 50 nM MitoTracker kırmızı / koyu kırmızı / yeşil floresan boya ile boyama hücreleri ve aynı zamanda,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 20 dakika süre ile kültür ortamı içinde Hoechst 33342 nükleer mavi boya, 10 ug / ml çekirdeği leke.
- Stabil bir sitokrom-c GFP füzyon pr ifade hücreleri kullanarak c sitokrom mitokondriyal sürümü Algılamaotein (Bakınız Şekil 2).
- Stabil MitoTracker Kırmızı ile GFP 23,24 c sitokrom ifade Leke hücreleri polarize hücre mitokondri (canlı hücre mitokondri boyama 4.2.3 için Adımları 4.2.1 bakınız) etiketlemek için.
- Sağlıklı hücreler (canlı hücre görüntüleme için Protokolü 3 Ayrıntılar) izlemek için gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskobu gerçekleştirin.
Not: sitokrom-c GFP sinyali öncelikle sağlıklı hücreler (Şekil 2A i 2B) mitokondride lokalize. - (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler. Sitoplazmada mitokondri sitokrom c GFP translokasyonuna gözlemlemek için zaman atlamalı mikroskopi Devam (Şekil 2Aii-iii, 2B).
Not: sitozolüne sitokrom c Mitokondriyal sürümü mitokondrial dış membran permeabilization bir belirtecidir (MOMP)4, mitokondri-bağımlı apoptoz 21,22 kritik bir adım - Hücreler sitoplazmada sitokrom-c GFP sinyalini görüntüler, hücre ölümü uyaran kaldırmak ve tedarik hücreleri taze ortam ile (Protokol 2 bakınız). Sitozolik GFP ile hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam edin.
Not: Normal hücre morfolojisi yeniden apoptoz ters Hücreler ve mitokondri geri muhtemelen bozulması veya translokasyon yoluyla sitozolik sitokrom-c GFP sinyali azaltmak (Şekil 2Aiv-vii, 2B). - Tek hücre veya hücre grubunun (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız) hücre morfolojisi değişiklikleri gözlemleyerek apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi almak için paralel DIC görüntüleri yakalayın.
- Bir kaspaz bio-sensor aracılığıyla kaspaz etkinliğinin tespiti (Şekil 3 e bakınız)
- Için kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS ile Transfect hücreleri16 apoptotik uyaran 13 onlara tabi önce saat 24.
- (Canlı hücre nükleer boyanma için Adımları 4.2.3 için 4.2.1 bakınız) hücre çekirdekleri etiket Hoechst 33.342 ile transfekte kültürleri Leke.
- Sağlıklı hücreler (canlı hücre görüntüleme için Protokolü 3 Ayrıntılar) izlemek için gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskobu gerçekleştirin.
Not: NES-DEVD-YFP NLS biyosensör sinyali esas olarak nükleer ihracat sinyali (NES) (Şekil 3A, 3Bi ve 3C, Tartışma) bağlı sağlıklı hücrelerin sitosolünde lokalize eder. - (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler. YFP nükleer translokasyonu gözlemlemek için zaman atlamalı mikroskopi devam edin.
Not: kaspazlar yararak aktivasyonu çekirdeği sitoselden YFP-NLS translokasyon sonucu kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS DEVD motifi, (Şekil 3A, 3Bii-iv, Tartışma bakınız).
Apoptoz, normal hücre morfolojisi yeniden ters hücreler, ancak, nükleer YFP sinyali (Şekil 3Bv-x Hücreler 1, 2 ve 3 boyutlu) korumak: edin. - Nükleer YFP görüntüler hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam edin.
Not: Nükleer YFP sinyal hücreleri apoptoz ters sonra (Şekil 3B vi-x, Hücre 1, Sonuçları ve Tartışma bakınız) bozulmuş birkaç saat olmak muhtemelen böyle bir proteazom bozulması gibi normal hücre temizlenme mekanizmaları yoluyla olacaktır. - Hücre tek hücreler morfolojik veya hücre grubunda değişiklik gözlenmesi ile apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi elde paralel içindeki DIC görüntü yakalama. (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız).
- Gl Tohum hücrelerieşek% 80 hücre confluency (Protokol 1 bakınız) ulaşmak için lamelleri.
- (Canlı hücre mitokondrial ve nükleer boyanma için Adımları 4.2.3 için 4.2.1 bakınız) sırasıyla mitokondri ve çekirdekler için kırmızı floresan Mitotracker ve mavi Hoechst 33.342 leke hücreleri Eş-leke.
- Bir apoptoz indükleyici ile apoptosise maruz hücrelerin tetikler (Protokol 2).
- Apoptotik hücre yüzeyi üzerinde fosfatidilserin maruz kalmasını saptamak için apoptoz indükleyici ortamdan uzaklaştırılmasından önce, 37 ° C 'de apoptotik hücreler 10 dakika leke floresan etiketli anneksin V (Malzeme) uygulanır.
Not 1: fosfatidilserin normalde hücre plazma zarı 38 iç-broşür tecrit çünkü Sağlıklı hücreler anneksin V ile boyandı değildir. Apoptotik hücreler, hücre yüzeyi (Şekil 4A ve 4B), fosfatidilserin bağlanan anneksin V ile boyanır.
Not 2: Floresan etiketli anneksin V, apoptotik hücre imm leke uygulanabilirediately 10 dakika inkübasyon ile apoptoz indükleyici çıkarılmasından sonra. - Hücre ölümü uyaran çıkarın kez sıcak PBS ya da taze ortam ile boyalı hücrelerin yıkayın ve daha sonra% 5 CO2 (Protokol 2'ye bakınız) ile, 37 ° C'de 2 saat süreyle taze ortam ile hücrelerin kaynağı.
Not 1: apoptoz normal morfoloji yeniden normal morfoloji kazanmak sonra floresan etiketli anneksin-V sinyali muhafaza ters hücreler (Şekil 4A ve 4B).
Not 2: anneksin V sinyal elde edilen hücreler (Tartışma bakınız) zamanla azalır. - Oda sıcaklığında, karanlıkta, 20 dakika için 1 x PBS içinde% 8 sükroz içeren% 4 paraformaldehit ile seçilen zaman noktalarında hücreler saptamak, ve cam lameller üzerine hücreler monte etmeden önce paraformaldehid kalmaması için 3 kez PBS ile sabitleştirilmiş hücreler yıkama antifade mountant ile lamelleri konfokal veya epi-floresan mikroskopi için (Malzemeler bakınız) ve apoptoz indüserinin çıkarıldıktan sonra hücreler üzerinde anneksin V gözlemlemek.
Not 1: sabitleştirici sukroz tespit sırasında hücre zarı yapısını korur.
Not 2: bozulmasını önlemek için, 4 ° C'de karanlıkta paraformaldehit çözeltisi saklayın.
Not 3: hücrelerine soğuk çarpmasını önlemek için sabitleme için hücrelere uygulamadan önce oda sıcaklığına paraformaldehid çözüm ısıtın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Apoptoz ters çalışma yapmak için, doku kültürü hücreleri ilk apoptoz tetiklemek için bir ölüm uyarıcıya maruz kalmaktadır. Hücreler apoptoz işaretlerinden gösterilecek zaman taze kültür ortamı daha sonra uyaran yıkayacak ve ardından kurtarma (Şekil 1A) izin ölüyor hücreleri inkübe uygulanır. Burada, ele alınan temel soru, bireysel ölüyor kültür hücreleri apoptoz doğru ilerleme ve hala Anastasis tabi ne kadar olduğunu. Bu soru kesinlikle aşağıda açıklanan yöntemler kullanılarak hücre kaderi izlemek için biyomarkerler ile sürekli izleme ile yanıtlanabilir.
İlk sırasında izleme için gerekli olan zaman atlamalı canlı hücre mikroskopisi kullanılarak ve daha önce tek tek hücrelerin en yüksek tepki kaydedildikten ile doku kültür hücrelerinde apoptosis terslenmesini tespit etmek için Stratejilerimizi tarif eder ve bir apoptotik uyaran 12,13 maruz kaldıktan sonra. Bunlara bağlı alt-tabaka üzerine yayılır Sağlıklı yapışan hücreler (Şekil 1Bi) 12,13 ve ipliksi mitokondri ve tedavi öncesi yuvarlak çekirdekleri görüntülenen (Şekil 1CI, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Hücre kültürü ortamı (hacim / hacim) içinde 3.8-4.5 etanol% maruz kaldıktan sonra, PIC ya da faz kontrast mikroskopisi hücre sitoplazmik yoğunlaştırma, plazma zar kabarmasını ve hücre büzülmesi (Şekil 1Bii, 1Cii- içeren apoptosisin morfolojik işaretlerinden, gösterdiğini ortaya koymuştur III ve 1Eii-vi) 12,13. Aynı hücreler tarafından Apopitotik vücut oluşumu kolaylıkla DIC tarafından gözlenmiştir (1Eii-vi Şekil). MitoTracker etiketli mitokondri parçalanması 12,13 yanı sıra, Hoechst-lekeli nükleer DNA yoğunlaştırılmasını (Şekil 1Dii-iii FII-III, GII) 12,13 ve çekirdeklerin parçalanması (1Dii-III, 1Fii-vi Şekil) (İncirnımların 1Evi ve FVI, beyaz oklar) konfokal veya epi-floresan mikroskobu ile eş zamanlı olarak tespit edilmiştir. başarılı bir şekilde apoptosisi tersine hücreler daha sonra görünüşte hasarı onarmak, normal morfoloji yeniden elde etmek için gözlenmiştir (Şekil 1Biii, C ve Div-vi, E ve FVII-XII ve gIII) 12,13. Bu koşullar altında, hücreler, flüoresan yayan Kuantum noktalar ve hücre bölünmesi 13 alımından göre organel motilite, hücre göçü ve fonksiyonel endositoz yeniden elde etmek için ortaya çıkmıştır. İlginç bir şekilde, saygı apoptoz düzensiz nüklear morfoloji (Şekil 1Fxii) ve aynı zamanda anormal hücre bölünmesini ve mikroçekirdek oluşumunu gösterilen bazı hücreler 13, bölünen hücrelerde DNA hasarına, Kromozom kırılması ve bütün kromozom kaybı biyomarkerdir (1Giv-vii Şekil) 39, 40. Yerinden chromosomes veya kromozom parçaları dışında çekirdek zarı 39, 40 çevrelediği kızı hücre çekirdeğinde dahil edilecek başarısız. Bu nedenle, inişi bir sonucu gelişiminden ve kanser gelişimi yol durdurulmuş apoptoz sırasında hasar gören genomlarının Barınma olabilir. mikroçekirdek mevcudiyeti, kanser hücrelerinin 40,41 yaygındır.
Mitokondriyal sitokrom c salınımı aracılık veya kaspaz-bağımlı apoptoz 20-22 yükseltmek için kritik bir adımdır. Stabil GFP-etiketli sitokrom c ifade HeLa hücreleri kullanarak, konfokal mikroskopi ile apoptosis ve inişi sırasında sitokrom c hücre içi taşınma izlenir. Bir ölüm uyaran 2Aii (Şekiller uygulandıktan sonra rapor 23,24 olarak daha sonra (Şekil 2Ai ve B) tedaviden önce mitokondri lokalize, ancak sitokrom-c GFP, sitozolüne serbest bırakıldı2Aiii ve B). Gibi mitokondriyal parçalanma ve plazma zar kabarmasını gibi diğer karakteristik morfolojileri, sitokrom c GFP (Şekil 2Aiii) serbest olan hücrelerde gözlendi. Bu hücreler, sitokrom c 23-27 arasında serbest bırakıldıktan sonra kısa bir süre hücre ölümü bildirilmiştir. Ancak, ölüm uyarıcı çıkarılmasından sonra biz sitosolik sitokrom C GFP düzeyleri mitokondri filamentli yapılar çıktı ve plazma zar normal bir görünüşe iyileşti bir biçimde azalmıştır (Şekil 2Aiv-vii ve B). Bu nedenle, apoptotik hücreler sitokrom c mitokondriyal yayımlanmasından sonra Anastasis uğrayabilir.
Mansap DEVD-parçalayıcı kaspaz amplifikasyonu genellikle apoptoz 2,5 "dönüşü olmayan nokta" olarak kabul edilir. Bu nedenle, bir kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS expr kullanılanmümkün önce kaspaz aktivitesi (Şekil 3A) yaşamış hayatta kalan hücrelerin tespit etmeyi mümkün kılar, bir plasmid 13'ten popülasyonunda ifade. Bu kaspaz biyosensör, bir N-ucu çekirdek dışlama sinyali (NES) ile bir bağlayıcı kaspaz-3, sarı floresan proteini (YFP) takip / 7 konsensüs bölünme mevkisi (DEVD) 26,42,43 ve bir polipeptiddir C-terminali nükleer lokalizasyon sinyali (NLS). Sağlıklı hücrelerde, bu biyosensör ağırlıklı NES bir fonksiyonu olarak sitoplazmada lokalize 13 (3Bi, Cı-IV ve D Şekil). Apoptoz sırasında, aktif kaspaz verimli eş zamanlı olarak, ya da sonradan, bu DNA / kromatin yoğunlaşması ve hücre küçülmesi (Şekil 3B ii gibi apoptoz diğer özellikleri görüntülemek hücrelerde çekirdeğe sitosolden translocates YFP-NLS, serbest, DEVD motifi yarmak IV, ve D) 13. Bu durumda,se hücreleri kaspaz aktivasyonu takip nükleer ithalat fonksiyonu korumak. Apoptoz indükleyici çıkarılmasından sonra kaspaz aktivasyonu (meydana gelse bile inişi ekran morfolojik kurtarma geçen hücrelerin, 3Bv-x Şekil ve D) 13, görünüşe göre geç evre apoptoz ters. Onlar ölüm uyaran (Şekil 3Bv-x, Hücre 1) 13 çıkarıldıktan sonra apoptoz ters başladığınızda, normal morfoloji kurtarma sırasında, nükleer YFP sinyal hücreleri muhtemelen tarafından, kaspaz-yarılan biyosensör aşağılamak olduğunu düşündüren bazı hücrelerde yoğunluğu azalır kullanılan aynı mekanizma sırasında ve sonrasında inişi diğer kaspaz-parçalanan ürünleri kaldırmak için.
Anastasis ayrıca canlı hücre mikroskopi olmadan tespit edilebilir. Bu bağlar ve işaretler apoptoz sırasında erken bir basamakta (en fosfatidilserin (PS), dışa olan floresan etiketli anneksin V 38,44 kullanılarak elde edilebilir
Şekil 1: Canlı hücre görüntüleme ile apoptoz tersine Takip. (- D ve G. Şekil 1A için, Tang ve ark, MBoC 23, 2240-2252 13 izni ile yayımlanmaktadır). Apoptoz neden ve sonradan kültürlü hücreler apoptoz indükleyici uzak yıkandıktan sonra kurtarmak için izin (A) Yaklaşım. (Işlenmemiş) sağlıklı birincil fare karaciğer hücreleri (B) Time-lapse canlı hücre faz kontrast mikroskobu, tedavi edildi hücrelerin aynı grup 5 saat (muamele edilmiş), ve daha sonra yıkanır ve daha fazla (yıkanmış) 24 saat süre ile, taze kültür ortamı ile kuluçkalanmıştır için kültür ortamı (hacim / hacim) içinde% 4.5 etanol ile. Ölçek çubuğu, 100 mikron. (C) Etal önce aynı birincil fare karaciğer hücresinin Sürekli time-lapse canlı hücre epi-floresan mikroskopi2.5 saat metanol (II ve III), ve yıkandıktan sonra hücre kültür ortamı içinde% 4.5 etanol ile muamele edildikten sonra belirtilen zamanlarda muamele, (i) ve 1 saat boyunca geri dönüşüne verecek şekilde taze ortam ile inkübe edilmesi, (iv - vi). MitoTracker lekeli mitokondri (kırmızı) ve Hoechst-lekeli çekirdeği (mavi) birleştirilmiş ve görüntüler DIC mikroskopi ile ep floresan mikroskopi ve hücre morfolojisi ile görselleştirilmiştir. Ölçek çubuğu, Panel C 10 mikron. (D) Birleştirilmiş floresan görüntüler sadece (DIC olmadan) organel morfolojileri ortaya. (E) etanol tedavi öncesi insan küçük hücreli akciğer kanseri H446 hücrelerinin Sürekli time-lapse canlı hücre konfokal mikroskopi (i) 2 saat 28 dakika boyunca (II-VI) hücre kültür ortamı içinde% 3.8 etanol ile muamele edildikten sonra, yıkama sonrası ve kurtarma (VII-XII) sağlamak için taze ortam ile inkübe edilmesi. MitoTracker lekeli mitokondri (kırmızı) ve Hoechst-lekeli çekirdeklere (mavi) birleştirilmiş ve görüntüler konfokal mikroskopi ve c ile görselleştirilmiştir DIC mikroskopi ell morfolojisi. Beyaz oklar apoptotik cisimlerin (vi) 'de parçalanmış bir çekirdeği göstermektedir. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (F) Birleştirilmiş sadece (DIC olmadan) floresan görüntüleri paneli E organel morfolojileri ortaya. (G) Sürekli kesin olmayan hücre bölünmesini uğrar tek bir HeLa hücre tek renkli Hoechst-lekeli nükleer görüntüleme için zaman atlamalı canlı hücre epi-floresan mikroskopi. 5 saat için hücre kültürü ortamı içinde% 4.3 etanol ile etanol muamelesinden (i) Tedavi öncesi, (ii) ve etanol çıkarılmasından sonra (yıkandı iii-vi). Paneller IV anormal hücre bölünmesi ortaya koymaktadır. Kırmızı oklar bölünmüş hücreler (iv- vi) büyük çekirdekleri göstermektedir. Ölçek çubuğu, 30 mikron. Times saat olarak gösterilir:. Min , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
saat'in 2 "src =" / files / ftp_upload / 51.964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Şekil 2: sırasında sitokrom c salınımı mitokondriyal (A) stabil (i) önce sitokrom-c GFP (Cyto C GFP) ifade HeLa hücrelerinin Sürekli time-lapse canlı hücre konfokal mikroskopi, sonra apoptoz ters algılama (ii-iii) ve hücre kültür ortamı içinde% 3.9 etanol, (iii-vi) maruz kaldıktan sonra. CytoC-GFP (yeşil), MitoTracker lekeli mitokondri (kırmızı) ve Hoechst-lekeli çekirdeklere (mavi) birleştirilmiş konfokal görüntüleri DIC görüntüleri (sol panel) ile birleştirilir. Birleştirilmemiş sürümleri sinyal yoğunluğu ısı haritası (sol orta panel), CytoC-GFP (orta panel) monokrom görüntü ve mitokondri tek renkli görüntü (sağ orta panel) olarak sunulan, CytoC-GFP için ayrı ayrı gösterilir. CytoC-GFP ve mitokondri (sağ panel) birleştirilmiş ve görüntüler. (B) hücreler, Cel sitosolik sitokrom C-GFP sinyali yoğunluğunun değişimPanel Ai tek renkli CytoC GFP şekilde belirtildiği gibi L 1 ve Celi 2. Times saat olarak gösterilir:. Min , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: (Şekil 3A için Tang ve ark, MBoC 23, 2240-2252 13 izni ile yayımlanmaktadır, - D.) Kaspaz aktivasyonu sonrası apoptoz tersine algılama. Canlı bir nükleer ihracat sinyali (NES), DEVD kaspaz bölünme bölgesi, sarı floresan proteini (YFP) ve nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) oluşan kaspaz biyosensör füzyon proteininin (A) Diyagramı. (B) sürekli bir zaman atlamalı sırasında kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS (i) önce, ifade HeLa hücrelerinde hücre konfokal mikroskopi (ii IV) ve hücre kültür ortamı içinde% 4.3 etanol (vx) maruz kaldıktan sonra. Kaspaz Biyosensörün (yeşil) Birleştirilmiş konfokal görüntüleri, Hoechst-lekeli çekirdekleri (mavi) ve DIC görüntüleri (sol panel), YFP sinyali (orta panel) bir tek renkli görüntüleri ve YFP sinyal yoğunluğu gösteren bir ısı haritası (sağ panel) . (C), tedavi edilmemiş sırasında önce panel B'de (D) (panel Bi 1 ve 2 numaralı), ayrı ayrı hücrelerde aktif hale getirilen nükleer kaspaz biyosensör için floresan şiddetleri nicel olduğu gibi analiz kontrolleri ve etanol maruz kaldıktan sonra ve işlem görmemiş kontrollere (Panel Ci 3 ve 4 numaralı) çekirdeğin (nükleer / toplam hücre YFP sinyal yoğunluğu x% 100) YFP mevcut olan yüzdesi olarak hesaplandı. Kez saat olarak ifade edilir: min. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: floresan-etiketli anneksin V tarafından apoptoz tersine algılama (. - B Şekil 4A için, Tang ve ark, MBoC 23, 2240-2252 13 izni ile yayımlanmaktadır). Panel B (B), temel kardiyak ventriküler miyositler 5 saat için hücre kültürü ortamı içinde% 4.5 etanol maruz bırakılır ve daha sonra 10 için anneksin V-FITC ile inkübe edilmiştir Yenidoğan sıçan kullanılan anneksin V-FITC inişi tahlilinde (A) Diyagram dk etanol orta çıkarılmadan önce. Hücreler, hemen sabit (muamele edilmiş), ya da ilave bir 2 saat geri kazanımı için taze ortam ile beslemede sonra tespit edildi (yıkanmış). Anneksin V-FITC maruz bırakılmıştır İşlem yapılmamış hücreler kontrol (işlenmemiş) olarak hizmet etmektedir. MitoTracker lekeli mitokondri (kırmızı), Hoechst-Boyalı çekirdekler (mavi) ve anneksin V-FITC (yeşil) konfokal mikroskopi ile görselleştirilmiştir ve hücre morfolojisi, DIC mikroskopi ile görünür hale getirildi. Scale bar, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anastasis hücre ölümü yolu aktive olan hücreler daha sonra ölüyor süreci tersine ve hayatta fenomen ifade eder. Burada, canlı hücre görüntüleme aslında aynı tek tek hücreler bir son aşamada, apoptotik hücre ölümü sürecinin tersine ve yaşam ve çoğaltmaya devam onaylamak için kullanılabileceğini göstermişlerdir. Bizim protokolleri apoptoz teşvik ve doğrulama için çeşitli biyomarkerler ile izlenen apoptoz dönüşümüne maruz hücrelerin büyük bir kısmını sağlamak için birçok optimize hücre tipine özel tedavi koşullarını açıklar. Teknik konularda, cam alt yemekler nedeniyle yüksek büyütmede yüksek kaliteli konfokal veya epi-floresan mikroskopi için uzun çalışma mesafeleri veriyor hücreleri ve mikroskop objektif arasındaki yüksek şeffaf ince cam,, görüntüleme 12,13 için kültür hücreleri kullanıldı, mitokondriyal parçalanma gibi klasik apoptoz gözlem kolaylaştırır, Sitokrom c, ve nükleer yoğuşma ve parçalanma serbest. Cam aynı zamanda apoptoz sırasında, zann kabarmasıyla, hücrelerin, hücre büzülmesi ve apoptotik vücut formasyonu izleme için yüksek kaliteli DIC mikroskopi izin vermek için, ışık kutupları bozmamaktadır. DIC hücre morfolojileri tespiti iyileştirilmesi, lekesiz ve şeffaf hücre örneklerinin kontrastı gibi DIC mikroskopi, apoptoz bu morfolojik işaretlerinden gözlemlemek için faz kontrast mikroskobu üzerinde avantajlara sahiptir. DIC ve faz kontrast mikroskopisi mevcut değilse, CellTracker konfokal veya epi-floresan mikroskobu için canlı hücre morfolojisi anahat ve hücre morfolojisi izlemek için sitoplazmada leke kullanılabilir.
Ölüm uyaranların uygun dozda uygulanması ve uyaranların kaldırılması stratejileri inişi tespiti için kritik adımlar vardır. Biz deneyler descr'in için bir ölüm uyarıcı olarak etanol düşük konsantrasyonlarda kullanmak için seçtinizIBED burada tedavi hücrelerin büyük bir yüzdesi eşit apoptoz uğrayabilir ve potansiyel, bundan daha hafif kurtarabilirsiniz, çünkü ölüm uyarıcı. Biz 12,13 bildirdi Yine de, bu yaklaşımlar da, diğer ölüm uyaranlara başarıyla uygulanabilir. Bununla birlikte, bazı ölüm uyarıcı gibi staurosporin (STS), yaygın olarak kullanılan bir apoptosis teşvik edici bir ajan olarak diğerlerine göre daha doğal olarak daha zordur. Yüksek afinite 46-48 ile substratları bağlar Belki de, tekrarlanan yıkamalar önemlidir ama hala verimli hücrelerden STS çıkaramazsınız. Bu durumda, yine apoptotik ölen sürecini aktive edebilir düşük ilaç konsantrasyonları ve kısa ilaç inkübasyon süresi kullanarak daha fazla hücre apoptozu tersine izin yardımcı olabilir. Yeniden besleme taze hücre kültür ortamı daha apoptoz ters artırabilir koşullandırılmış hücre kültürü ortamı ile hücreleri. Apoptotik hücreler, genellikle gevşek bir şekilde, özellikle de cam sur kültür, bulaşık yüzeyi ile bağlandıklarıyüzler, dolayısıyla hücreleri ayrılmakta önlemek için yavaşça apoptoz indükleyicilerini yıkayacak önemlidir. Özellikle, hücrelerin maruz kaldıktan sonra, hücre kültür kapları içinde, cam yüzey üzerinde düzgün bir şekilde bağlamak için, örneğin kardiyomiyositler 37 gibi bazı hücre tipleri, izin vermek için, hücre yapışmasını artırabilir ve poli-D-lisin, kolajen ve / ya da fibronektin ile cam yemekler kaplanması Ölüm uyarıcı.
apoptoz bir işlem, ve apoptozun muhtemelen ters sıcaklık etkisi altında kalabilir enzimatik aktivitelere bağlıdır. Bu nedenle, 37 ° C'de ya da normal kültür koşullarında hücreler muhafaza deneysel sonuçların yeniden üretilebilirlik sağlamak için, canlı görüntüleme işlemi boyunca çok önemlidir. Canlı hücre görüntüleme başlamadan önce ön-sıcak mikroskop da mikroskop bileşenleri termo-dengeye ulaşmasını sağlar kritik bir adımdır. Bu durum termal genleşme ve daralma odak ve xy düzleminin vardiya sürüklenme önleyebilirsinizcanlı hücre görüntüleme sırasında bileşenler. Uygulamak veya sıcaklık nedeniyle ya da orta hacmindeki değişikliklere hala odak sürüklenme neden olabilir time-lapse görüntüleme sırasında ya bir pipet veya önceden ısıtılmış mikroskopi sisteminde perfüzyon ile ortam bir kültür çanak değiştirerek ölüm uyaran çıkarılması. Z-yığını edinimi doğru odak düzlemi görüntü hücrelerine yardımcı olabilir, fakat floresan lazerlerin hücrelerin ek pozlama fototoksisite riskini artıracaktır. Alternatif olarak, böyle bir kızılötesi lazer tabanlı otomatik odaklama düzeltme sistemi olarak odak sapma telafisi sistemlerinin kullanımı, ek olmadan hücre / cam ve objektif arasındaki mesafeyi koruyarak time-lapse canlı hücre görüntüleme sırasında aynı odak düzlemi hücreleri tutabilir Kısa dalga boyu, fototoksik floresan hücrelerin maruz.
Mitokondriyal sitokrom-c gibi gibi apoptogenic proteinlerin salınımı, ve bu alt / etkisi efektör kaspaz, aktivasyonuya kaspaz-3 ve kaspaz-7, genellikle apoptotik hücre ölüm süreci 2,5,6 "dönüşü olmayan nokta" olarak kabul edilmiştir. Western blot kaspaz-3 bölünmesini (aktivasyon) ve apoptotik indüksiyon sırasında bütün hücre popülasyonunda poli (ADP) -riboz polimeraz-1 (PARP) ve DFF45 / ICAD gibi apoptotik çıkarılmasından sonra substratlar tespit etmek için kullanılmıştır uyaranlar ve yarılmış kaspaz-3, ICAD ve PARP ölüm uyaranlara maruz kalma sırasında hücrelerde ortaya ortaya, ama taze kültür ortamı 13 ile hücreler sonrası yeniden besleme kayboldu. Ancak, bu yöntemler hücre popülasyonu genel durumu ortaya, ama sonuçta hayatta ardından apoptoz ters ve olacak olanlar ölecek tek tek hücrelerin ayırt edemez. Mitokondriyal sitokrom c salınımını analiz Biyokimyasal fraksiyon benzer uyarılar vardır. Bu nedenle, sitokrom-c salınımı ve kaspaz-ac sonra tek tek hücrelerin kaderini izlemek içintivation, apoptoz 2,5,6 en tanınmış işaretlerinden iki tür canlı hücre ile kombine NES-DEVD-YFP-NLS burada kullanılan biri olarak GFP etiketli sitokrom c (Cyto C GFP) ve kaspaz biyosensör, mikroskop doğrudan morfolojik kurtarma ve aynı hücrelerde Cyto C GFP biyosensör translokasyonuna gözlemleyerek bu sorunları aşmak. Bu sonuçlar mitokondriyal sitokrom-c salınımı ve kaspaz aktivasyonu sonrası apoptoz Reversibilite göstermektedir.
Anastasis çalışmak için mevcut sorun, in vivo veya in vitro olarak, kullanım ömrü boyunca herhangi bir noktada Anastasis geçiren hücreleri saptamak için etiketleme tekniklerinin gelişmemiş olmasıdır. Kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS Kararlı ifade kaspazlar gelecekte tekrar aktive eğer aynı zamanda kaspaz aktivitesinin tespit izin, ancak aktive biyosensör Susta olmadan bozulmuş olacak gibi kalıcı kaspaz aktivitesini yazmazined kaspaz aktivitesi 13. Bu tür FRET göre SCAT biyosensörler gibi diğer daha önce rapor kaspaz biyosensörler, (örneğin, ECFP- [DEVD] -Venüs) 26,49 gibi floresan haberci Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 ve GBM (örneğin, CD8 - [DEVD] -Venüs) 51,52, bütün hayvanlarda ve kültürlü hücrelerde kaspaz aktivitesini tespit etmek için kullanılan, ancak benzer kısıtlamalar var olabilir. Benzer şekilde, Sito Cı GFP apoptoz sırasında sitozolüne mitokondri salınır ve daha sonra düşer gibi, uzun vadede apoptosisi tersine hücreleri izlemek için kullanılamaz. Annexin V etiketleme apoptoz ters hücreleri izlemek için kullanılan, ancak sinyal yoğunluğu da zamanla azalır, bu nedenle inişi 13,45 uzun süreli takibi için kullanışlı değildir olmuştur. In vivo görüntüleme sürekli uzun süreli ölüm uyaranlara maruz kaldıktan sonra aynı hücrelerin gelişmeyi izlemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme için uzun süreli devam t zorluo en canlı hayvan gerçekleştirmek. Bu nedenle ek yaklaşımlar, tüm hayvan çalışmaları ve teşvik veya doku kültürü hücreleri kullanılarak Anastasis inhibe olabilir ilaçların taranması için Anastasis araştırma uzatmak için gereklidir
Gelecekte, uzun vadeli hücre kaderi takip yeni protokoller ve teknikler geliştirmek ve inişi bölgesinin fizyolojik, patolojik ve tedavi sonuçlarını test etmek için ihtiyaç vardır. Biz Anastasis gibi olgun nöronlar ve kalp hücreleri 13 olarak, yerine zor yaralı hücreleri kurtarmak için genel bir hücre sağkalım mekanizması olabileceğini önerdi. Bununla birlikte, kemoterapötik tedaviden sonra apoptotik kanser hücrelerinin inişi olarak dirençli olan tümörlere 12,13 nüksü Tehlike arz eden hücrelerin geri kazanımı neden olabilir. Onlar apoptoz 13 ters sonra bazı hücreler onkojenik dönüşüm göstermek gibi Anastasis ayrıca, Tümörgenez önemli bir mekanizma olabilir. Bu nedenle, Anastasis arttırıcı bir yeni Thera olabilirönlemek veya kanserleri tedavi etmek için yeni bir yolu olarak Anastasis bastırırken, nörodejeneratif hastalıklar ve kalp yetmezliği inhibe etmek için terapötik bir strateji. Biyosensörler geliştirilmesi Anastasis modüle edilmesiyle kontrol edilemeyen hastalıkların hücre hayatta kalma inişi mekanizmaları ve potansiyel terapötik anlama ilerletir hastalık modeli sistemlerinde apoptoz ters izlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz kelime "Anastasis" apoptoz ters açıklamak için öne için Rev Dr Ralph Bohlmann ve Rev Dr James Voelz teşekkür; Stabil sitokrom c GFP ifade HeLa hücreleri Douglas R. Yeşil; H446 hücreleri Charles, M. Rudin ve Eric E. Gardner; Video karikatür çizim konusunda yardım almak için Heather Kuzu; Bu yazının değerli tartışma için Yee Hui Yeo. Bu çalışma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Bursu (HLT), Fulbright hibe 007-2009 (HLT), Yaşam Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenen, NIH NS037402 (JMH) verir ve NS083373 (JMH), ve Hong Kong Üniversitesi Hibeler Komitesi AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | ||
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
References
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
- Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
- Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
- Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
- Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
- Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
- Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
- Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
- Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
- Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
- Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
- Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
- Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
- Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
- Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
- Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
- Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
- Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).
