Summary
암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.
Abstract
유방암의 성장 모델의 과다 사용을 마우스에서 연구 될 수있다. 유방암 세포의 유전자 조작은 새로운 종양 억제제를 발견하도록 도움 또는 종양 진행에 관여하는 단백질의 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 또한, 다른 유전자형 생쥐에 암세포를 주입하여 기질 구획의 중요성에 대한보다 나은 이해를 제공 할 수도있다. 대부분의 모델은 질병 진행의 특정 측면을 조사하는 것이 유용 할 수 있지만, 전체 암의 과정을 요점을 되풀이하지 않습니다. 대조적으로, 유방암 세포는 더 마우스 유방 지방 패드에 생착이 질환과 적절한 기질 구획의 존재 때문에 잘 모방 암성 인간 질병의 위치를 되풀이. 이 글에서, 우리는 동소 마우스로 유방암 세포를 이식하고 분석 할 조직을 수집하는 방법을 설명하는 방법에 대해 설명합니다: 14px; 라인 신장. 28px; "> 종양 환경 및 전이 원격 장기에이 모델을 사용하여, 암의 여러 측면 (성장, 혈관 신생 및 전이)은 종양 세포의 성장을위한 적절한 환경을 제공하는 것만으로 조사 할 수있다.
Introduction
암은 수세기에 걸쳐위한 연구에 대상이되고있다 매우 복잡한 질환입니다. 유방암은 가장 흔한 암 타입이고; 그것은 여성에서 주로 발생하지만 산발적으로도 남성 (27)에 발생할 수 있습니다. 질병은 주로 다시 신체의 세포의 무한 성장 리드 제어 메커니즘 통치 세포 분열의 손실에 의해 야기된다. 이러한 고장은 여러 메커니즘에 의해 야기 될 수있다 : 먼저, 건강한 세포는 암세포가 자신의 성장 인자를 확인함으로써보다 증식 속도 하나를 획득하는 성장 인자 수용체의 발현을 증가 반면 증식하기 위해 주변 셀로부터의 성장 신호를 필요로; 둘째, 암 세포는 항 증식 신호 8에 덜 민감하다; 셋째,도 필요 본체 세포사의 셀 개수를 조정하는 단계; 그러나 암세포는 프로그램 된 세포 사멸에서 탈출 아폽토시스 14 불린다; 네 번째로, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 부착위해 생존하지만 종양 세포는 첨부 파일의 필요없이 성장하고 anoikis (19)에 대한 저항을 표시 할 수 있습니다; 다섯째, 텔로 머라 아제의 활성화는 텔로미어 단축을 우회하고, 복제 성 노화 (21)을 방지; 마지막으로, 변형 된 유전자 콘텐츠 (15, 16)의 유사 분열 결과 다음과 같은 DNA 품질 관리의 건너 뛰는. 이러한 탈 조절 된 증식에 중요한 역할을 종양 유전자 또는 종양 억제를 식별하기 위하여, 마우스에서 종양 성장 실험은 중요하다.
차 종양의 성장은 일반적으로 사망의 주요 원인이 아니다. 보조 사이트 차 사이트에서 암세포의 마이그레이션, 전이 되나, 대부분의 암 환자 22에서 사망의 주요 원인이다. 전이 차 사이트에서 면역 공격, 혈관 외 유출 및 성장을 방지 순환을 통해 여행, 종양 세포의 침윤을 수반 intravasation. 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 핵심 프로세스에전이 및을 전이 셀 (12)을위한 전제 조건입니다 더 높은 운동성 및 침입과 세포를 산출 유전자 발현 프로파일의 스위치를 포함한다. 암 처리는 암세포, 간질 세포 및 프로 및 항 염증 세포 간의 상호 작용을 포함하여 다양한 작업의 조합의 결과물이기 때문에, 암 관내 접근법은 종종 암 과정에 전체 통찰력을 제공하지 않는다. 유사하게, 종양의 혈관에 영향을 항암 치료는 종종 따라서 생체의 사용이 불가피하다 접근, 시험관 내에서 연구 될 수 없다.
유방암의 진행을 연구하기 위해, 다른 실험 방법이 개발되었다. 가장 널리 사용되는 모형 (5)에 마우스 유방암 세포의 피하 주사이다. 본 실험 구성에서, 연구자는 시험관 내에서 원하는 세포주 변경 폭넓게 도입 할 수있다 (즉,상향 조절, 단백질의 하향 조절) 및 피부에서 세포를 주입. 이 방법은 간단하고 사출 공정이 쥐에 수술을 수행 할 필요없이 간단하지만, 종양이 주입되는 위치는 유방암 개발 될 수 로컬 유방 종양 환경과이 환경의 부재를 나타내지 않는 것을 인간 병리학에서 관찰 다릅니다. 둘째, 유전자 조작 마우스는 유방암의 진행을 연구하는 생체 도구로 자주 사용된다. 이 모델에서, 종양 유전자 (즉 PyMT, 노이) 식 자발적인 유방 종양 (S)의 형성으로 이어지는 유방 조직 특이 적 프로모터에 의해 구동된다. 이 실험에서는 시간 3에서 종양의 크기를 확인하면서 약물이나 항체를 주입하여 질병의 치료 양상을 연구하는 데 유용합니다. 그러나, 결핍 또는 또한 인을 줄 수도 있습니다 관심의 유전자에 돌연변이 다른 마우스 변종 이러한 쥐를 사육유방 종양의 성장 (24)에서 상이한 단백질의 역할에 ights. 이러한 모델의 단점은 종양의 크기와 수에 변동되는 경향이 있다는 것이다. 또한, 유전자 발현 수준은 게놈 통합 사이트에 의존 한 다른 4 마우스 균주에서 변경할 수있다. 인간의 질환 세포의 하위 집단 만이 종양 유전자를 발현 또는 종양 억제 수준을 하향 조절하는 반면 26이 모델에서 트랜스 진의 발현은 상피 기원의 모든 세포에 의해 달성 될 수있다. 전이를 연구하기 위해, 유방암 세포는 또한 정맥 내 주사 될 수있다 (25) (모델 실험 전이 불린다). 그러나,이 방법은 부분적으로 만 전이 과정을 되풀이; 이는 종양 세포가 침입 및 intravasate위한 요건을 회피하고, 종양 세포가 용이 순환에 존재하는 지점으로부터 시작한다.
우리의 작업에서 우리는 동소 분사를 사용이온 모델은 유방암의 진행 (13)에 대한 관심의 유전자의 참여를 공부합니다. 우리는 인간 유방암 세포에서 단백질을 과발현 및 NOD / SCID 감마 (NSG) 마우스의 유방 지방 패드로 주입. 이 주입 된 세포주에서 매우 신속하고 다양한 유전 적 변화는, 그것이 병리학 중요한 부위에서의 전이에 일차 종양 성장과 유방암 진행하는 과정을 더 포함 허용하고, 또한 양호한 실험 모델을 제공한다 :이 방법은 여러 가지면에서 유리하다 질병의 초기 또는 후기 단계에서 치료 치료의 영향을 연구. 또한,이 모델을 사용하여 유 전적으로 변형 된 세포 또는 마우스를 이용하여 질병의 진행 암 세포 유래 단백질에 비해 기질의 역할을 조사 할 수있다. 피하 주사를 수행하기 쉽게되지만, 소성 모델은 더 이상 종양 형성 및 전이성 암 세포 집단을 야기. 따라서, 결과는 피하 주사의 방법에 의해 얻어진S는 위음성 또는 종양의 성장을 연구하는 소성 모델의 사용을 장려 6,17 위양성이 될 수 있습니다.
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Protocol
동물 실험은 라이덴 대학 의료 센터 (LUMC)의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.
세포, 악기 및 마우스 1. 준비
- 작업을하기 전에 날, 중간 선에 네 번째 젖꼭지에서 NOD / SCID 감마 (NSG) 마우스를 면도하고 모든 마우스는 대략 비슷한 가중치가 있는지 확인하기 위해 마우스의 무게를.
- 두 개의 핀셋과 두 개의 직선 모기 집게 (그림 1A)를 가위를 압력솥.
- 수술 당일에, 인간 유방 선암 (MDA-MB-231) 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 한번 주입 될 세포, pH가 7.4를 씻어 내고 세포를 Trypsinize. 셀의 상부에 10 ㎖의 혈청 - 함유 DMEM 매체를 첨가함으로써 트립신을 켄 칭하고. 혈청없이 PBS 또는 미디어 중 하나 세포를 재현 탁하여 혈청을 제거하기 위해 실온에서 7 분 동안 1,200 rpm에서 세포를 원심 분리기. 완전히 혈청의 흔적을 제거하기 위해 다시 원심 분리기. PBS로 세포를 재현 탁하거나미디어.
- 혈구 세포와 세포의 개수와 크기를 계산. 하지 150 개 이상의 μL 500,000 세포 / 마우스를 사용합니다. PBS 또는 미디어 선택, 리겔에서 세포를 재현 탁.
주 : 사용 된 세포 유형에 따라 세포의 양을 결정한다. - 멸균 마이크로 원심 튜브에 세포를 넣고 얼음에 보관하십시오.
- 35 PBS pH를 7.4 ml의 70 % 에탄올로 다른 50ML 원뿔 원심 분리기 튜브 하나의 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 입력합니다. 각각의 튜브에 면봉을 적시.
2. 동소 이식 주입
- 멸균 분위기를 유지하기 위해 무균 후드에서 수술을 수행한다. / kg 체중 100mg을 각각 10 ㎎ / kg의 투여 량으로, 자일 라진 / 케타민 믹스를 피하 주사하여 마우스를 마취. 가열 패드에 마우스를 고정합니다. 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 마취의 성공을 확인합니다.
참고 : 하나는 수술 절차에 익숙하지 않은 경우, 수술 시간이 더 걸릴 수 있습니다. 정렬마취는 이에 따라 복용량. - 건조에서 눈을 방지하기 위해, 마우스의 눈 안과 연고를 적용합니다.
- 단계 1.6에서 제조 된 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 면도 영역을 청소합니다. 계획 절개 사이트에서 떨어져 회전하는 원형 방식으로 베타 딘과 술을 세 번 사용하는 스크럽을 교류하는 수행해야합니다. 또한, 살균제 이온 운반체 사용합니다.
- 가위로 네 번째 젖꼭지와 중간 선 사이에 작은 절개를하고 PBS 산도 7.4 적신 면봉을 삽입하여 주머니를합니다.
- 유방 지방 패드를 노출 트위터를 사용합니다. 해당 흰색으로 지방 패드를 관찰합니다.
- 그것의 기초에서 다른 트위터와 지방 패드를 짜내; 이 작업을 수행하여, 완전히 쉽게 주사를 수행하기 위해 지방 패드 (그림 1B)를 노출합니다.
- 상하 피펫 팅하여 세포 혼합액 균질화. 부드럽게 인슐린 주사기로 세포 현탁액 50 μL를 대기음으로 주입수평으로 바늘을 누르고 있으면 유방 지방 패드. 지방 패드의 붓기를 확인하여 성공적으로 주사를 확인합니다.
- 부드럽게 지방 패드를 놓습니다.
- 바늘 드라이버를 사용하여 절개 봉합. 세 개의 시계 방향, 반 시계 방향 및 시계 방향으로 바늘 드라이버 주위의 봉합을 돌려 확인 던진다. 봉합 당 두 개의 노트를 사용할 필요가 있습니다.
주 : 매듭 그렇지 않으면 마우스가 봉합을 열 수 있습니다 꽉 있는지 확인합니다. - 수술 후 통증을 완화하기 위해 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 체중, 피하 그러한 temgesic 등의 진통제를 주입.
- 그들은 의식을 얻고 흉골 드러 누움을 유지 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오. 그들이 완전히 회복 될 때까지 다른 케이지에 모든 동물을 놓습니다.
- , 불임을 유지 멸균 된 케이지와 물을 사용하십시오. 깨끗한 분위기를 유지하기 위해 3 일마다 케이지를 변경합니다.
분석 3. 수확 기관
- 에서수확의 날, 팔주 세포의 주입 후, 각각의 마우스 3 ㎖ 보우 인의 솔루션으로 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 입력합니다. 또한, 마우스 당 5 ㎖ 포르말린 용액으로 채워진 두 15ml의 튜브를 사용한다.
- 10 ㎎의 투여 량으로, 자일 라진 / 케타민을 동물에 주입하여 마취 / 100 ㎎ / kg 체중 피하 kg. 동물 발가락 핀치 철수 반사 손실 될 때까지 기다립니다.
- 기본에 바늘 동물을 수정합니다. 가위로 긴, 수직 정중선 절개를합니다. 오른쪽 앞 다리 아래 뒤쪽 다리 위에 두 개의 수평 절개를합니다. 베이스에 피부를 달아하여 종양을 노출. 캘리퍼스를 이용하여 종양 체적을 측정한다.
- 가위를 사용하여 피부에서 종양을 해리. 스냅 RNA 분리 용 액체 질소에서 종양의 일부를 동결. 파라핀 삽입 다음과 면역 조직 화학 염색을 수행하기 위해 포르말린으로 가득 원뿔 원심 분리기 튜브에, 또 다른 부분을 놓습니다.
- 조심스럽게 폐를 꺼내. 배치보우 인의 솔루션으로 폐를 떠났다. 3 일 동안 용액에 폐를 유지합니다. 육안으로 명확하게 피상적 전이 병소를 관찰합니다. 선택적으로, 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색을 사용하여 미세 전이를 확인하기 위해 포르말린으로 우측 폐를 놓습니다.
참고 : 폐 전이 유방암에서 자주 관찰되지만, 하나는 전이를 분석하기 위해 뼈, 간, 뇌, 비장를 수집 할 수 있습니다. 전이 영역의 세포 밀도 및 형태 학적으로 상이하며, 따라서, 폐 조직으로부터 쉽게 구별 될 수있다. - 하루는 수확 후 15 ml의 튜브에서 포르말린 솔루션을 대기음 70 % 에탄올로 대체합니다. 파라핀의 조직을 포함하고 면역 조직 화학 연구를 수행합니다.
- 혈액 분석을 위해, 가위로 흉강을 엽니 다. 심장 구멍을 통해 450 μL 혈액을 철회. 3.2 % 시트르산 나트륨의 50 μl를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에서 혈액 샘플을 놓는다. 피가 수집 된 후, 10 마일 2,000 XG에 그것을 회전N. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 플라즈마 샘플을 저장합니다.
주 : 거기 (20)에 일반적으로 실제로 사용되는 여러 다른 혈액 수집 기술은 다음과 사용될 필요 기법과 실험 구성 과학자의 선택에 달려있다. 혈액 샘플이 필요하지 않은 경우, 프로토콜에 동물이나 기관 지침에 따라 동물을 따른 안락사.
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Representative Results
"소성 유방암 모델"의 성공적인 적용은 유방 지방 패드로 세포의 적절한 주입에 기초한다. 이러한 세포 또는 누설 부정확 접종 같은 실험 오차는 종양 크기 또는 제어 버퍼 (도 2a)와 주입 유방 지방 패드에 유사하게 보이는 구조의 형성을 유도 종양조차없는 변형을 초래할 수있다. 종양의 성장 속도는 분사 된 세포주의 특성에 의존하고, 일반적으로, 마우스 (도 2B)의 피부를 통해 관찰 할 수있다. 시험 관내 실험과 달리, 종양 세포의 성장 속도는 생체 내에서의 시간 (도 2C)에서 일정하지 않을 수있다. 저산소증 및 영양소의 부족으로 인해, 괴사 영역을 형성 할 수 있으며 이러한 지역은 종양 (도 2D)의 성장 속도에 영향을 미칠 것이다. 또한, 관심있는 유전자는 특정 위상에 영향을 줄 수있는암의 진행 (초기 또는 후기), 따라서 실험 설정에 따라 종양의 성장이 빠른 시작하지만 마지막에 또는 그 반대의 경우도 마찬가지 느려질 수 있습니다.
치료는 종양의 제거 절차를 수행하는 동안주의해야한다; 엄격한 취급 종양의 구조에 영향을 주며 면역 분석의 문제에 이르게 할 수있다. 종양 주변 지역은 혈관 재에서 발생하는 대형 선박을 표시 할 수 있습니다. 이러한 선박은 노폐물의 제거에 중요한 역할을함으로써 종양 성장 (도 2b)를 용이하게 영양분과 산소와 종양 조직을 공급한다. neovessels (혈관)의 형성은 neovessel 마커의 종양을 염색하여 조사 할 수있다 (즉, CD31, CD34).
보우 인의 솔루션에서 폐의 컬렉션은 폐의 표면 전이 병소 (그림 3A)를 시각화하는 데 도움이됩니다. 초점은 옅은 색의 수단에 의해 폐 조직으로부터 구별 될 수있다D (18)를 검출하기 쉽다. 전이는 폐 표면에 형성 병소의 수로서 표현 될 수있다. 그러나, 초점의 형성 세포주 의존적이다; 비 공격적인 세포는 미세 전이 또는 전혀 전이를 야기. 마이크로 전이 용이 파라핀 폐 조직 (도 3c)의 헤 마톡 실린 / 에오신 염색으로 확인 될 수있다.
도 1 :. 유방 지방 패드로 유방암 세포의 주입에 필요한 재료 및 방법 (A) 외과 장비 (B) 유방 지방 패드의 노출을 나타내는 대표 화면..
그림 2. 마우스에서 동소 유방 종양 성장의 개요 (A) 또는 미디어 제어
도 3 : 폐 종양 전이 (A) 동소 종양 세포 (MDA-MB-231)를 주입 한 마우스의 폐 하였다.. 보우 인의 솔루션 폐의 배양이 폐에 전이 병소를 노출합니다. 제어 마우스의 (B) 폐를그 제어 미디어의 소성 주입을 시행 하였다. 명확하게 알 수있는 바와 같이, 이러한 제어 폐는 거시적 인 전이를 표시하지 않습니다. (C) H & E 염색은 폐 조직에 전이 영역을 보여줍니다. 인서트 전이성 포커스를 함유 폐 조직의 저배율 개요를 나타낸다. 삽입에 검은 점선 사각형이 큰 패널에 표시됩니다. 종양 세포는 흰 점선으로 표시된다; 더 크고 밀도가 핵을 확인합니다. (블랙 스케일 바 = 100 μm의 흰색 스케일 바 = 20 μm의)
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Discussion
유방암 세포의 동 소성 분사 암 성장의 모든 측면을 연구하는 강력한 모델이다. 마우스의 유방 지방 패드에 이들 세포의 주입 신중 종양 성장의 편차를 방지하기 위해 수행되어야한다. 가장 중요한 것은, 각각의 마우스에 세포의 동일한 양을 주입하는 것이 중요하다. 이를 위해, 하나의 엄격 세포 생존 능력에 영향을주지 않고 세포를 Trypsinize한다. 비 가능한 세포는 생존 세포 수를 결정하는 데 유용 할 수 있습니다 죽은 생존 세포를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다 셀 카운팅 및 시약 (예 : 트리 판 블루) 동안 무시해야합니다. 세포 덩어리의 형성은 세포 덩어리가 형성 세포 카운팅하는 동안 문제가 생길 위아래로 피펫 팅하여 세포를 회피하고 세포 수의 계산 착오로 연결되어야한다. 고려해야 할 또 다른 중요한 양태는 세포 자체의 부피이다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 셀들 PBS 또는 미디어에서 그들을 중지하기 위해 펠렛된다. PBS 또는 매체를 추가하기 전에, 셀 볼륨은 서로 다른 볼륨의 매체로 채워진 튜브 펠렛을 비교함으로써 추정 될 수있다. 이어서 세포 부피는 다음 식에 따라, 의도 된 매체 볼륨으로부터 감산 될 수있다 :
추가되는 부피 = 계산치 필요 매체의 볼륨 - 세포 부피
실험의 결과에 영향을 미칠 수있다 프로토콜에서 사용되는 시약; 따라서 프로토콜은 연구 문제에 따라 적절하게 조정해야한다. 실험은 종양 진행의 세포막 단백질의 역할을 규명하는 것을 목표로하는 경우 예를 들어, 트립신 처리는 세포막 단백질의 소화를 초래할 9 인공물을 야기 할 수있다. 이 관심사 인 경우, EDTA 완충 용액을 사용하여 또는 세포를 긁어하여 세포를 분리하는 대안이다. 전술 한 바와 같이, 균체 매체 또는 리겔 FO PBS에 재현 탁 될 수있다R 주입입니다. 리겔 따라서 fatpad의 누출되는 세포를 최소화 지방 패드에서 중합으로이 중, 리겔은 편리한 옵션입니다. 또한, 마트 리겔 존재 생착은 유방암 세포주 MDA-MB-435 (2), 인간 턱밑 암종 A253, 인간 표피 양 암종 이하 및 마우스 흑색 종 B16F10 세포 (7) 종양 성장 및 특정 세포주의 전이 잠재 성을 향상시킬 수있다. 일부 마트 리겔 제제는 잠재적 실험 결과에 영향을 미치는 성장 인자를 포함하는 것을 알주십시오. 그러나, 성장 인자가 제거 된 리겔은 다양한 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 리겔은 세포 외 기질 (ECM)의 역할과 인테그린의 부분 집합을 활성화합니다. 연구 문제가 종양 성장에 인테그린 기능의 역할을 포함하는 경우 따라서, 하나의 유방암 세포에 대한 담체로서 미디어 또는 PBS를 사용한다.
우리의 실험 장치에서는로 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)를 주입NSG 마우스의 유방 지방 패드. 면역 결핍 생쥐의 사용은 분명 어렵게 암 면역 발달에 관여 유전자를 연구 할 수있다. 그러나, 주입해야 할 셀이 마우스 (23)를 기점이 있으면이 기술은 또한 면역계 손상 쥐에서 사용할 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 또한, MDA-MB-231 세포주 따라서, 유방암의 호르몬의 개발에 대한 영향이없는 에스트로겐 수용체 음성 (ER-)이다. 그럼에도 불구하고 우리의 이전 작업이 기술은 또한 MCF-7 13 ER + 유방암 세포 가능하다 것으로 나타났다. 일반적으로 사용되는 유방암 세포주의 종양 성장을 연구하기 위해이 방법을 이용하여 논문은 다음과 같다 :
절차 자체뿐만 아니라 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 피하 주사와는 달리, 소성 주사는 쥐에 수술을 포함한다. 따라서, 수술 도구는 잘 세척 및 멸균해야합니다. 참고, 인간 세포의 주입에의유방 지방 패드를 면역 결핍 생쥐 (예를 들어, NOD / SCID)의 이용을 필요로한다. 따라서 바람직 멸균 주사기구를 이용하여 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되어야한다. 또한, 주입시, 바늘이 위쪽으로 향하도록 바늘 구멍에 직각으로 유지되어야한다. 이러한 위치에서 바늘을 잡고 누설을 감소시키고, 이와 같이 성공적인 주입 유방 지방 패드 팽윤 관찰함으로써 확인할 수있다. 수술을 수행 할 때, 이는 종양 성장과 상처 치유 과정의 간섭을 회피하기 위해 일정 거리 떨어져 유방 지방 패드로부터 절개를 위해 중요하다. 그러나, 절개가 어려울 수 있습니다 유방 지방 패드를 노출로, 어느 유방 지방 패드에서 너무 먼하실 필요는 없습니다.
과정에 따라, 동물은 정기적으로 점검해야한다. 때문에 마취로 수술과 노출, 마우스도 상당한 불편 함이 발생할 수 있습니다죽어. 따라서, 시술 후 첫 주에 중요하며 마우스는주의 깊게 모니터링해야한다. 이식 된 세포의 성장 속도에 따라 종양 체적을 4 회까지 측정 될 수있다. 주입 된 세포는 또한 감광 카메라를 사용하여, 기본 및 전이성 종양 세포의 추적을 가능하게, 형광 단백질 또는 루시페라아제 태그로 할 수있다. 종양은 궤양가 손상을 종양 조직을 발생할 수 있으므로 매우 큰 크기에 도달 할 수해서는 안됩니다. 이는 종양 조직의 적절한 면역 분석을 방해 할 수있다. 종양 수확되면, 하나는 종양 닦지 부모의 차이를 조사하고 지방 패드 전달 (MFP) 세포주 11 mammay하는 새로운 유방암 세포주를 만들 수 분산 된 종양 세포를 배양 고려할 수도있다.
결론적으로, 우리는이 문서에서 설명 된 동소 유방암 주입은 암 관련 프로세스를 연구하기 위해 매우 유용한 도구입니다. 한 캘리포니아N 중 상승 조절에 의해 주입 된 세포의 게놈을 조작하거나 관심있는 유전자를 하향 조절 및 기본 종양의 성장, 혈관 신생 또는 전이에 미치는 영향을 확인합니다. 이 방법은 프로토 종양 유전자, 종양 supressors 또는 EMT에 관여하는 유전자를 연구하는 것이 도움이된다. 또한, 상기 세포주는 암 진행에 기질 구획의 효과를 조사하기 위해 유전자 변형 마우스에 주입 할 수있다. 우리는 강력 인해 병태 생리 학적 과정의 높은 반복 설에 상기 유방암 모델에 비해 소성 사출 기술의 사용을 권장합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
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- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
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