Summary
הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.
Abstract
צמיחת סרטן שד ניתן ללמוד בעכברים באמצעות שפע של דגמים. מניפולציה גנטית של תאי סרטן שד עשויה לספק תובנות הפונקציות של חלבונים מעורבים בהתקדמות או בעזרה שבעור לגלות מדכאי גידול חדשים. בנוסף, הזרקת תאי סרטן לעכברים עם גנוטיפים שונים עשויה לספק הבנה טובה יותר של חשיבותו של תא סטרומה. דגמים רבים עשויים להיות שימושיים כדי לחקור היבטים מסוימים של התקדמות מחלה אך לא לשחזר את התהליך הסרטני השלם. בניגוד לכך, תאי סרטן השד engraftment לכרית שומן החלב של עכברים טובים יותר מסכמת את המיקום של המחלה ונוכחות של תא סטרומה הנכון ומחקה לכן טוב יותר למחלות סרטניות אנושיות. במאמר זה, אנו מתארים כיצד להשתיל תאי סרטן השד בעכברי orthotopically ולהסביר כיצד לאסוף רקמות לנתח: -14 פיקסלים; קו-גובה:. 28px; "> סביבת גידול וגרורה לאיברים מרוחקים שימוש במודל זה, היבטים רבים (צמיחה, אנגיוגנזה, וגרורות) של הסרטן יכולים להיחקר פשוט על ידי מתן סביבה נאותה לתאים סרטניים לגדול.
Introduction
הסרטן הוא מחלה מורכבת מאוד שהייתה הנתונה ללימודים במשך מאות שנים. סרטן השד הוא סוג הסרטן הנפוץ ביותר; היא מתרחשת בעיקר אצל נשים, אך עשויים להתרחש גם באופן ספורדי בזכרים 27. המחלה בעיקר נגרמת על ידי האובדן של חלוקת תא שלטון מנגנון בקרה אשר בתורו מוביל לצמיחה אינסופית של תאים בגוף. יכולות להיגרם תקלות אלה על ידי מספר מנגנונים: ראשון, תאים בריאים צריכים אותות צמיחה מהתאים המקיפים על מנת להתרבות ואילו תאים סרטניים לעשות גורמי הגדילה שלהם ולהגדיל את הביטוי של קולטנים גורם גדילה וכך להשיג שיעור גבוה יותר שגשוג 1; שני, תאי הסרטן הם פחות רגישים לאותות אנטי-שגשוג 8; שלישי, כדי לאזן את המספר הסלולרי במוות של תאי גוף גם נדרש; עם זאת, תאים סרטניים להימלט ממוות מתוכנת של תאים, המכונים אפופטוזיס 14; רביעי, תאים לדבוק מטריצות תאיעל מנת לשרוד, אך תאים סרטניים יכולים לגדול ללא הצורך בהתקשרות ולהראות התנגדות לanoikis 19; חמישי, הפעלה של הטלומרז עוקפת את ההתקצרות הטלומרים ומונעת הזדקנות replicative 21; ואחרון אחרון חביב, דילוג של בקרת איכות DNA בעקבות תוצאות מיטוזה בתוכן גנטי שינה 15,16. על מנת לזהות אונקוגנים או מדכאי גידול שמשחקים תפקיד בהתפשטות הבלתי מווסתת זה, ניסויי צמיחת גידולים בעכברים הם קריטיים.
צמיחת גידול ראשונית היא בדרך כלל לא הסיבה העיקרית למוות. הגירה של תאים סרטניים מהאתר הראשי לאתר המשני, המכונה גרורות, הוא הגורם המוביל למוות ברוב חולי סרטן 22. גרורות הכרוכות פלישת תאים סרטנית, intravasation, נסיעה דרך מחזור הדם, הימנעות התקפה חיסונית, extravasation וצמיחה באתר המשני. אפיתל מעבר mesenchymal (EMT) הוא תהליך מפתח בגרורות וכרוכות מתג בפרופילי ביטוי גני מניב תאים עם תנועתיות והפולשנות גבוהות יותר, שהם דרישות קדם לתא הגרורות 12. ככל שהתהליך הסרטני היא התוצאה של שילוב של פעולות שונות, כוללים אינטראקציות הדדיות בין תאים סרטניים, תאי סטרומה ותאים פרו ואנטי דלקתיים, גישה במבחנה לסרטן לעתים קרובות אינה מספקת הבנה מלאה של התהליך הסרטני. בדומה לכך, לעתים קרובות יכולים להיות לא למדו טיפולים נגד הסרטן משפיעים על כלי הדם של גידול במבחנה, ובכך השימוש בin vivo הגישות הוא בלתי נמנע.
ללמוד התקדמות סרטן השד, שיטות ניסיוניות שונות פותחו. המודל הנפוץ ביותר הוא ההזרקה תת עורית של תאי סרטן השד בעכברים 5. בהגדרת ניסוי זה, החוקר יכול להציג מגוון רחב של שינויים בקו תא של בחירה במבחנה (כלומרupregulation, downregulation של חלבונים) ולהזריק את התאים מתחת לעור. למרות ששיטה זו היא פשוטה ותהליך ההזרקה הוא פשוט ללא כל צורך בביצוע ניתוח בעכברים, האתר שבו הגידול מוזרק אינו מייצג את הסביבה המקומית החלב גידול והיעדר הסביבה זו עלולה לגרום להתפתחות סרטן שד ש שונה מזה שנצפה בהפתולוגיה אנושית. שנית, עכברים מהונדסים גנטי נמצאים בשימוש לעתים קרובות ככלי in vivo ללמוד התקדמות סרטן השד. במודל זה, ביטוי אונקוגן (כלומר PyMT, Neu) הוא מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפי החלב מוביל להיווצרות של של גידול בשד ספונטני. התקנה ניסיונית זו שימושית כדי ללמוד את היבט טיפול במחלה על ידי הזרקת סמים או נוגדנים בעת בדיקת גודל גידול בזמן 3. עם זאת, גידול עכברים אלה עם זני עכבר אחרים חסרים או מוטציה בגן של עניין גם יכול לתת תוספותights לתוך התפקיד של חלבונים שונים בצמיחה של גידולי סרטן שד 24. החסרון של המודל הזה הוא שהוא נוטה וריאציה בגודל הגידול ומספר. יתר על כן, את רמת ביטוי transgene תלויה באתר האינטגרציה בגנום ויכולה להשתנות מזן עכבר אחד לעוד 4. במודל זה, הביטוי של transgene יכול להיות מושגת על ידי כל התאים אפיתל עם מקור ואילו במחלות של בני אדם, רק תת-אוכלוסייה של תאים לבטא אונקוגן או downregulate הרמות המדכאים גידול 26. ללמוד גרורות, תאי סרטן השד יכולים גם להיות מוזרקים לוריד (מודל מכונה גרורות ניסיוני) 25. עם זאת, גישה זו משחזרת רק את התהליך גרורתי באופן חלקי; עוקף את הדרישה לתאים סרטניים לפלוש וintravasate, ומתחיל מהנקודה שבה תאי גידול הם בקלות הווה במחזור הדם.
בעבודה שלנו, אנו משתמשים להזריק orthotopicמודל היון ללמוד את מעורבותם של הגנים של עניין בהתקדמות סרטן השד 13. אנו ביטוי היתר של החלבון בתאי סרטן השד אנושיים ולהזריק אותם לתוך כרית שומן החלב של NOD גמא SCID עכברים / (NSG). שיטה זו יש יתרון בדרכים רבות: היא מאפשרת שינויים גנטיים מהירים מאוד ומגוונים בשורת התאים המוזרקת, הוא מכסה את כל התהליך של התקדמות סרטן השד מצמיחת גידול ראשונית לגרורות באתרים רלוונטיים באופן פתולוגי, והוא גם מספק מודל ניסיוני טוב לבוחן את ההשפעה של טיפולים טיפוליים במחלה מוקדם או מאוחר שלבים. בנוסף, משתמש באחד מודל זה יכול לחקור את התפקיד של סטרומה לעומת חלבונים המופקים מתאים סרטניים בהתקדמות מחלה באמצעות עכברים או תאים מהונדסים גנטי. למרות זריקות תת עורית קלות יותר לביצוע, דגמי orthotopic להצמיח אוכלוסיית תאי הסרטן יותר tumorigenic וגרורתי יותר. לפיכך, תוצאות שהושגו באמצעות ההזרקה תת עוריתים יכול להיות גם שגוי שלילי או חיובי שגוי 6,17 עידוד השימוש במודלי orthotopic ללמוד את צמיחת הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC).
1. הכנת תאים, מכשירים ועכברים
- יום לפני המבצע, לגלח את NOD גמא SCID העכברים / (NSG) מהפטמה הרביעית לקו האמצע ולשקול את העכברים כדי לוודא שיש את כל העכברים משקולות שווים בקירוב.
- החיטוי מספריים, שתי פינצטה ושני מלקחיים ישר יתוש (איור 1 א).
- ביום הפעולה, לשטוף את אדנוקרצינומה השד האנושית (מד"א MB-231) תאים שניתן להזריק פעם אחת עם ופר פוספט (PBS), pH 7.4 וtrypsinize התאים. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר תקשורת DMEM סרום המכיל בחלק העליון של התאים. צנטריפוגה התאים ב1,200 סל"ד 7 דקות ב RT להסיר סרום על ידי resuspending התאים או בPBS או באמצעי תקשורת ללא סרום. צנטריפוגה אותם שוב כדי להסיר עקבות של סרום לחלוטין. Resuspend תאי PBS אותקשורת.
- ספירת התאים עם hemocytometer ולחשב את כמות התאים. השתמש 500,000 תאים / עכבר בלא יותר מ -150 μl. אופציונאלי לPBS או תקשורת, resuspend תאי matrigel.
הערה: קבע את כמות התאים בהתאם לסוג התא בשימוש. - מקום תאים בצינורות microcentrifuge סטרילי ולשמור אותם על קרח.
- מלא את אחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עם 35 מיליליטר של pH 7.4 PBS וצינור נוסף 50 מ"ל חרוטי צנטריפוגות עם אתנול 70%. משרים צמר גפן לתוך צינור אחד.
2. הזרקה Orthotopic
- לבצע את הניתוח בשכונת סטרילי כדי לשמור על אווירה סטרילית. להרדים את העכבר על ידי תת עורי הזרקת תערובת Xylazin / קטמין במינון של 10 מ"ג / קילוגרם, 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף בהתאמה. תקן את העכבר על כרית חימום. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.
הערה: אם אחד הוא לא מכיר היטב את ההליכים כירורגיים, ניתוח עשוי להימשך זמן רב יותר. לארגןההרדמה במינון בהתאם. - החל משחה עיניים על העיניים של עכברים, כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
- נקה את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול אתנול מוכן בשלב 1.6. לסירוגין סקראבס באמצעות בטאדין ואלכוהול שלוש פעמים בצורה מעגלית מסתובבת ממקום החתך המתוכנן צריכה להתבצע. לחלופין, להשתמש ionophore כחומר חיטוי.
- לעשות חתך קטן בין הפטמה הרביעית וקו האמצע עם מספריים ולעשות כיס על ידי החדרה מקלון צמר גפן טבולה בpH 7.4 PBS.
- השתמש בפינצטה כדי לחשוף את כרית שומן החלב. שים לב לכרית השומן על ידי הצבע הלבן שלה.
- לסחוט את כרית השומן עם פינצטה האחרות מבסיסו; בדרך זו, לחשוף באופן מלא את כרית השומן (איור 1) כדי לבצע זריקות בקלות.
- Homogenize תערובת התא על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה תא לתוך מזרק אינסולין להזריק לכרית שומן החלב על ידי החזקת המחט אופקית. לאשר זריקה מוצלחת על ידי בדיקה לנפיחות של כרית השומן.
- שחרר את כרית השומן בעדינות.
- תפר את החתך באמצעות נהג מחט. הפוך שלושה זורק על ידי סיבוב התפר סביב נהג המחט בכיוון השעון, נגד כיוון השעון וכיוון השעון. יש להשתמש בשני קשרים לתפר.
הערה: ודא שהקשרים הדוקים אחרת עכברים יכולים לפתוח את התפרים. - לאחר ניתוח, להזריק משכך כאבים, כגון temgesic ב0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, מתחת לעור כדי להקל על הכאב.
- אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם מרוויחים את ההכרה ולשמור על recumbence sternal. מניחים את כל החיות לכלובים שונים עד שהם התאוששו באופן מלא.
- כדי לשמור על סטריליות, להשתמש כלובים ומים autoclaved. לשנות את הכלובים כל שלושה ימים כדי לשמור על האווירה נקייה.
3. קצירת איברים לניתוח
- ביום של קציר, 8 שבועות לאחר ההשתלה של התאים, למלא צינורות צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר עם 3 מיליליטר הפתרון של Bouin לכל עכבר. בנוסף, משתמש בשני 15 מיליליטר צינורות מלאים ב5 מיליליטר פתרון פורמלין לכל עכבר.
- להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת Xylazin / קטמין, במינון של 10 מ"ג / קילוגרם 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף מתחת לעור. חכה עד שהחיה מאבדת את רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן.
- תקן את החיה עם מחטים על בסיס. ביצוע חתך ארוך, אנכי קו האמצע עם מספריים. לעשות שני חתכים אופקיים ממש מתחת לרגל הקדמית ומעל הרגל האחורית. לחשוף את הגידול על ידי מצמיד העור לבסיס. למדוד באמצעות קליפר נפח הגידול.
- לנתק את הגידול מהעור באמצעות מספריים. Snap להקפיא חלק מהגידול בחנקן נוזלי לבידוד RNA. מניחים את החלק השני, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי מלאים בפורמלין לבצע אימונוהיסטוכימיה הבאה הטבעת פרפין.
- מוציאים בעדינות את הריאות. הנח אתעזב את הריאות לפתרון של Bouin. שמור את הריאות בפתרון במשך 3 ימים. שימו לב מוקדים גרורתי שטחיים באופן ברור לעין בלתי מזוינת. לחלופין, למקם את הריאה הימנית לתוך פורמלין כדי לוודא micrometastasis באמצעות haematoxylin וeosin מכתים (H & E).
הערה: למרות ש, גרורות ריאות נצפו לעתים קרובות בסרטן השד, אפשר גם רוצה לאסוף עצם, כבד, מוח וטחול לנתח גרורות. התאים באזור גרורתי הם צפופים יותר ושונים מורפולוגית ולכן ניתן להבחין בקלות מרקמת ריאה. - יום לאחר קציר, לשאוב את פתרון פורמלין מ -15 מיליליטר צינורות ולהחליף עם 70% אתנול. להטביע רקמות פרפין ולבצע מחקרי אימונוהיסטוכימיה.
- לבדיקת דם, לפתוח את חלל החזה עם מספריים. למשוך 450 דם μl באמצעות לנקב לב. מניחים דגימת דם בצינור microcentrifuge המכיל 50 μl של 3.2% נתרן ציטרט. אחרי הדם נאסף, לסובב אותו XG ב 2000 עבור 10 מייליםn. אחסן את דגימות הפלזמה ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
הערה: קיימות מספר טכניקות איסוף דם אחרות נפוצה בתרגול 20 והטכניקה שצריכה להיות בשימוש תלויה בהגדרת ניסוי ובחירתו של המדען. אם דגימת דם אינה נדרשת, להרדימו על פי הפרוטוקול של בעלי החיים או על פי הנחיות המוסד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יישום מוצלח של "מודל סרטן שד orthotopic" מבוסס על הזרקה נכונה של תאים לתוך כרית שומן החלב. שגיאות ניסיוניות כגון חיסון מדויק של תאים או דליפה עלולות לגרום לשינויים בגודל גידול או אפילו העדר גידול שמוביל להיווצרות של מבנה מחפשים דומה לכרית שומן החלב מוזרקת עם חיץ שליטה (איור 2 א). שיעור הצמיחה של הגידול תלוי בטיבו של קו התא שהוחדר ובאופן כללי, ניתן לראות דרך העור של העכברים (איור 2). שלא כמו בניסויים במבחנה, שיעור הצמיחה של התאים הסרטניים לא יכול להיות קבוע בזמן in vivo (איור 2 ג). בשל חוסר חמצן וחוסר של חומרים מזינים, אזורי נימקי עלולים להיווצר ואזורים אלה ישפיעו על שיעור הצמיחה של הגידול (איור 2 ד). בנוסף, הגן של עניין עשוי להשפיע שלב מסויםהתקדמות הסרטן (מוקדם או מאוחר), ובכך ובהתאם להגדרות הניסיוניות, צמיחת גידול עלולה להתחיל מהר אבל להאט בסוף או להיפך.
יש להקפיד במהלך הליך הסרת הגידול; טיפול קפדני עשוי להשפיע על המבנה של הגידול וגורם לבעיות בניתוח immunohistochemical. סביב גידול האזור עשוי להציג כלי גדול הנובעים משיפוץ של כלי דם. כלים אלה לשחק תפקיד מכריע בהוצאת פסולת ולספק את רקמת גידול עם חומרי מזון וחמצן ובכך להקל על צמיחת גידול (איור 2). כינונה של neovessels (אנגיוגנזה) יכול להיחקר על ידי צביעת הגידול לסמני neovessel (כלומר CD31, CD34).
אוסף של הריאות בפתרון של Bouin עוזר לדמיין מוקדים שטחיים גרורתי על הריאות (איור 3 א). המוקדים ניתן להבחין בין רקמת ריאה באמצעות הצבע החיוורד הם קל לזיהוי 18. גרורות עלולות להתבטא במספר המוקדים נוצרו על פני השטח הריאה. עם זאת, יצירת מוקדים הוא תא קו תלוי; תאים שאינם אגרסיביים להצמיח micrometastasis בלבד או לא גרורות בכל. גרורות מיקרו ניתן לזהות בקלות עם כתמי haematoxylin / eosin ברקמת ריאה-מוטבע פרפין (איור 3 ג).
איור 1:. חומרים ושיטות () ציוד כירורגי הנדרש להזרקה של תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב תמונת נציג מראה את החשיפה של כרית שומן החלב (B)..
איור 2:. סקירה כללית של צמיחת גידולי שד orthotopic בעכברי שליטת Media (א) או
איור 3: גרורות לריאות גידול () ריאות של עכברים שהוזרקו orthotopically עם תאים סרטניים (מד"א MB-231).. דגירה של ריאות בפתרון של Bouin חושפת את המוקדים גרורתי על ריאות. ריאות (B) מעכברי שליטהשעבר הזרקת orthotopic של תקשורת שליטה. כפי שניתן לראות בבירור, ריאות שליטה אלה לא מראות גרורות מקרוסקופית. (ג) H & E מכתים מראה את האזור גרורתי ברקמת ריאה. הכנס מציג סקירה ההגדלה נמוכה של רקמת הריאה המכילה את המיקוד גרורתי. המלבן המקווקו השחור בהוספה מיוצג בלוח הגדול. תאי גידול מסומנים על ידי הקו המקווקו הלבן; שים לב לגרעינים גדולים יותר וצפופים יותר. (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר שחור, סרגל קנה מידה לבן = 20 מיקרומטר)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד היא מודל רב עוצמה כדי לחקור את כל ההיבטים של צמיחת הסרטן. השתלה של תאים אלה בכרית שומן החלב של העכברים צריכה להתבצע בזהירות על מנת למנוע שינוי בצמיחת גידול. והכי חשוב, הזרקה את אותה הכמות של תאים לכל עכבר היא קריטית. לשם כך, יש trypsinize התאים בקפדנות, מבלי להשפיע על כדאיות של התאים. תאים שאינם בר-קיימא צריכים להתעלם בספירת התאים וחומרים הכימיים (כלומר הכחול trypan) שיכול לעזור להבחין בין תאים מתים ובת-קיימא עשוי להיות שימושי לקביעת מספר תאי קיימא. היווצרות של גושים של תאים יש להימנע על ידי pipetting התאים למעלה ולמטה כמו היווצרות של גושי תאים לגרום לבעיות במהלך ספירת תאים וגורמת לחישוב מוטעה של מספר התא. היבט חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא את עוצמת הקול של התאים עצמם. כפי שתואר בסעיף פרוטוקול, התאשלהם pelleted כדי להשעות אותם בPBS או תקשורת. לפני הוספת PBS או תקשורת, את עוצמת הקול של התאים עשוי להיות מוערך על ידי השוואה גלולה עם צינורות מלאים בכרכים שונים של מדיה. כתוצאה מכך נפח התא עשוי להיות מופחתים נועד נפח התקשורת, על פי הנוסחא הבאה:
נפח התקשורת שצריך נפח שיתווסף = מחושב - נפח תא
ריאגנטים המשמשים בפרוטוקול עשוי להשפיע על התוצאות של הניסוי; לכן הפרוטוקול צריך להיות בהתאם בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמא, אם הניסוי שמטרתו להבהיר את התפקיד של חלבון קרום בהתקדמות גידול, trypsinization עלול לגרום לעיכול של חלבוני הקרום ולגרום לחפצים 9. אם זה דאגה, באמצעות פתרון EDTA שנאגרו או מגרד את התאים מהווה חלופה לנתק את התאים. כפי שצוין לעיל, תאים עשויים להיות מושעים בתקשורת, PBS או matrigel foהזרקת r. בין אלה, matrigel הוא אפשרות נוחה כmatrigel polymerizes בכרית השומן, ובכך לצמצם תאים דולפים החוצה של fatpad. בנוסף, engraftment בנוכחות matrigel עשויה לשפר את צמיחת גידול ואת הפוטנציאל גרורתי של שורות תאים מסוימות, כגון שורת תאי סרטן שד תאי מד"א-MB-435 2, A253 קרצינומה submandibular האנושית, קרצינומה epidermoid אדם Kb וB16F10 מלנומה בעכבר 7. שים לב שחלק מהכנות matrigel מכילים גורמי גדילה שעלולה להשפיע על תוצאות הניסוי. עם זאת, matrigel מדולדל גורם הגדילה זמין מהספקים שונים. בנוסף, matrigel פועל כתאי מטריקס (ECM) ומפעיל תת integrin. לכן, אם שאלת המחקר כרוכה בתפקיד של פונקצית integrin בצמיחת גידול, יש להשתמש באמצעי תקשורת או PBS כנשא לתאי סרטן השד.
בהגדרת הניסוי שלנו, אנו מזריקים תאי שד אנושי סרטן (מד"א MB-231) לכרית שומן החלב של עכברי NSG. השימוש בעכברי immunodeficient ללא ספק עושה את זה קשה יותר ללמוד את מעורבותם של גני immunoregulatory בהתפתחות הסרטן. עם זאת, חשוב לשים לב כי טכניקה זו יכולה לשמש גם בעכברים עם מערכת חיסונית שלמה אם יש לי התאים שצריך להיות מוזרקים מוצא עכבר 23. בנוסף, שורת תאי מד"א MB-231 היא שלילי קולטן אסטרוגן (ER-) ולכן, ההשפעה של הורמונים בהתפתחות סרטן השד חסרה. ובכל זאת, העבודה הקודמת שלנו הראתה שטכניקה זו היא גם ריאלי עבור ER + תאי סרטן השד כגון MCF-7 13. ניירות ניצול שיטה זו כדי ללמוד את צמיחת גידול של שורות תאי סרטן השד נפוצות מפורטים להלן:
ההליך עצמו מכיל כמה שלבים קריטיים גם כן. בניגוד לזריקות תת עורית, זריקות orthotopic כרוכות הליכים כירורגיים בעכברים. לפיכך, יש לנקות כלים כירורגיים היטב וautoclaved. ראוי לציין, השתלה של תאים אנושיים ברפידות שומן החלב דורשת השימוש בעכברי immunodeficient (למשל, NOD / SCID). לכן רצוי להתבצע זריקות בארון בטיחות ביולוגית, שימוש בכלים סטריליים. יתר על כן, במהלך ההזרקה, המחט צריכה להיות כל הזמן בזווית הנכונה עם פתיחת המחט תפנה כלפי מעלה. מחזיק את המחט בתנוחה זו מפחיתה את הדליפה ובאופן זה זריקה מוצלחת יכולה להיות מאומת על ידי התבוננות הנפיחות של כרית שומן החלב. בנוסף, בעת ביצוע ניתוח, חשוב לעשות חתך במרחק מה מכרית שומן החלב כדי למנוע הפרעה של תהליך ריפוי הפצע עם צמיחת גידול. עם זאת, החתך לא צריך להיעשות רחוק מדי מכרית שומן החלב או, כפי שחושף את כרית שומן החלב עלול להיות קשה.
בהמשך להליך, יש לבדוק את החיות באופן קבוע. עקב הניתוח והחשיפה לחומר ההרדמה, עכברים עלולים להיתקל אי נוחות משמעותית או אפילולמות. כך, בשבוע שלאחר ההליך הראשון הוא קריטי ועכברים צריכים להיות במעקב צמוד. בהתאם לקצב הצמיחה של התאים המושתלים, נפח גידול ניתן למדוד עד 4 פעמים בשבוע. יכולים גם להיות מתויגים תאים המוזרקים עם חלבון או לוציפראז ניאון, המאפשרים מעקב של תאי גידול ראשוניים וגרורתי, באמצעות מצלמה רגישה לאור. אף פעם לא צריכים להיות מותר גידולים להגיע גדלים גדולים מאוד ככיבים עלולים להתרחש נזק שרקמת הגידול. זה עשוי להקשות על ניתוחי immunohistochemical תקינים של רקמת הגידול. לאחר הגידול שנקטפו, אפשר לשקול קוצץ את הגידול וculturing תאי גידול המפוזרים ליצור שורת תאי סרטן השד חדשה לחקור הבדלים בין ההורים וmammay קווי כרית שומן עברו תא (MFP) 11.
לסיכום, השתלת סרטן שד orthotopic שתוארו במאמר זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את התהליכים הקשורים בסרטן. ca אחדn לתפעל את הגנום של התאים המוזרקים על ידי אחד upregulating או downregulating הגן של עניין ולבדוק את השפעתו על גידול ראשוני צמיחה, אנגיוגנזה או גרורות. גישה זו היא מועילה ללמוד פרוטו-אונקוגנים, supressors גידול או גנים שמעורבים בEMT. בנוסף, ניתן להזריק שורות תאים לעכברים מהונדסים גנטי כדי לבחון את ההשפעה של תא סטרומה בהתקדמות הסרטן. אנו ממליצים על השימוש בטכניקת הזרקת orthotopic על מודלים סרטן השד האמורים בשל הסיכום שלה הגבוה של תהליך pathophysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
