Summary
El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.
Abstract
El crecimiento del cáncer de mama puede ser estudiado en ratones utilizando una gran cantidad de modelos. La manipulación genética de las células de cáncer de mama puede ayudar a comprender las funciones de las proteínas implicadas en la progresión oncogénica o ayuda a descubrir nuevos supresores tumorales. Además, la inyección de células de cáncer en ratones con diferentes genotipos podría proporcionar una mejor comprensión de la importancia del compartimiento del estroma. Muchos modelos pueden ser útiles para investigar ciertos aspectos de la progresión de la enfermedad, pero no recapitular todo el proceso canceroso. En contraste, las células de cáncer de mama injerto a la almohadilla de grasa mamaria de ratones mejores recapitula la localización de la enfermedad y la presencia del compartimiento del estroma apropiada y por lo tanto mejor imita enfermedad cancerosa humana. En este artículo, describimos cómo implantar las células del cáncer de mama en ratones ortotópicamente y explicar cómo recolectar tejidos para analizar la: 14px; line-height:. 28px; "> medio del tumor y la metástasis a órganos distantes uso de este modelo, muchos aspectos (crecimiento, la angiogénesis y la metástasis) de cáncer pueden ser investigados simplemente proporcionando un ambiente adecuado para las células tumorales crezcan.
Introduction
El cáncer es una enfermedad muy compleja que ha sido objeto de estudios por más siglos. El cáncer de mama es el tipo de cáncer más común; se produce predominantemente en las mujeres, pero puede también ocurrir esporádicamente en los hombres 27. La enfermedad es causada principalmente por la pérdida de mecanismo de control de la división celular de gobierno que a su vez conduce a un crecimiento infinito de las células en el cuerpo. Estas disfunciones pueden ser causadas por varios mecanismos: primero, las células sanas necesitan señales de crecimiento de las células circundantes con el fin de proliferar mientras que las células de cáncer hacen sus propios factores de crecimiento y aumentan la expresión de los receptores del factor de crecimiento obteniendo así una tasa de proliferación superior 1; segundo, las células cancerosas son menos susceptibles a las señales anti-proliferativos 8; tercero, para equilibrar el número de células en también es necesaria la muerte de las células del cuerpo; Sin embargo, las células de cáncer de escape de la muerte celular programada, denominada apoptosis 14; cuarto, las células se adhieren a matrices extracelularescon el fin de sobrevivir, pero las células tumorales pueden crecer sin la necesidad de unión y muestran resistencia a la anoikis 19; quinto, la activación de la telomerasa evita el acortamiento de los telómeros y evita que la senescencia replicativa 21; por último pero no menos importante, la omisión del control de calidad del ADN tras los resultados de la mitosis en el contenido genético alterado 15,16. Con el fin de identificar los oncogenes o supresores tumorales que juegan un papel en esta proliferación desregulada, experimentos de crecimiento de tumor en ratones son cruciales.
El crecimiento primario del tumor generalmente no es la principal razón de la muerte. La migración de las células cancerosas desde el sitio primario a un sitio secundario, denominado metástasis, es la causa principal de muerte en la mayoría de los pacientes de cáncer 22. Metástasis implica invasión de células tumorales, intravasación, viajando a través de la circulación, evitando inmune ataque, la extravasación y el crecimiento en el sitio secundario. Epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso clave enmetástasis e implica un cambio en los perfiles de expresión génica produciendo células con mayor movilidad y capacidad de invasión, que son requisitos previos para la célula de metástasis 12. Como el proceso canceroso es la resultante de una combinación de diversas acciones, incluyendo las interacciones recíprocas entre las células cancerosas, las células del estroma y las células pro- y anti-inflamatorias, un enfoque in vitro de cáncer a menudo no proporciona completa información sobre el proceso canceroso. De manera similar, los tratamientos contra el cáncer que afectan a la vasculatura del tumor a menudo pueden no ser estudiados in vitro, por lo tanto el uso de enfoques in vivo es inevitable.
Para estudiar la progresión del cáncer de mama, se han desarrollado diferentes métodos experimentales. El modelo más ampliamente utilizado es la inyección subcutánea de células de cáncer de mama en ratones 5. En esta configuración experimental, el investigador puede introducir una amplia gama de alteraciones a una línea celular de elección in vitro (es decir,upregulation, regulación a la baja de las proteínas) e inyectar las células debajo de la piel. Aunque este método es sencillo y el proceso de inyección es simple, sin necesidad de realizar la cirugía en los ratones, el sitio en el que se inyecta el tumor no representa el ambiente del tumor mamario local y la ausencia de este entorno puede resultar en el desarrollo del cáncer de mama que se difiere de la observada en patología humana. En segundo lugar, los ratones genéticamente modificados se utilizan frecuentemente como una herramienta in vivo para estudiar la progresión del cáncer de mama. En este modelo, el oncogén (es decir PYMT, Neu) la expresión es conducida por un promotor específico de tejido mamario que conduce a la formación espontánea de s tumor de mama. Esta configuración experimental es útil para estudiar el aspecto de tratamiento de la enfermedad mediante la inyección de drogas o anticuerpos mientras comprueba el tamaño del tumor en el tiempo 3. Sin embargo, la cría de estos ratones con otras cepas de ratones deficientes o mutados en un gen de interés también podría dar insERECHOS en el papel de diferentes proteínas en el crecimiento del tumor de mama 24. La desventaja de este modelo es que es propenso a la variación en el tamaño del tumor y el número. Por otra parte, el nivel de expresión del transgen depende del sitio de integración en el genoma y se puede cambiar de una cepa de ratón a otro 4. En este modelo, la expresión del transgén se puede lograr por todas las células con origen epitelial mientras que en la enfermedad humana, sólo una subpoblación de células expresan el oncogén o regular a la baja los niveles supresores de tumores 26. Para estudiar la metástasis, las células del cáncer de mama también se pueden inyectar por vía intravenosa (un modelo denomina metástasis experimental) 25. Sin embargo, este enfoque sólo recapitula el proceso metastásico parcialmente; elude el requisito de las células tumorales para invadir y intravasate, y se inicia desde el punto en el que las células tumorales son fácilmente presente en la circulación.
En nuestro trabajo, utilizamos una inyección ortotópicoion modelo para estudiar la implicación de los genes de interés en la progresión del cáncer de mama 13. Nos sobreexpresan la proteína en las células del cáncer de mama humano e inyectarlos en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NOD / SCID gamma (NSG) ratones. Este método es ventajoso en muchos aspectos: permite cambios genéticos muy rápidos y diversos en la línea celular inyectada, que abarca todo el proceso de la progresión del cáncer de mama de crecimiento del tumor primario a la metástasis en los sitios patológicamente relevantes, y también proporciona un buen modelo experimental para estudiar el impacto de los tratamientos terapéuticos en etapas tempranas o tardías de la enfermedad. Además, el uso de este modelo se puede investigar el papel de las proteínas del estroma frente derivadas de células de cáncer en progresión de la enfermedad mediante el uso de ratones o células modificadas genéticamente. Aunque las inyecciones subcutáneas son más fáciles de realizar, modelos ortotópicos dan lugar a una población de células de cáncer más tumorigénico y más metastásico. Por lo tanto, los resultados obtenidos por medio de la inyección subcutáneas podría ser falsos negativos o falsos positivos 6,17 fomentar el uso de modelos ortotópico para estudiar el crecimiento del tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de bienestar de los animales, del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC).
1. Preparación de células, Instrumentos y Ratones
- Un día antes de la operación, se afeitan el / gamma SCID (NSG) ratones NOD a partir del cuarto pezón a la línea media y pesan los ratones para comprobar que todos los ratones tienen pesos más o menos comparables.
- Autoclave una tijera, dos pinzas y dos pinzas de mosquitos rectas (Figura 1A).
- En el día de la operación, lavar el adenocarcinoma de mama humano (MDA-MB-231) celdas que se inyecta una vez con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4 y trypsinize las células. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 10 ml que contiene suero DMEM los medios de comunicación en la parte superior de las células. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 7 min a TA para eliminar el suero resuspendiendo las células, ya sea en PBS o en medios sin suero. Centrifugar de nuevo para eliminar trazas de suero completo. Resuspender las células en PBS omedios de comunicación.
- Contar las células con un hemocitómetro y calcular la cantidad de células. Utilice 500.000 células / ratón en no más de 150 l. Facultativo de PBS o medio, resuspender las células en matrigel.
NOTA: Determinar la cantidad de células en función del tipo de célula utilizado. - Coloque las células en unos tubos de microcentrífuga estériles y mantenerlos en hielo.
- Llenar tubo de centrífuga cónico uno 50 ml con 35 ml de PBS pH 7,4 y otro tubo de centrífuga cónico de 50 ml con etanol al 70%. Remoje las esponjas de algodón en cada tubo.
2. Inyección ortotópico
- Realizar la cirugía en una campana estéril para mantener un ambiente estéril. Anestesiar el ratón por inyección subcutánea de la mezcla de xilazina / ketamina a una dosis de 10 mg / kg, 100 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Fijar el ratón sobre una almohadilla térmica. Confirme el éxito de la anestesia por la falta de reacción ante pizca dedo del pie.
NOTA: Si uno no está muy familiarizado con los procedimientos quirúrgicos, la cirugía puede tomar más tiempo. Arreglarlas dosis de anestesia en consecuencia. - Aplique un ungüento oftálmico en los ojos de ratones, para evitar que los ojos se sequen.
- Limpie el área afeitada utilizando el bastoncillo de algodón humedecido en etanol preparado en el paso 1.6. Alternando matorrales utilizando betadine y alcohol tres veces en forma circular que gira lejos del lugar de la incisión planificada debe ser realizada. Alternativamente, utilizar ionóforo como desinfectante.
- Hacer una pequeña incisión entre el cuarto pezón y la línea media con una tijera y hacer un bolsillo insertando el hisopo de algodón humedecido con PBS pH 7,4.
- Use una pinza para exponer la almohadilla de grasa mamaria. Observe la almohadilla de grasa por su color blanco.
- Apriete la almohadilla de grasa con la otra pinza de su base; al hacer esto, exponer completamente la almohadilla de grasa (Figura 1B) para realizar inyecciones fácilmente.
- Homogeneizar la mezcla de células pipeteando arriba y abajo. Se aspira suavemente 50 l de suspensión celular en una jeringa de insulina y inyectar enla almohadilla de grasa mamaria mediante la celebración de la aguja en posición horizontal. Confirme la inyección correcta comprobando si hay inflamación de la almohadilla de grasa.
- Suelte la almohadilla de grasa suavemente.
- Suturar la incisión utilizando un controlador de aguja. Hacer tres tiros girando la sutura alrededor del conductor de la aguja en sentido horario y anti-horario y hacia la derecha. Deben utilizarse dos nudos por sutura.
NOTA: Asegúrese de que los nudos están apretados de lo contrario los ratones pueden abrir las suturas. - Después de la cirugía, se inyecta un analgésico, tal como Temgesic en 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea con el fin de aliviar el dolor.
- No deje a los animales sin vigilancia hasta que adquieran conciencia y mantener decúbito esternal. Coloque todos los animales en diferentes jaulas hasta que estén completamente recuperados.
- Para mantener la esterilidad, utilizar jaulas autoclave y agua. Cambie las jaulas cada tres días para mantener el ambiente limpio.
3. Recolección de Órganos para el Análisis
- Aldía de la cosecha, 8 semanas después de la implantación de las células, llenar 15 ml tubos de centrífuga cónicos con 3 ml de solución de Bouin para cada ratón. Además, utilizar dos 15 ml tubos llenos con 5 ml de solución de formalina por ratón.
- Anestesiar a los animales mediante la inyección de xilazina / ketamina, a una dosis de 10 mg / kg 100 mg / kg de peso corporal por vía subcutánea. Espere hasta que el animal pierde toe retirada pizca reflejo.
- Fijar el animal con agujas sobre una base. Haga una larga incisión en la línea media vertical con tijeras. Haga dos incisiones horizontales justo debajo de la pata delantera y por encima de la pata trasera. Exponer el tumor fijando la piel a la base. Medir el volumen del tumor usando un calibrador.
- Disociar el tumor de la piel usando tijeras. Snap congelar una parte del tumor en nitrógeno líquido para el aislamiento de ARN. Coloque la otra parte, en el tubo de centrífuga cónico lleno de formol para realizar inmunohistoquímica tras la inclusión en parafina.
- Tomar suavemente los pulmones. Coloque elpulmón izquierdo en solución de Bouin. Mantenga el pulmón en solución durante 3 días. Observe focos metastásicos superficial claramente a simple vista. Opcionalmente, coloque el pulmón derecho en formalina para verificar micrometástasis mediante hematoxilina y eosina (H & E) tinción.
NOTA: Si bien, la metástasis pulmonar observado con frecuencia en el cáncer de mama, también puede ser que desee para recoger los huesos, el hígado, el cerebro y el bazo para analizar la metástasis. Las células en la zona metastásico son más densas y morfológicamente diferente y por lo tanto se pueden distinguir fácilmente de tejido pulmonar. - Un día después de la cosecha, aspirar la solución de formalina de tubos de 15 ml y reemplazar con etanol al 70%. Insertar los tejidos en parafina y realizar estudios de inmunohistoquímica.
- Para el análisis de sangre, abre la cavidad torácica con unas tijeras. Retirar 450 l de sangre por punción cardiaca. Coloque la muestra de sangre en un tubo de microcentrífuga que contiene 50 l de 3,2% de citrato de sodio. Después de recoger la sangre, girar a 2.000 xg durante 10 millasn. Almacenar las muestras de plasma a -20 ° C hasta su uso posterior.
NOTA: Hay varias otras técnicas de recogida de sangre de uso común en la práctica 20 y la técnica que se debe utilizar depende de la configuración experimental y elección del científico. Si no se requiere muestra de sangre, la eutanasia del animal de acuerdo con el protocolo de animal o de acuerdo con las directrices de la institución.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La aplicación exitosa del "modelo ortotópico de cáncer de mama" se basa en la inyección adecuada de las células en la almohadilla de grasa mamaria. Errores experimentales tales como la inoculación de las células imprecisa o fugas pueden conducir a variaciones en el tamaño del tumor o incluso la ausencia de un tumor que conduce a la formación de una estructura similar a la que mira una almohadilla de grasa mamaria inyectado con un tampón de control (Figura 2A). La tasa de crecimiento del tumor depende de la naturaleza de la línea celular inyectada y, en general, se puede observar a través de la piel de los ratones (Figura 2B). A diferencia de los experimentos in vitro, la tasa de crecimiento de las células tumorales puede no ser constante en el tiempo in vivo (Figura 2C). Debido a la hipoxia y la falta de nutrientes, las áreas necróticas se pueden formar y estas áreas afectará a la tasa de crecimiento del tumor (Figura 2D). Además, el gen de interés podría afectar a una cierta fasede la progresión del cáncer (temprano o tarde), en función de este modo en la configuración experimental, el crecimiento tumoral podría empezar rápido, pero más lento al final o viceversa.
Se debe tener cuidado durante el procedimiento de extracción del tumor; manejo riguroso puede afectar la estructura del tumor y conduce a problemas en el análisis inmunohistoquímico. El área alrededor del tumor puede mostrar grandes vasos que surgen de la remodelación vascular. Estos buques desempeñan un papel crucial en la eliminación de productos de desecho y suministran el tejido del tumor con nutrientes y oxígeno, facilitando así el crecimiento del tumor (Figura 2B). La formación de neovasos (angiogénesis) se puede investigar mediante la tinción del tumor para los marcadores de neovasos (es decir, CD31, CD34).
Colección de los pulmones en solución de Bouin ayuda a visualizar focos metastásicos superficial en los pulmones (Figura 3A). Los focos se puede distinguir de tejido pulmonar por medio del un color pálidod son fáciles de detectar 18. La metástasis se puede expresar como el número de focos formados en la superficie del pulmón. Sin embargo, la formación de focos es la línea que dependen de la célula; células no agresivos dan lugar a sólo micrometástasis o sin metástasis en absoluto. Micro metástasis puede ser fácilmente identificado con una tinción de hematoxilina / eosina en el tejido pulmonar embebido en parafina (Figura 3C).
Figura 1:. Materiales y Métodos (A) equipos quirúrgicos necesarios para la inyección de células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria (B) imagen representativa que muestra la exposición de almohadilla de grasa mamaria..
Figura 2:. Visión general del crecimiento del tumor de mama ortotópico en ratones de control de los medios de comunicación (A) o
Figura 3: Tumor metástasis a los pulmones (A) Los pulmones de los ratones que fueron inyectados ortotópicamente con células tumorales (MDA-MB-231).. La incubación de los pulmones en solución de Bouin expone la focos metastásicos en los pulmones. (B) Los pulmones de los ratones de controlque se sometieron a inyección ortotópico de los medios de control. Como puede verse claramente, estos pulmones de control no muestran metástasis macroscópicas. (C) H & E tinción muestra la región metastásica en el tejido pulmonar. El inserto muestra una visión general bajo aumento del tejido pulmonar que contiene el foco metastásico. El rectángulo discontinuo negro en el inserto está representado en el panel de gran tamaño. Las células tumorales se indican mediante la línea de trazos de color blanco; observar los núcleos más grandes y más densos. (Barra de escala = 100 micras Negro, barra de escala blanco = 20 micras)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inyección ortotópico de células de cáncer de mama es un poderoso modelo para estudiar todos los aspectos del crecimiento del cáncer. La implantación de estas células en la almohadilla de grasa mamaria de los ratones se debe realizar cuidadosamente para evitar la variación en el crecimiento del tumor. Lo más importante, la inyección de la misma cantidad de células a cada ratón es crucial. Para ello, se debe trypsinize las células rigurosamente sin afectar la viabilidad de las células. Las células no viables deben tomarse en consideración durante el recuento de células y los reactivos (es decir, azul de tripano) que puede ayudar a discriminar entre las células muertas y viables puede ser útil para determinar el número de células viables. La formación de grupos de células se debe evitar pipeteando las células arriba y abajo como la formación de grupos de células causan problemas durante el recuento de células y conduce a un error de cálculo del número de células. Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta es el volumen de las propias células. Como se describe en la sección de protocolo, células se sedimentan con el fin de suspender en PBS o medios de comunicación. Antes de la adición de PBS o medio, el volumen de las células se puede estimar comparando el pellet con tubos llenos con diferentes volúmenes de medios de comunicación. Posteriormente, el volumen de la celda puede ser restado del volumen de los medios destinados, de acuerdo con la siguiente fórmula:
Volumen de los medios de comunicación que necesita ser añadido = volumen calculado - volumen de la célula
Los reactivos que se utilizan en el protocolo pueden afectar el resultado del experimento; Por lo tanto, el protocolo debe ajustarse en consecuencia dependiendo de la pregunta de investigación. Por ejemplo, si el experimento tiene por objeto dilucidar el papel de una proteína de membrana en la progresión tumoral, tripsinización puede resultar en la digestión de la proteína de la membrana y causar artefactos 9. Si esto es una preocupación, usando la solución de EDTA tamponada o raspado de las células es una alternativa de separar las células. Como se mencionó anteriormente, las células pueden resuspendieron en medio, PBS o matrigel foinyección de r. Entre estos, matrigel es una opción conveniente como matrigel polimeriza en la almohadilla de grasa, minimizando así las células con fugas fuera de la fatpad. Además, el injerto en presencia de matrigel puede mejorar el crecimiento del tumor y el potencial metastásico de ciertas líneas celulares tales como la línea celular de cáncer de mama células MDA-MB-435 2, A253 carcinoma submandibular humano, carcinoma epidermoide humano kb y melanoma de ratón B16F10 7. Por favor note que algunas preparaciones matrigel contienen factores de crecimiento que potencialmente influyen en los resultados experimentales. Sin embargo, el crecimiento matrigel factor empobrecido está disponible de varios proveedores. Además, matrigel actúa como una matriz extracelular (ECM) y activa subconjuntos integrina. Por lo tanto, si la pregunta de investigación implica el papel de la función de la integrina en el crecimiento del tumor, se debe utilizar los medios de comunicación o PBS como un portador para las células de cáncer de mama.
En nuestra configuración experimental, inyectamos las células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231) enla almohadilla de grasa mamaria de ratones sin garantía soberana. El uso de ratones inmunodeficientes, obviamente, hace que sea más difícil para el estudio de la implicación de los genes inmunorreguladores en el desarrollo del cáncer. Sin embargo, es importante señalar que esta técnica puede ser también usado en los ratones con el sistema inmune intacto si las células que necesita ser inyectada tienen origen de ratón 23. Además, la línea celular MDA-MB-231 es del receptor de estrógeno negativo (ER-), por lo tanto, el impacto de las hormonas en el desarrollo del cáncer de mama no se encuentra. Sin embargo, nuestro trabajo anterior mostró que esta técnica también es factible para cáncer de mama ER +, tales como células MCF-7 13. Documentos que utilizan este método para estudiar el crecimiento tumoral de líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados se enumeran a continuación:
El procedimiento en sí contiene algunos pasos críticos también. A diferencia de las inyecciones subcutáneas, inyecciones ortotópico implican procedimientos quirúrgicos en los ratones. Por lo tanto, las herramientas quirúrgicas deben limpiarse bien y autoclave. Es de destacar que la implantación de las células humanas enalmohadillas de grasa mamaria requiere el uso de ratones inmunodeficientes (por ejemplo, NOD / SCID). Por lo tanto, las inyecciones deben llevarse a cabo preferiblemente en una cabina de seguridad biológica, la utilización de instrumentos estériles. Por otra parte, durante la inyección, la aguja debe mantenerse en el ángulo recto con la abertura de la aguja hacia arriba. Sosteniendo la aguja en esta posición reduce las fugas y de esta manera exitosa la inyección se puede verificar mediante la observación de la hinchazón de la almohadilla de grasa mamaria. Además, cuando se realiza la cirugía, es crucial para hacer una incisión a cierta distancia de la almohadilla de grasa mamaria con el fin de evitar la interferencia del proceso de cicatrización de la herida con el crecimiento tumoral. Sin embargo, la incisión no debe hacerse demasiado distante de la almohadilla de grasa mamaria o bien, como la exposición de la almohadilla de grasa mamaria puede ser difícil.
Después del procedimiento, los animales deben ser revisados regularmente. Debido a la cirugía y la exposición a la anestesia, los ratones pueden experimentar molestias considerables, o inclusomorir. Así, la primera semana después del procedimiento es crítica y ratones deben ser monitorizados cuidadosamente. Dependiendo de la tasa de crecimiento de las células implantadas, el volumen del tumor se puede medir hasta 4 veces a la semana. Las células inyectadas también se pueden etiquetar con una proteína fluorescente o luciferasa, lo que permite el seguimiento de las células de tumor primario y metastásico, usando una cámara sensible a la luz. Los tumores no se les debería permitir alcanzar tamaños extremadamente grandes como ulceraciones pueden ocurrir que el daño del tejido tumoral. Esto puede dificultar los análisis inmunohistoquímicos propias del tejido tumoral. Una vez que se cosecha el tumor, se podría considerar pelos en el tumor y el cultivo de las células tumorales dispersas para crear una nueva línea celular de cáncer de mama para investigar las diferencias entre los padres y mammay almohadilla grasa pasaron líneas (MFP) de células 11.
En conclusión, la implantación del cáncer de mama ortotópico que hemos descrito en este artículo es una herramienta muy útil para el estudio de los procesos relacionados con el cáncer. Una can manipular el genoma de las células inyectadas por cualquiera de upregulating o la regulación negativa del gen de interés y comprobar su efecto sobre el crecimiento del tumor primario, la angiogénesis o metástasis. Este enfoque es útil para estudiar los proto-oncogenes, supresores tumorales o genes que están involucrados en EMT. Además, las líneas celulares se pueden inyectar a ratones modificados genéticamente para examinar el efecto de compartimiento del estroma en la progresión del cáncer. Animamos encarecidamente el uso de la técnica de inyección sobre ortotópico modelos de cáncer de mama antes mencionados debido a su alto recapitulación del proceso fisiopatológico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
